HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KH A U N T T NGHIỆP T I PH N C AN P V NGHI N C U C I SINH HỌC G ỆNH DIEBACK TR N NHO S A PH NG VIỆT NA H N I – 2022 T HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KH A U N T T NGHIỆP T I PH N C AN P V NGHI N C U C I SINH HỌC G ỆNH DIEBACK TR N NHO S A PH S NG VIỆT NA T MSV H : 637318 : K63CNSHD Gả g g : ThS Ng H N I – 2022 T H T ỜI CA OAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm gây bệnh dieback nho m t s đ a phương Việt Nam” cơng trình nghiên cứu cá nhân thời gian qua Mọi s liệu, hình ảnh, kết nghiên cứu tơi tự tìm hiểu, phân tích m t cách khách quan, trung thực, có nguồn g c rõ ràng chưa cơng b hình thức Mọi giúp đỡ cho việc thực đề tài cảm ơn thơng tin trích dẫn đề tài ghi nguồn g c rõ ràng Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022 Sinh viên T H i ỜI C N Sau m t thời gian thực tập B môn Công nghệ vi sinh (từ tháng 3/2022 đến tháng 9/2022), quan tâm, dìu dắt tận tình thầy giáo, cán b phịng thí nghiệm B mơn, c gắng nỗ lực thân, tơi hồn thành khóa luận t t nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo ngồi khoa Cơng nghệ Sinh học truyền đạt cho nh ng kiến thức vô quan trọng, qu báu su t thời gian học tập r n luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tơi xin bày t lịng biết ơn sâu sắc tới cô ThS Nguy n Thanh Huyền đ nh hướng đề tài, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, đ ng viên tơi q trình thực đề tài hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô ThS Trần Th ào, toàn thể anh ch , bạn bè em thực tập, nghiên cứu phịng thí nghiệm B mơn Cơng nghệ Vi sinh giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi su t q trình làm đề tài t t nghiệp Cu i cùng, với tất lòng thành kính biết ơn vơ hạn, tơi xin gửi lời cảm ơn đến b mẹ, người sinh thành, nuôi nấng, đ ng viên tạo đ ng lực cho tơi su t q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022 Sinh viên T H ii C C LỜI CAM OAN i LỜI C M N ii M C L C iii DANH M C B NG v DANH M C H NH vi DANH M C CH VI T T T vii T M T T KH A LU N viii PH N I U 1.1 ặt vấn đề 1.2 M c đích nghiên cứu 1.3 N i dung nghiên cứu PH N II T NG QUAN T I IỆU 2.1 Giới thiệu chung nho 2.1.1 Phân b 2.1.2 Mơ tả đặc điểm hình thái nho 2.1.3 Thành phần dinh dưỡng công d ng nho 2.2.2 Nấm bệnh nho 2.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 10 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 10 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 11 PH N III V T IỆU V PH NG PH P NGHI N C U 13 3.1 i tượng nghiên cứu 13 3.2 Vật liệu nghiên cứu 13 3.3 a điểm thời gian nghiên cứu 13 3.4 D ng c , thiết b hóa chất thí nghiệm 13 3.5 Phương pháp nghiên cứu 14 3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu nho nhi m bệnh 14 iii 3.5.2 Phân lập nấm gây bệnh từ mẫu nho b bệnh 15 3.5.4 Phương pháp xác đ nh đặc điểm hình thái nấm 15 3.5.5 ánh giá ảnh hưởng m t s yếu t đến khả n ng sinh trưởng nấm (môi trường nuôi cấy, nhiệt đ , pH) 16 3.5.6 ánh giá khả n ng sinh enzyme ngoại bào 17 3.5.7 Phương pháp đ nh danh chủng nấm gây bệnh 17 PH N IV K T QU V TH O U N 20 4.1 Kết phân lập nấm gây bệnh 20 4.2 Kết tái lây nhi m chủng nấm phân lập 21 4.3 ặc điểm hình thái chủng nấm tuyển chọn 23 4.4 Kết ảnh hưởng m t s điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng chủng nấm tuyển chọn 25 4.4.1 Kết ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng chủng nấm tuyển chọn 25 4.4.2 Kết ảnh hưởng nhiệt đ nuôi cấy đến sinh trưởng chủng nấm tuyển chọn 27 4.4.3 Kết ảnh hưởng đ pH đến sinh trưởng chủng nấm tuyển chọn 29 4.5 ánh giá khả n ng sinh enzyme ngoại bào chủng nấm tuyển chọn 30 4.6 Kết tách chiết DNA đ nh danh chủng nấm gây bệnh 32 4.6.1 Tách chiết DNA t ng s khuếch đại trình tự DNA b ng phản ứng PCR 32 4.6.2 nh danh phân tích b ng phương pháp giải trình tự đoạn gen ITS rDNA 33 PH N V K T U N V NGH 35 5.1 Kết luận 35 5.2 ề ngh 35 TÀI LIỆU THA PH KH O 36 C 41 iv ANH C NG Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 4.1 ặc điểm khu n lạc chủng nấm phân lập 21 Bảng 4.2 ường kính hình thái khu n lạc chủng nấm CK1 môi trường khác sau ngày nuôi cấy 26 Bảng 4.3 Khả n ng sinh enzyme bào chủng nấm CK1 30 v ANH C H NH Hình 2.1 Hình ảnh nho Hình 2.2 Hình ảnh triệu chứng bệnh dieback nho 10 Hình 4.1 Các mẫu nho nhi m bệnh dieback 20 Hình 4.2 Hình ảnh chủng nấm phân lập từ mẫu nho nhi m bệnh 21 Hình 4.3 Hình ảnh tái lây nhi m chủng nấm phân lập sau ngày 22 Hình 4.4 ặc điểm hình thái chủng nấm CK1 24 Hình 4.5 Sự phát triển chủng nấm CK1 môi trường khác sau ngày nuôi cấy 26 Hình 4.6 Sự phát triển chủng nấm CK1 nhiệt đ khác sau ngày nuôi cấy 28 Hình 4.7 Sự phát triển chủng nấm CK1 pH khác sau ngày nuôi cấy 29 Hình 4.8 Khả n ng sinh enzyme ngoại bào chủng nấm CK1 31 Hình 4.9 PCR chủng nấm CK1 gel agarose Hình 4.10 So sánh trình tự nucleotide chủng nấm CK1 GenBank 33 Hình 4.11 Cây phân loại dựa trình tự 18S rRNA chủng nấm CK1 33 32 vi ANH C ữ C CH VI T T T ế ắ T µl microliter µm Micrometer C đầ đủ i chứng CDA Czapek Dox Agar PDA Potato Dextrose Agar SDA Sabouraud Dextrose Agar ISP2 International Streptomyces Project WA Water Agar MEA Malt Extract Agar CMC Carboxymethyl cellulose PCR Polymerase Chain Reaction ITS Internal Trascription Spacer regions cs C ng sp species vii T T T KH A U N Nghiên cứu thực với m c đích phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm gây bệnh dieback nho m t s đ a phương Việt Nam Các chủng nấm phân lập từ mẫu nho có triệu chứng bệnh dieback, sau tái lây nhi m lên lá, cành nho kh e mạnh để xác đ nh chủng nấm có khả n ng gây bệnh dieback nho Chủng nấm bệnh tuyển chọn tiếp t c nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học điều kiện ảnh hưởng đến phát triển nấm Chủng nấm sau đ nh danh b ng phương pháp phân tử Từ mẫu nho có triệu chứng bệnh dieback thu thập Viện nghiên cứu phát triển trồng Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà N i vườn nho Thanh ặng - Minh Hải - V n Lâm - Hưng Yên, phân lập chủng nấm (CK1, CK2 N) Chủng nấm CK1, CK2 khu n lạc dạng sợi mảnh, x p màu sắc khu n lạc từ trắng chuyển dần sang đen Chủng nấm N khu n lạc dạng sợi, m n, màu sắc khu n lạc chuyển dần từ trắng sang xám; tản nấm hình trịn, đường kính tản nấm t ng dần theo ngày Các chủng thực tái lây nhi m cành, nho Kết cho thấy, ch có chủng nấm CK1 CK2 khiến cho thân, nho có nh ng triệu chứng bệnh dieback; cành có triệu chứng bệnh rõ Hơn n a chủng nấm có nh ng đặc điểm hình thái khu n lạc gi ng với nấm Lasiodiplodia theobromae Vì chủng nấm CK1 CK2 có đặc điểm hình thái tái lây nhi m gi ng nên chọn chủng nấm (CK1) cho thí nghiệm tiếp Dựa kết khảo sát điều kiện nuôi cấy, cho thấy, chủng nấm CK1 phát triển t t môi trường PDA, nhiệt đ 30 - 35⁰C, pH - ồng thời chủng nấm thể khả n ng sinh enzyme amylase, protease, cellulase, chitinase, xylanase pectinase Qua phương pháp đ nh danh phân tử với cặp mồi ITS1/ITS4, chủng nấm CK1 xác đ nh Lasiodiplodia theobromae so sánh trình tự nucleotide với đoạn gen 18S rRNA sở d liệu NCBI viii Amylase C Chitinase C H K ả g C Pectinase C Cellulase C Protease C Xylanase z g ủ ủ g CK1 Chủng nấm CK1 có khả n ng sinh enzyme amylase, protease, cellulase, chitinase, xylanase pectinase Tương tự vậy, nghiên cứu Carina Félix cs (2018) cho biết nấm L theobromae có khả n ng sinh enzyme 31 amylase, gelatinase, caseinase, cellulase, lipase, laccase, xylanase, pectinase and pectin liase (Carina Félix cs., 2018) Trong nghiên cứu Marcos Paolinelli-Alfonso cs (2016) nấm L theobromae có khả n ng sinh enzyme amylases, pectinase cellulase (Marcos Paolinelli-Alfonso cs., 2016) Kế ả ế NA đ ủ g g ự PCR DNA t ng s chủng nấm CK1 tách chiết theo phương pháp (Masoomi-Aladizgeh cs., 2019), sau điện di gel agarose 45 phút điện 80V µl DNA tr n với µl loading dye để kiểm tra đ tinh tính nguyên vẹn DNA DNA chủng nấm CK1 sau tách chiết sử d ng cho phản ứng PCR khuếch đại trình tự gen ITS b ng cặp mồi ITS1 ITS4 Marker H 4.9 Kế ảđ CK1 ả Blank PCR gel agarose 1% 32 Nhìn chung, kết chạy điện di cho sản ph m PCR chủng nấm CK1 với cặp mồi ITS1 ITS4 cho kết t t, có b ng vạch rõ nét với kích thước khoảng 650 bp í 4.6.2 ự ITS rDNA Sản ph m PCR chủng nấm CK1 gửi đến cơng ty First Base (Singapore) để giải trình tự gen Sau trình tự phân tích đ i chiếu d liệu với trình tự đoạn 18S rRNA b ng cơng c Blast NCBI Hình 4.10 S Hình 4.11 C ủ g CK1 GenBank S RNA ủ ủ g CK1 33 C n vào phân loại (hình 4.11), thấy chủng nấm CK1 nhánh với chủng Lasiodiplodia theobromae isolate COKSDLt1với giá tr tin cậy bootstrap 97%, bên cạnh so với mức đ tương đồng c n trình tự nucleotide cho kết quả tương đồng 99,80% iều khẳng đ nh kết có đ tin cậy cao Vì vậy, kết luận r ng chủng nấm CK1 có quan hệ gần gũi với chủng L theobromae đặt tên Lasiodiplodia theobromae COKSDLt1 CK1 Kết phù hợp với kết luận nghiên cứu E Rodríguez-Gálvez cs (2015); Al-Saadoon cs (2012) L theobromae gây bệnh dieback nho Do đó, chủng nấm CK1 phân lập từ nho có triệu chứng bệnh dieback xác đ nh Lasiodiplodia theobromae 34 PH N V K T U N V NGH Kế Từ mẫu nho có triệu chứng bệnh dieback thu thập Hưng Yên Hà N i phân lập chủng nấm (CK1, CK2 N) có chủng CK1 CK2 gây triệu chứng bệnh dieback thực tái lây nhi m Hai chủng nấm có đặc điểm hình thái gi ng với nấm L theobromae Chủng nấm (CK1) chọn cho nghiên cứu tiếp Chủng nấm CK1 phát triển t t môi trường PDA, nhiệt đ 30 35oC, pH - ồng thời chủng nấm thể khả n ng sinh enzyme amylase, protease, cellulase, chitinase, xylanase pectinase Qua phương pháp đ nh danh phân tử với cặp mồi ITS1/ITS4, chủng nấm CK1 xác đ nh Lasiodiplodia theobromae so sánh trình tự nucleotide với đoạn gen 18S rRNA sở d liệu NCBI Chủng nấm gây bệnh dieback xác đ nh L theobromae g Tiếp t c nghiên cứu chủng nấm gây bệnh dieback để tìm chế gây bệnh, tìm biện pháp phòng trừ bệnh hiệu nho đ i tượng khác 35 T I IỆU THA T KH O ế g Bạch Dương (2021) Ăn nho s ng thọ hơn, b mắt ch ng lão hóa da S Y t Tỉnh Nam nh Truy cập ngày 28/08/2022 từ https://soyte.namdinh.gov.vn/home/hoat-dongnganh/giao-duc-suc-khoe/an-nho-song-tho-hon-bo-mat-chong-lao-hoa-da-3845 Gà Con (2019) Giới thiệu nho Cây tr ng vật nu i ng hành nông dân Vi t Truy cập ngày 28/08/2022 từ https://caytrongvatnuoi.com/cay-trong/cay-anqua/gioi-thieu-ve-cay-nho/# Gà Con (2019) Nghề trồng nho giới Việt Nam Cây tr ng vật nu i hành nông dân Vi t Truy cập ngày ng 28/08/2022 từ https://caytrongvatnuoi.com/cay-trong/cay-an-qua/nghe-trong-nho-tren-the-gioi-va-oviet-nam/ Khuyết danh M t s bệnh thường gặp Nho Trung tâm Thông tin, th ng kê KH&CN thành ph H i Phòng Truy cập ngày 28/08/2022 từ http://hpstic.vn:96/tinchi-tiet/Mot-so-benh-thuong-gap-o-cay-Nho-3129.html Lê Thanh Tùng (2008) Cây nho Tr ng tin i n t Liên hi p Hội Khoa h c Kỹ thuật Vi t Nam Truy cập ngày 28/08/2022 từ https://vusta.vn/cay-nho-p75710.html Phạm Th Ngọc Lan (2012) Giáo trình thực tập vi sinh vật học: Nhà xuất ại học Huế Nguy n Lân Dũng, Nguy n ình Quyến, Phạm V n Ty (2009) Giáo trình vi sinh vật học, NXB Giáo D c, 713 tr T ếng anh Aniruddha Saha, Parimal Mandal, Shy Dasgupta, Dipanwita Saha (2008) Influence of culture media and environmental factors on mycelial growth and sporulation of Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon and Maubl T p sin m i tr ng, 29(3), 7-10 Alves, A., Crous, P.W., Correia, A & Phillips, A.J.L (2008) Morphological and molecular data reveal cryptic species in Lasiodiplodia theobromae Fungal Diversity, 28, 7-10 Alfonzo, A., Conigliaro, G., Torta, L., Burruano, S., & Moschetti, G (2009) Antagonism of the endophytic Bacillus subtilis strain AG1 to fungal pathogens that 36 cause tracheomycotic deterioration of vine wood Phytopathologia Mediterranea, 48(1), 186-187 Abdullah H Al-Saadoon, Mohanad K M Ameen, Muhammed A Hameed, Adnan Al-Badran & Zulfiqar Ali (2012) First report of grapevine dieback caused by Lasiodiplodia theobromae and Neoscytalidium in Basrah, Southern Iraq T p chí Cơng ngh Sinh h c Châu Phi, 11(95), 16165-16170 Amponsah, N T., Jones, E., Ridgway, H J., & Jaspers, M V (2012) Evaluation of fungicides for the management of Botryosphaeria dieback diseases of grapevines Pest Management Science, 68(5), 676-683 Correia, K C., Câmara, M P S., Barbosa, M A G., Sales Jr., R., Agustí-Brisach, C., Gramaje, D., Michereff, S J (2013) Fungal trunk pathogens associated with table grape decline in Northeastern Brazil Phytopathologia Mediterranea, 52(2), 380-387 Correia, K C., Silva, M A., Morais Jr., M A., Armengol, J., Phillips, A J L., Câmara, M P S., & Michereff, S J (2015) Phylogeny, distribution and pathogenicity of Lasiodiplodia species associated with dieback of table grape in the main Brazilian exporting region Plant Pathology, 65(1), 92-103 Carina Félix, Ana Domingues, António S Duarte, Rui C.M Vitorino, Correia, Artur Ana Alves C.L.Guerreiro, & Ana C Pedro Esteves (2016) Temperature Modulates the Secretome of the Phytopathogenic Fungus Lasiodiplodia theobromae Frontiers in Plant Science, 7(01096), 2-5 Carina Félix, Sofia Libório, Mariana Nunes, Rafael Félix, Ana S Duarte, Artur Alves, and Ana C Esteves (2018) Lasiodiplodia theobromae as a Producer of Biotechnologically Relevant Enzymes International Journal of Molecular, 19(2), 29 10 Carina Félix, Rodrigo Silva Meneses, Micael F M Gonỗalves, Laurentijn Tilleman, Ana S Duarte, Jesus V Jorrín-Novo, Yves Van de Peer, Dieter Deforce, Filip Van Nieuwerburgh, Ana C Esteves & Artur Alves (2019) A multi-omics analysis of the grapevine pathogen Lasiodiplodia theobromae reveals that temperature affects the expression of virulence-and pathogenicity-related genes Scientific Reports, 9, 13144 11 Carine Rusin, Fábio Rossi Cavalcanti, Patrícia Carla Giloni de Lima, Cacilda Márcia Duarte Rios Faria, Marcus André Kurtz Almanỗa & Renato Vasconcelos BoteBot 37 (2020) Control of the fungi Lasiodiplodia theobromae, the causal agent of dieback, in cv syrah grapevines Acta Scientiarum Agronomy, 43, 1-6 12 Díaz, G A., & Latorre, B A (2013) Efficacy of paste and liquid fungicide formulations to protect pruning wounds against pathogens associated with grapevine trunk diseases in Chile Crop Protection, 46, 106-112 13 E Rodríguez-Gálvez, E Maldonado, A Alves (2015) Identification and pathogenicity of Lasiodiplodia theobromae causing dieback of table grapes in Peru T p chí B nh h c Thực vật Châu Âu, 141(3), 477-489 14 FAO (2014) “faostat” Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy Web http:// www.fao.org/faostat/en/#data/QC 15 Gramaje, D., & Armengol, J (2011) Fungal trunk pathogens in the grapevine propagation process: potential inoculum sources, detection, identification, and management strategies Plant Disease, 95(9), 1040-1055 16 Halleen, F., Fourie, P., & Lombard, P (2010) Protection of grapevine pruning wounds against Eutypa lata by biological and chemical methods South African Journal for Enology & Viticulture, 31(2), 125-132 17 José Ramón rbez-Tores (2011) The status of Botryosphaeriaceae species infecting grapevines Phytopathologia Mediterranea, 50 (Supplement), S15 18 Jiye Yan cs (2013) Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China Fungal Diversity, 61, 221-230 19 Kim, J.H., Kim, S.C., Cheong, S.S., Choi, K.H., Kim, D.Y., Shim, H.S & Lee, W.H (2013) Stem rot of sweet potato (Ipomoea batatas) caused by Sclerotium rolfsii in Korea Research in Plant Disease, 19(2), 118-120 20 K Kris Hirst (2018) Vitis vinifera: Origins of the Domesticated Grapevine Retrieved from: https://www.thoughtco.com/origins-of-the-domesticated-grape- 169378 21 Larignon, P., & Dubos, B (2001) The villainy of black dead arm Wines Vines, 82(1), 86-89 22 Mutawila, C., Fourie, P., Halleen, F., & Mostert, L (2011) Grapevine cultivar variation to pruning wound protection by Trichoderma species against trunk pathogens Phytopathologia Mediterranea, 50(4), 264-276 DOI: 10.14601/Phytopathol_Mediterr-8981 38 23 Mutawila, C., Halleen, F., & Mostert, L (2016) Optimisation of time of application of Trichoderma biocontrol agents for protection of grapevine pruning wounds Australian Journal of Grape and Wine Research, 22(2), 279-287 24 Marcos Paolinelli-Alfonso, José Manuel Villalobos-Escobedo, Philippe Rolshausen, Alfredo Herrera-Estrella, Clara Galindo-Sánchez, José Fabricio LópezHernández & Rufina Hernandez-Martinez (2016) Global transcriptional analysis suggests Lasiodiplodia theobromae pathogenicity factors involved in modulation of grapevine defensive response BMC Genamics, 17(615) 25 Masoomi-Aladizgeh, F., Jabbari, L., Nekouei, R K., & Aalami, A (2016) A Simple and Rapid System for DNA and RNA Isolation from Diverse Plants Using Handmade Kit Protocol Exchange Retrieved from: https://doi.org/10.21203/rs.2.1347/v2 26 P Latha , V Prakasam , EI Jonathan , R Samiyappan , C Natarajan (2013) Effect of culture media and environmental factors on mycelial growth and pycnidial production of Lasiodiplodia theobromae in physic nut (Jatropha curcas) T p tr sin m i ng, 34(4), 683-7 27 Paul, N.C., Park, S., Liu, H., Lee, J.G., Han, G.H., Kim, H & Sang, H (2021) Fungi Associated with Postharvest Diseases of Sweet Potato Storage Roots and In Vitro Antagonistic Assay of Trichoderma harzianum against the Diseases Journal of Fungi, 7(11), 927 28 Rossetto, M., et al (2002) "Evaluating the potential of SSR flanking regions for examining taxonomic relationships in the Vitaceae." Theoretical and Applied Genetics, 104(1), 61-66 29 Rolshausen, P E., Úrbez-Torres, J R., Rooney-Latham, S., Eskalen, A., Smith, R J., & Gubler, W D (2010) Evaluation of pruning wound susceptibility and protection against fungi associated with grapevine trunk diseases American Journal of Enology and Viticulture, 61(1), 113-119 30 Ruvishika Shehali Jayawardena, Sajeewa Maharachchikumbura, Wei Zhang (2016) "Neopestalotiopsis vitis sp nov causing grapevine leaf spot in China." Phytotaxa, 258(1), 63-74 31 Sefc, K M cs (2003) Evaluation of the genetic contribution of local wild vines to European grapevine cultivars American Journal of Enology and Viticulture 54(1), 15-21 39 32 Sosnowski, M R., Loschiavo, A P., Wicks, T J., & Scott, E S (2013) Evaluating treatments and spray application for the protection of grapevine pruning wounds from infection by Eutypa lata Plant Disease, 97(12), 1599-1604 33 This, P cs (2004) Development of a common set of standard varieties and standardized method of scoring microsatellites markers for the analysis of grapevine genetic resources Theoretical and Applied Genetics 109, 1448-1458 34 Úrbez‐ Torres, J R., & Gubler, W (2009) Pathogenicity of Botryosphaeriaceae species isolated from grapevine cankers in California Plant Disease, 93(6), 584-592 35 Úrbez‐ Torres, J R (2011) The status of Botryosphaeriaceae species infecting grapevines Phytopathologia Mediterranea, 50(4), 5-45 36 Wojciech Granoszewski, Malgorzata Nita, Dorota Nalepka (2004) Vitis vinifera L subsp sylvestris (C.C Gmelin) Hegi - Wild grape-vine https://www.researchgate.net/publication/286763065_Vitis_vinifera_L_subsp_sylvestr is_CC_Gmelin_Hegi_-_Wild_grape-vine 37 Weber, E A., Trouillas, F P., & Gubler, W D (2007) Double pruning of grapevines: a cultural practice to reduce infections by Eutypa lata American Journal of Enology and Viticulture, 58(1), 61-66 40 PH C Ph l c Hình ảnh tái lây nhi m chủng nấm CK1 CK2 cành, nho ngày CK1 CK2 CK1 CK2 CK1 CK2 41 Ph l c Hình ảnh tái lây nhi m chủng nấm CK1 CK2 cành, nho 10 ngày CK1 CK2 CK1 CK1 CK2 CK2 42 Ph l c Hình ảnh phát triển chủng nấm CK1 nhiệt đ khác sau ngày 15⁰ C 10⁰ C 20⁰ C 25⁰ C 30⁰ C 35⁰ C 40⁰ C 43 Ph l c Hình ảnh phát triển chủng nấm CK1 pH khác sau 10 ngày 44 Ph l c Trình tự nucleotide vùng gen ITS chủng nấm CK1 >CK1 GNNCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTGAGAAAGTTCAGAAGGTTCG TCCGGCGGGCGACGCCAACCGCTCCAAAGCGAGGTGTATTCTACTAC GCTTGAGGGCTGAACAGCCACCGCCGAGGTCTTTGAGGCGCGTCCGC AGTGAGGACGGTGCCCAATTCCAAGCAGAGCTTGAGGGTTGTAATGA CGCTCGAACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGC GTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTAT CGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTT GTTGAAAGTTTTAGTTTATTAACTTGTTTATCAGACGTCTGCGTTTAC TGACTGGAGTTTGAAGGTCCTTTGGCGGCCGGAGCCGCCAAAGCAAC AGAGGTACGTTCACAAAGGGTGGGAGAGTCGAGCCGGAGCTCGAAA ACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAGGTTCATTAC CGAGTTTTCGAGCGCC 45