HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MEN SACCHAROMYCES BOULARDII TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC HÀ NỘI – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MEN SACCHAROMYCES BOULARDII TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC Sinh viên thực : Trƣơng Thị Ngọc Ánh Mã sinh viên : 637306 Lớp : K63CNSHD Giảng viên hƣớng dẫn : ThS Nguyễn Quốc Trung HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khố luận đƣợc thực hồn thành nỗ lực thân dƣới dìu dắt, hỗ trợ nhiệt tình ThS Nguyễn Quốc Trung – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Tơi xin cam đoan số liệu, hình ảnh kết báo cáo trung thực, khách quan chƣa đƣợc công bố cơng trình khoa học Tất giúp đỡ, ủng hộ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp đƣợc cảm ơn thông tin trích dẫn, tài liệu tham khảo đƣợc ghi rõ nguồn gốc danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trƣớc hội đồng nhà trƣờng Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Trƣơng Thị Ngọc Ánh i LỜI CẢM ƠN Khoá luận đƣợc hồn thành khơng cố gắng thân mà cịn nhận đƣợc vơ vàn tình cảm, giúp đỡ, động viên Thầy Cô, bạn bè Lời đầu tiên, cho phép đƣợc gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, phòng ban Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Công nghệ Sinh học, Bộ môn Sinh Phân tử Công nghệ Sinh học ứng dụng, thầy tận tình giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Bằng tình cảm chân thành, tơi muốn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giảng viên ThS Nguyễn Quốc Trung – ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, vun đắp cho niềm tin, hy vọng đồng thời truyền cảm hứng, động lực để tơi thực khố luận cách thuận lợi nhất, đặc biệt giúp trƣởng thành hơn, trang bị cho nhiều hành trang để chuẩn bị bƣớc vào đời Cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vơ hạn, tơi muốn gửi lời cảm ơn đến bố mẹ, ngƣời thân tơi tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Trong trình thực hiện, thân tơi dành nhiều cố gắng để hồn thành khố luận cách hồn chỉnh Tuy nhiên, lực có hạn nhƣ kinh nghiệm, kỹ bị hạn chế nên tồn thiếu sót mà thân chƣa nhận thức đƣợc Chính vậy, tơi mong nhận đƣợc đóng góp ý kiến phản hồi quý Thầy Cơ giáo để khố luận đƣợc hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Trƣơng Thị Ngọc Ánh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG………………………………………………………… vii DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC VIẾT TẮT…………………………………………………… .x TÓM TẮT xi PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung nấm men Saccharomyces boulardii 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu Saccharomyces boulardii 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm hình thái, kích thƣớc, cấu tạo tế bào 2.1.4 Cấu trúc hệ gen nấm 2.1.5 Đặc điểm sinh học nấm men Saccharomyces boulardii 2.1.6 Sinh sản nấm men……………………………………………………….6 2.1.7 Vai trò nấm men Saccharomyces boulardii 2.2 Một số phƣơng pháp định danh nấm men 2.2.1 Phƣơng pháp định danh hình thái, sinh lý, sinh hoá 2.2.2 Phƣơng pháp định danh công nghệ khối phổ MALDI-TOF 12 2.2.3 Phƣơng pháp định danh tự động máy VITECK 13 2.2.4 Định danh giải trình gen vùng ITS 14 2.3 Một số nghiên cứu nấm men Saccharomyces boulardii 14 2.3.1 Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy, đặc điểm sinh trƣởng phân lập iii nấm men Saccharomyces boulardii…………………………………… 14 2.3.1.1 Nghiên cứu tối ƣu hố mơi trƣờng lên men Saccharomyces boulardii sử dụng ma trận Plackett-Burman phƣơng pháp đáp ứng bề mặt thiết kế cấu trúc có tâm……………………………………………… 14 2.3.1.2 Phân lập xác định nấm men Saccharomyces cerevisiae var boulardii việc sử dụng chúng nhƣ lợi khuẩn…………………………… 15 2.3.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh lý, sinh hoá nấm men Saccharomyces boulardii……………………………………………… 15 2.3.2.1 Nghiên cứu tính bám dính khả chống chịu dƣới tác động pH acid, enzyme tiêu hoá muối mật Saccharomyces boulardii…15 2.3.2.2 Nghiên cứu tính kháng khuẩn Saccharomyces boulardii………16 2.3.2.3 Nghiên cứu đặc điểm giống khác cấu trúc phân tử đặc điểm sinh lý Saccharomyces boulardii S cerevisiae…… 17 2.3.2.4 Xác định vị trí phân loại Saccharomyces boulardii việc phân tích trình tự vùng D1/D2 26s rDNA, ITS1-5.8S rDNA ITS2 gen COX2 ti thể……………………………………………………… 17 2.3.2.5 Nghiên cứu đột biến PGM2 biến đổi galactose làm giảm hiệu probiotic Saccharomyces boulardii…………………………………….18 2.3.3 Nghiên cứu dƣợc động học nấm men Saccharomyces boulardii…………………………………………………………………18 2.3.3.1 Nghiên cứu việc bổ sung Saccharomyces boulardii chuột ngƣời điều trị bệnh tiêu hoá………………………………………19 2.3.3.2 Sử sụng Saccharomyces boulardii làm thay đổi hệ vi sinh vật đƣờng ruột giảm nhiễm mỡ gan, viêm mức độ thấp hay tỷ lệ béo phì hay tiểu đƣờng loại db/db chuột………………………………………………19 2.3.3.3 Sự đa dạng Saccharomyces boulardii CNCM I-745 chế hoạt động chống lại nhiễm trùng đƣờng ruột………………………… 20 iv PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu 22 3.1.1 Nguyên liệu 22 3.1.2 Địa điểm thực 23 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 3.2.1 Phƣơng pháp phân lập làm nấm men Saccharomyces boulardii từ mẫu nghiên cứu (chế phẩm probiotic)………………………………… 24 3.2.1.1 Chuẩn bị môi trƣờng 25 3.2.1.2 Chuẩn bị mẫu thử 25 3.2.1.3 Cấy trải đĩa thạch 26 3.2.2 Phƣơng pháp xác định mật độ số đặc tính sinh học nấm men Saccharomyces boulardii…………………………………………………26 3.2.3 Phƣơng pháp định danh Saccharomyces boulardii giải trình tự gen vùng ITS với cặp mồi ITS1 ITS4…………………………………….28 3.2.3.1 Tách chiết DNA nấm 27 3.2.3.2 Chạy PCR 28 3.2.3.3 Điện di 29 3.2.3.4 Giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger 29 PHẦN IV KẾT QUẢ NGHÊN CỨU 30 4.1 Khảo sát nồng độ kháng sinh thích hợp cho mơi trƣờng chọn lọc nấm men Saccharomyces boulardii………………………………………………… 30 4.1.1 Kết mẫu chế phẩm probiotic đƣợc nuôi cấy môi trƣờng chọn lọc YPDA có bổ sung 0,005% kháng sinh Chloramphenicol……………30 4.1.2 Kết mẫu chế phẩm probiotic đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng chọn lọc YPDA có bổ sung 0,01% kháng sinh Chloramphenicol…………… 32 4.1.3 Kết mẫu chế phẩm probiotic đƣợc nuôi cấy môi trƣờng chọn lọc YPDA có bổ sung 0,015% kháng sinh Chloramphenicol……………33 v 4.1.4 Kết mẫu chế phẩm probiotic đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng chọn lọc YPDA có bổ sung 0,02% kháng sinh Chloramphenicol…………… 34 4.2 Phân lập chủng nấm Saccharomyces boulardii mẫu men probiotic 35 4.2.1 Kết phân lập nấm men Saccharomyces boulardii mẫu BF 36 4.2.2 Kết phân lập nấm men Saccharomyces boulardii mẫu BM 36 4.2.3 Kết phân lập nấm men Saccharomyces boulardii mẫu BL 37 4.2.4 Kết phân lập nấm men Saccharomyces boulardii mẫu BZ 37 4.3 Định danh nấm men phân lập phƣơng pháp giải trình tự vùng ITS 39 4.3.1 Tách chiết DNA 39 4.3.2 Khuếch đại trình tự vùng ITS phản ứng PCR 40 4.3.3 Định danh phân tích kết giải trình tự gen vùng ITS 40 4.3.3.1 Kết giải trình tự gen vùng ITS mẫu BF…………………………42 4.3.3.2 Kết giải trình tự gen vùng ITS mẫu BM……………………… 42 4.3.3.3 Kết giải trình tự gen vùng ITS mẫu BL…………………………43 4.3.3.4 Kết giải trình tự gen vùng ITS mẫu BZ…………………………44 4.4 Xác định nồng độ pha lỗng thích hợp để tính mật độ nấm men Saccharomyces boulardii mẫu chế phẩm probiotic……………….45 4.4.1 Mật độ nấm men mẫu BF với độ pha loãng 10-6 – 10-9 45 4.4.2 Mật độ nấm men mẫu BM với độ pha loãng 10-3-10-5 47 4.4.3 Mật độ nấm men mẫu BL nồng độ 10-5-10-8 49 4.4.4 Mật độ nấm men mẫu BZ nồng độ 10-2-10-4…………………….52 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC…………………………………………………………… 60 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Một số mẫu men vi sinh nghiên cứu……………………………… 22 Bảng 3.2 Môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc có bổ sung kháng sinh Chloramphenicol…………………………………………………….25 Bảng 4.1 Mơi trƣờng ni cấy chọn lọc YPDA có bổ sung kháng sinh nồng độ khác nhau…………………………………………………………30 Bảng 4.2 Hình ảnh kết nuôi cấy mẫu môi trƣờng YPDA + 0,005% Chloramphenicol…………………………………………………… 31 Bảng 4.3 Hình ảnh kết nuôi cấy mẫu môi trƣờng YPDA + 0,01% Chloramphenicol 32 Bảng 4.4 Hình ảnh kết ni cấy mẫu môi trƣờng YPDA + 0,015% Chloramphenicol…………………………………………………… 33 Bảng 4.5 Hình ảnh kết ni cấy mẫu môi trƣờng YPDA + 0,02% Chloramphenicol…………………………………………………… 34 Bảng 4.6 Hình ảnh đĩa ni cấy mẫu BF độ pha loãng 10-6 – 10-9 45 Bảng 4.7 Số lƣợng tản nấm mẫu BF đếm đƣợc độ pha lỗng 10-6 – 10-9 46 Bảng 4.8 Hình ảnh đĩa nuôi cấy mẫu BM nồng độ 10-3-10-5 47 Bảng 4.9 Số lƣợng tản nấm mẫu BM đếm đƣợc độ pha loãng 10-3 – 10-5 48 Bảng 4.10 Hình ảnh đĩa ni cấy mẫu BL nồng độ 10-5-10-8 49 Bảng 4.11 Số lƣợng tản nấm mẫu BL đếm đƣợc độ pha loãng 10-5 – 10-8 50 Bảng 4.12 Hình ảnh đĩa ni cấy mẫu BZ nồng độ 10-2 – 10-4 51 Bảng 4.13 Số lƣợng tản nấm mẫu BZ đếm đƣợc độ pha loãng 10-2 – 10-4 52 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh minh hoạ nấm men Hình 2.2 Cấu trúc hệ gen Saccharomyces boulardii Hình 2.3 Một số hình thức sinh sản nấm men Hình 2.4 Quá trình nảy chồi nấm men Hình 2.5 Một số kiểu nảy chồi điển hình nấm men Hình 2.6 Sinh sản hình thức nảy chồi nấm men 10 Hình 2.7 Hình thức sinh sản qua trình phân cắt tế bào 10 Hình 2.8 Sinh sản hình thức tạo bào tử hay thông qua vỏ nhày nấm men 10 Hình 2.9 Một số hình dạng tế bào nấm men 11 Hình 2.10 Quy trình định danh khối phổ MALDI TOF 13 Hình 2.11 Hình ảnh giải trình tự gen phƣơng pháp Sanger 14 Hình 3.1 Phân lập nấm men từ mẫu chế phẩm probiotic 25 Hình 3.2 Các mẫu thử đƣợc pha lỗng tới nồng độ thích hợp 26 Hình 4.1 Hình ảnh nấm men phân lập mẫu BF 36 Hình 4.2 Hình ảnh nấm men phân lập mẫu BM 37 Hình 4.3 Hình ảnh nấm men phân lập mẫu BL 37 Hình 4.4 Hình ảnh nấm men phân lập mẫu BZ 38 Hình 4.5 Kết điện di DNA tổng số nấm men tách chiết 39 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu 40 Hình 4.7 Kết giải trình tự gen vùng ITS mẫu BF đƣợc hiển thị công cụ Blastn NCBI 41 Hình 4.8 Kết giải trình tự gen vùng ITS mẫu BM đƣợc hiển thị công cụ Blastn NCBI 41 Hình 4.9 Kết giải trình tự gen vùng ITS mẫu BL đƣợc hiển thị công cụ Blastn NCBI 42 Hình 4.10 Kết giải trình tự gen vùng ITS mẫu BZ đƣợc hiển thị công cụ Blastn NCBI 43 viii Sau đếm tản nấm dựa kết nuôi cấy mẫu BZ môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc YPDA có bổ sung 0,005% Chloramphenicol, ta thu đƣợc bàng sau: Bảng 4.11 Số lƣợng tản nấm mẫu BL đếm đƣợc độ pha loãng 10-5 – 10-8 Độ pha loãng 10-5 10-6 10-7 10-8 Đĩa 295 233 17 Đĩa 307 219 21 Đĩa 325 181 12 Trung bình 309 211 17 Đĩa cấy Dựa vào bảng thống kê số lƣợng tản nấm đếm đƣợc mẫu BL, nồng độ pha loãng liên tiếp 10-5-10-8, ta thấy nồng độ 10-6 có số lƣợng tản nấm nằm khoảng 25 – 250 tản nấm/đĩa Ở nồng độ 10-5 số lƣợng tản nấm nằm ngồi khoảng (khơng đáng kể), chấp nhận đƣợc Số lƣợng nấm xuất có từ 1-4 tản nấm/ đĩa ni cấy nồng độ 10-8 Nhƣ vậy, kết luận nồng độ pha lỗng thích hợp để tính mật độ nấm men mẫu BL 10-6 Hình 4.14 Số lƣợng tản nấm mẫu BL nồng độ 10-6 Nồng độ CFU/g mẫu men BL là: N (CFU/g) = 10 x 211 x 1/10-6 = 2,1.109 (CFU/g) 50 Vậy mật độ nấm men Saccharomyces boulardii mẫu BL mức cao đạt 2,1.109 (CFU/g) có mật độ lớn (khơng đáng kể) so với mật độ mà nhà sản xuất công bố trƣớc đó, chứng tỏ nấm men Sacchromyces boulardii sinh trƣởng phát triển thuận lợi điều kiện môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc YPDA bổ sung kháng sinh Chloramphenicol 0,005% 4.4.4 Mật độ nấm men mẫu BZ nồng độ 10-2 – 10-4 Dựa kết khảo sát nồng độ kháng sinh mục trên, ta thấy mẫu BZ 10-2 xuất tản nấm riêng lẻ, tách rời nên dễ cho việc quan sát nhƣ đếm tính tốn mật độ tản nấm có mẫu Vì vậy, ta định lựa chọn nồng độ pha lỗng 10-2 – 10-4 để ni cấy mẫu BZ Dƣới kết thu đƣợc sau 48h nuôi cấy tủ ấm 300C Bảng 4.12 Hình ảnh đĩa ni cấy mẫu BZ nồng độ 10-2 – 10-4 Đĩa cấy Đĩa Đĩa Đĩa Độ pha loãng 10-2 10-3 10-4 51 Từ đĩa, tiến hành đếm số lƣợng tản nấm kết đƣợc tổng hợp bảng 4.13 dƣới Bảng 4.13 Số lƣợng tản nấm mẫu BZ đếm đƣợc độ pha loãng 10-2 – 10-4 Độ pha loãng 10-2 10-3 10-4 Đĩa cấy Đĩa 383 47 Đĩa 308 45 Đĩa 422 40 Trung bình 371 44 Dựa vào bảng thống kê số lƣợng tản nấm đếm đƣợc mẫu BZ, nồng độ pha loãng liên tiếp 10-2-10-4, ta thấy nồng độ 10-3 có số lƣợng tản nấm nằm khoảng 25 – 250 tản nấm/đĩa Ở nồng độ 10-2 số lƣợng tản nấm nằm ngồi khoảng (khơng đáng kể), chấp nhận đƣợc Số lƣợng nấm xuất có từ 0-2 tản nấm/đĩa nuôi cấy nồng độ 10-4 Nhƣ vậy, kết luận nồng độ pha lỗng thích hợp để tính mật độ nấm men mẫu BZ 10-3 Hình 4.15 Số lƣợng tản nấm mẫu BZ nồng độ 10-3 Nồng độ CFU/g mẫu men BZ là: N (CFU/g) = 10 x 44 x 1/10-3 = 4,4.105 (CFU/g) Vậy mật độ nấm men Saccharomyces boulardii mẫu BZ mức trung bình cao đạt 4,4.105 (CFU/g), chứng tỏ nấm men Sacchromyces boulardii sinh 52 trƣởng phát triển tốt điều kiện môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc YPDA bổ sung kháng sinh Chloramphenicol 0,005% Cũng từ kết nên ta biết đƣợc mật độ nấm Saccharomyces boulardii mẫu BZ nhà sản xuất chƣa công bố thành phần chúng bao bì chế phẩm 53 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Dựa vào kết thí nghiệm thu đƣợc, chúng tơi có kết luận nhƣ sau: Phân lập thành công nấm men Saccharomyces boulardii Cùng với đó, kết giải trình tự xác định đƣợc chủng thuộc mẫu BF, BM, BL, BZ thuộc loài nấm men Saccharomyces boulardii Nghiên cứu thử nghiệm thành công môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc YPDA bổ sung kháng sinh Chloramphenicol mức 0,005% cho nuôi cấy phân lập nấm Bên cạnh đó, chúng tơi xác định đƣợc mật độ mẫu với nồng độ pha lỗng thích hợp tƣơng ứng: Mật độ BF đạt 9,7.1010 (CFU/g) nồng độ 10-8; mật độ BM đạt 5,1.106 (CFU/g) nồng độ 10-4; mật độ BL đạt 2,1.109 (CFU/g) nồng độ 10-6; mật độ BZ đạt 4,4.105 (CFU/g) nồng độ 10-3 5.2 Kiến nghị Bởi thời gian nghiên cứu hạn chế nên chƣa thể tiến hành nghiên cứu với số lƣợng mẫu nhiều chƣa mở rộng đƣợc phạm vi thu thập mẫu Cần tiến hành số nghiên cứu sâu để tìm hiểu đặc tính sinh lý, sinh hố khác nấm men Saccharomyces boulardii Từ đó, giúp phân biệt chúng với loài nấm men họ hàng khác nhƣ S cerevisiae 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc Trần Văn Tuấn Vũ Xuân Tạo (2020) “Xác định số đặc điểm sinh học nấm men Saccharomyces boulardii”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam (Số3/112) Đồn Thị Kiều Tiên, Viên Thị Hải Yến, Huỳnh Xuân Phong, Bùi Hoàng Đăng Long, Hà Thanh Tồn Ngơ Thị Phƣơng Dung (19/06/2018) “Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt ứng dụng lên men rƣợu vang trái giác (Cayratia trifolia L.) từ tỉnh Hậu Giang”, Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, số 54(4B): 64-71 Lƣơng Đức Phẩm, 2009 “Giáo Trình Nấm Men Cơng Nghiệp - Lƣơng Đức Phẩm.” Lƣơng Đức Phẩm, 2012 “Giáo Trình Cơng Nghệ Lên Men - Lƣơng Đức Phẩm.” Vũ Thị Tuyết Nhung, Lê Quỳnh Loan, Huỳnh Thị Điệp, Phạm Anh Vũ, Trần Thị Mỹ Ngọc, Trần Trung Kiên Nguyễn Hoàng Dũng (2020) “Xác định loài nấm gây bệnh lúa (ORYZA SATIVA) tỉnh Kiên Giang”, Công nghệ Sinh học Mơi trƣờng Nơng nghiệp, 558-559 Lý Nguyễn Bình, Nguyễn Văn Thành, Hà Phƣơng Thảo Trần Văn Khánh (2015) “Phân Lập Tuyển Chọn Nấm Men Có Hoạt Lực Cao Từ Men Rƣợu.” Tạp Chí Khoa Học Trƣờng Đại Học Cần Thơ (39): 18-28 Nguyễn Văn Vũ Nguyễn Văn Thành (2018) “Phân Lập, Tuyển Chọn Định Danh Nấm Men Trong Lên Men Rƣợu Vang Dâu Hạ Châu” (Baccaurea Ramiflora L.).” Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ 54 (7): 22–32.8 Đặc điểm cấu tạo phƣơng thức sinh sản nấm men Truy cập ngày 15/06/2022 từ https://123docz.net//document/9278372-dac-diem-cau-tao-va-phuong-thuc-sinhsan-cua-nam-men.htm BioMedia – Phƣơng pháp khối phổ Truy cập ngày 08/06/2022 từ http://biomedia.vn/review/phuong-phap-khoi-pho-ms.html 10 “Phân lập tuyển chọn nấm men có khả lên men rƣợu vang long ruột đỏ (Hylocereus polyrhizus)” (09/10/2019) – Việt Nam Biological Industries truy cập ngày 05/06/2022 từ https://congnghiepsinhhocvietnam.com.vn/tin- tuc/t343/phan-lap-va-tuyen-chon-nam-men-co-kha-nang-len-men-ruou-vang-thanh- 55 long-ruot-do-hylocereus-polyrhizus.html?fbclid=IwAR21DxxNjbFzfst0L7jYRMe8szi8iZ3Zmwb_5rjS6Tg620Swajmd LyqhU5A Tài liệu nƣớc 11 Zainab M AL Zubaidy and Khanda O Khidhr (June 10 2013) “Isolation and Identification of Saccharomyces cerevisiae var boulardii and its Uses as a Probiotics (in vitro)”, Department of Food Technology College of Agriculture University of Salahaddin Vol 25, No.1pp 1-11 12 Ramachandran Chelliah, Eun-Ji Kim, Eric Banan-Mwine Daliri, Usha Antony and Deog-Hwan Oh (June 20 2021) “In vitro Probiotic Evaluation of Saccharomyces boulardii with Antimicrobial Spectrum in a Caenorhabditis elegans Model” Food 2021, 10, 1428: 15-18 13 Hesham A EI Enshasy and Abdalla EI Shereef (October 2019) “Saccharomyces boulardii Adapted to Dryness Stress Optimization of High Cell Density Cultivation of Yeast” from PROBIOTIC/BIOTHERAPEUTIC YEAST, (104): 389-393 14 Zhangteng Lei, He Chen, Dan Huang, Yaling Zhai and Guowei Shu (December 14 2016) “Optimization of medium compositions for Saccharomyces boulardii by boxbehnken design” Scientific Study 15 Research 2016, 17 (4), pp 405-416 M Manafi, M Hedayati & S Mirzaie (January 18 2018) “Probiotic Bacillus species and Saccharomyces boulardii improve performance, gut histology and immunity in broiler chickens” South African Jourmal of Animal Science 2018, 48 (No.2), 380-385 16 Dao Thi Luong, Ha Thi Hang and Duong Van Hop (July 21 2019) “Culture Condition for High Biomass Production of Probiotic Yeast Saccharomyces Boulardii SB2 in Shake Flask and Littre Scale” VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology Vol 35, No.3 (2019): 47-55 17 Eunice Tranquilino-Rodriguez, Hector E Martinez-Flores, Jose O Rodiles-Lopez, Rafael Zamora-Vega, Rafael Salgado-Garciglia, Rosa E Perez-Sanchez (February 28 2017) “Survival rate of Saccharomyces boulardii adapted to a functional freeze-dried yogurt: experimental study related to processing, storae and digestion by Wistarrats Funtional Foods in Health and Disease 2017; 7(2): 98-114 56 18 Mahdi Salimi, Mohammadreza Mahzounieh (October 17, 2016) “Preparation of Proper Culture Medium for Saccharomyces cerevisiae var boulardii with Molasses and Animal Serum” J Med Microbiol Infec Dis, 2015, (1-2): 18-22 19 Lynne V McFarland (May 14 2010) “Systematic review and meta-analysis of Saccharomyces boulardii in adult patients” National library of Medicine (NIH) – National Center for Biotechnology Information Vol 16(18), 2202-2222 20 Angel Yeast – Human Health (December 17 2021) - “Patented probiotic S boulardii alleviates common IBD symptoms, new research shows”, retrieved June 2022 from https://www.nutraingredients-asia.com/News/Promotional-Features/Patented-probioticS.-boulardii-alleviates-common-IBD-symptoms-new-researchshows?fbclid=IwAR12nWAJm1LlJ3mlWg2LQUGs_sNVt7QHy7bZr9_tObLLyWtFi3I QLNr3WwQ 21 Pedro Pais, Vanda Almeida, Melike Yilmaz and Migule C Teixeira (June 2020) “Saccharomyces boulardii: What makes it tick as successful Probiotic?”.6(2):78 22 Md Nur Hossain, Sadia Afrin, Sạnida Humayun, Monzur Morshed, AhMED AND Barun Kanti Saha (April 2020) “Identification and Growth Characterization of a Novel Strain of Saccharomyces boulardii Isolated From Soy Paste” from http:// doi.org/10.3389/fnut.2020.00027 23 Hudson LE, McDermott CD, Stewart TP, Hudson WH, Rios D, Fasken MB, et al.(2016) “Characterization of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii in the healthy mucosal immune system PLoS ONE 11:e0153351 doi: 10.1371/journal.pone.0153351” 24 Alaa Kareem Niamah and Alaa Jabbar Abd AI-Manhel (September 2018) “Isolation, Purification and Characterization of Antimicrobial Peptides Produced from Saccharomyces boulardii” International Jounal of Peptide Research and Thẻapeutics 24 (3) DOI:10.1007/s10989-017-9632-2 25 Laura Edward-Ingram, Paul Gitsham, Nicola Burton, Geoff Warhurst, Lan Clarke, David Hoyle, Stephen G Oliver, and Lubomira Stateva (April 15 2007) “Genotypic and Phýiological Characterization of Saccharomyces boulardii, the Probiotic Strain of Saccharomyces cerevisiae Vol 73, No 8.(48-61) 57 26 Riquelme et al, January 2003.”Saccharomyces cerevisiae Fungemia after Saccharomyces boulardii treatment in immunocompromised Patients” Wolters Kluwer, vol 36-Issue : p41-43 27 Suprama Datta, David J Tímon and Uday S Annapure (November 21 2016) “Antioxidant properties and global metabolite screening of probiotic yeast Saccharomyces cerevisiae var boulardii” Science Food and Agriculture, retieved 01/06/2022 from http://doi.org/10.1002/jssa.8147 28 Junjie Fu et al (Fenruary 22 2022).”Adaptive response and tolerance to weak acids cerevisiae boulardii: a metabolomics approach” Food Science Technology, retrieved 02/0602022 from https://doi.org/10.1111/ijffs.15598 29 Therap Adv Gastroeenterol (2012).“Efficacy and sàety of the probiotics Saccharomyces boulardii for the prevention and therapy of gastrointestinal disorders”.5(2): 111-125 30 Curr Microbiol (May 29 2020).”Saccharomyces boulardii CNCM I-745: A Nonbacterial Microorganism Used as Probiotic Agent in Supporting Treatment of Selected Diseases”.77(9): 1987-1996 58 PHỤ LỤC Trình tự gen vùng ITS mẫu BF dài 809 bp >1st_BASE_4542178_F_ITS1.ab1 GGGGCTAGATTATATTTTGAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATG AGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAGGAGATGGAGAGTCCAGCCGG GCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTT GCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTA AAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTT TTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAA ACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTA ACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGT TCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATT GCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTT GGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACA TTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTG GCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCT TGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCT AATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAG CGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGA GTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA Hình ảnh phần kết giải trình tự gen mẫu BF đƣợc phân tích phần mềm Chromas phiên 2.6.6 59 Trình tự gen vùng ITS mẫu BM dài 810 bp >1st_BASE_4542179_M_ITS1.ab1 GGCTAAGGAATTTATAATTTTGAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGC ATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAGGAGATGGAGAGTCCAGCC GGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTC TTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAAT TAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAA CTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACAC AAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCG TAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG GTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAA TTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCC TTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAA CATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGC TGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTG CTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGG CTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAG AGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAG GAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGCGGAGGAA Hình ảnh phần kết giải trình tự gen mẫu BM đƣợc phân tích thơng qua phần mềm Chromas phiên 2.6.6 60 Trình tự gen vùng ITS mẫu BL dài 810bp >1st_BASE_4542180_L_ITS1.ab1 GGGCTAAGATTTATATTTTGAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCAT GAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAGGAGATGGAGAGTCCAGCCG GGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCT TGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATT AAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAAC TTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACAC AAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCG TAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG GTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAA TTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCC TTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAA CATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGC TGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTG CTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGG CTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAG AGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAG GAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGGAGGGA 61 Hình ảnh phần kết giải trình tự gen mẫu BL thơng qua phân tích phần mềm Chromas phiên 2.6.6 Trình tự vùng ITS mẫu BZ dài 817bp >1st_BASE_4542181_Z_ITS1.ab1 GGGGCTAGGATTATATTTTGAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCAT GAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAGGAGATGGAGAGTCCAGCCG GGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCT TGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATT AAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAAC TTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACAC AAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCG TAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG GTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAA TTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCC TTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAA CATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGC TGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTG CTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGG CTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAG AGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAG GAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAGCCCGGAAGAAAGGAT CTTTATTGAGTTTAATAATTTTGGAAAATGGATTTTTTTGTATTGAGCAA GAGCATGAGAGCTTTTACTGGCAAAAGACAGGAGATGGAGAGTCGCG GCCTGCCTTAAGTGCGCGTCTTGCTAGGCTGTAATTTTCTTTCTTGTAA TCAAACGAGAAAAAATTTCTGGTCTTTGATATAGGACAATTAAAACTT AAATAACCACTGGAAGTTCATATCTTTGCACTTTTTCTTTGAGCAATCA GACATCGGGTCAGTTAAAAAACCAACAGAGATATCATTCTAATTTGTT CAAAGCAGAGATTCGAATCTGAATTGAAGAATTGTAACTCCAACGAAT CTGGCTCCTATACGATGAAGACGCAAGCGACAA 62 Hình ảnh phần kết trình tự gen mẫu BZ thơng qua phân tích phần mềm Chromas phiên 2.6.6 Kết xử lý thống kê 63 64