HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT VI TẢO ĐỂ PHÁT TRIỂN KEM LÀM TRẮNG DA TỰ NHIÊN Sinh viên thực : Trần Thị Thảo Vân Mã sinh viên : 637090 Lớp : K63CNSHA Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thanh Hảo Hà Nội, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT VI TẢO ĐỂ PHÁT TRIỂN LÀM KEM TRẮNG DA TỰ NHIÊN” cơng trình nghiên cứu cá nhân thời gian qua Mọi số liệu sử dụng, hình ảnh, kết nghiên cứu tơi tự tìm hiểu, phân tích cách khách quan, trung thực, có nguồn gốc rõ ràng chưa cơng bố hình thức Mọi giúp đỡ cho việc thực đề tài cảm ơn thông tin trích dẫn đề tài ghi nguồn gốc rõ ràng Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước Học viện Hội đồng Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Trần Thị Thảo Vân i năm 2022 LỜI CẢM ƠN Sau kết thúc thời gian thực tập Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam quan tâm, bảo tận tình Thầy giáo, Cơ giáo cán phịng thí nghiệm; với cố gắng, nỗ lực thân, rút học kinh nghiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học tồn thể Thầy giáo, Cơ giáo truyền đạt cho kiến thức chuyên ngành, kỹ làm việc phịng thí nghiệm học quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thanh Hảo, người thầy hướng dẫn tận tâm, giải đáp thắc mắc câu hỏi giúp đỡ tơi nhiệt tình q trình làm thí nghiệm thu kết tốt Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô cán Viện nghiên cứu Vi tảo Dược mĩ phẩm tận tình giúp đỡ, định hướng cách tư cách làm việc khoa học Đó nhứng góp ý q báu khơng q trình thực khóa luận tơt nghiệp mà cịn hành trang tiếp bước cho tơi q trình học tập làm việc sau Cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vơ hạn, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình người thân,bạn bè Thầy Cô luôn động viên, giúp đỡ, tạo động lực cho suốt trình học tập, nghiên cứu q trình làm khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Trần Thị Thảo Vân ii năm 2022 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC ĐỒ THỊ viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT x PHẦN 1: MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài .2 1.3.Ý nghĩa đề tài 1.3.1.Ý nghĩa khoa học .2 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn .2 2.1 Giới thiệu enzyme tyrosinase 2.1.1 Khái niệm nguồn gốc enzyme tyrosinase tự nhiên 2.1.2.Vai trò ứng dụng enzyme tyrosinase 2.1.3 Sự hình thành enzyme tyrosinase tự nhiên hình thành sắc tố da người 2.1.4 Cơ chế hoạt động enzyme tyrosinase 2.1.5 Ảnh hưởng chất ức chế đến hoạt động enzyme tyrosinase 2.2 Động học phản ứng enzyme tyrosinase .12 2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzyme đến tốc độ chuyển hóa chất .12 2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất 13 2.3 Các chất ức chất enzyme tyrosinase 15 iii 2.4 Ứng dụng chất ức chế enzyme tyrosinase 19 2.5 Các nghiên cứu sàng lọc chất ức chế enzyme tyrosinase .20 2.5.1 Nghiên cứu hoạt động ức chế enzyme tyrosinase từ tảo lam 20 2.6.1 Khái quát chung Spirulina platensis loại vi tảo có hoạt tính ức chế tyrosinase 21 2.6.2 Hoạt chất sinh học có Spirulina platensis 21 2.7 Giới thiệu số phương pháp chiết 22 2.7.1 Phương pháp chiết Soxhlet .23 2.7.2 Ngấm kiệt 24 2.7.3 CO tới hạn 25 2.7.4 Lôi nước 26 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 27 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27 3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ .27 3.1.3 Thiết bị 27 3.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 3.2 Nội dung nghiên cứu 28 3.3 Phương pháp nghiên cứu 28 3.3.1 Phương pháp tách chiết, tạo cao kỹ thuật Soxhlet 28 3.3.2 Phương pháp thử hoạt tính enzyme tyrosinase .29 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 Ảnh hưởng dung môi đến hiệu tách chiết .39 4.2 Xác định động học enzyme tyrosinase .42 4.2.1 Xác định nồng độ enzyme tối ưu cho phản ứng 42 4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ chất L-DOPA đến phản ứng .43 4.2.3 Đánh giá khả phân giải arbutin enzyme tyrosinase dịch chiết vi tảo 45 4.3 Xác định động học enzyme tyrosinase có mặt dịch chiết tảo 46 iv 4.3.1 Nghiên cứu khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết tảo dung môi ethyl acetate 46 4.3.2 Nghiên cứu khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết tảo dung môi ethanol (96%) .49 4.3.3 Phân tích động học enzyme tyrosinase có chất ức chế tham gia 51 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Khối lượng hóa chất, thể tích, nồng độ cần pha đệm Potassium .29 Bảng 3.2 Khối lượng hóa chất, thể tích, nồng độ cần pha hóa chấtL-DOPA (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine) 31 Bảng 3.3 Dãy nồng độ pha loãng acid arbutin 31 Bảng 3.4 Khối lượng, thể tích, nồng độ cần pha hóa chất acid arbutin 32 Bảng 3.5 Dãy nồng độ pha loãng từ dung dịch gốc 34 Bảng 3.6 Thể tích hút chất vào giếng ELISA 36 Bảng 4.1 Ảnh hưởng dung môi thời gian đến khối lượng cao chiết tảo xoắn S.platensis 39 Bảng 4.1 Ảnh hưởng dung môi thời gian đến khối lượng cao chiết tảo xoắn S.platensis 40 Bảng 4.3 Ảnh hưởng dung môi thời gian đến khối lượng cao chiết tảo xoắn S.platensis 40 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ chất L-DOPA đến phản ứng 44 Bảng 4.7 Bảng đo độ hấp thụ huỳnh quang đối chứng (+) .45 Bảng 4.8 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate 47 Bảng 4.9 Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại dịch chiết tảo dung môi ethyl acetate 47 Bảng 4.10 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol (96%) 49 Bảng 4.11 Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại dịch chiết tảo dung môi ethanol (96%) .50 Bảng 4.12 Tổng hợp Ic50, mức độ ức chế, Km Vmax ba dịch chiết tảo loại dung môi 53 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc enzyme tyrosinase Hình 2.2 Cơ chế tổng hợp melanin hình thành sắc tố da vai trò enzyme tyrosinase xảy melanosome Hình 2.3 Sự hình thành mảng sắc tố da tác dụng tia UV enzyme tyrosinase Hình 2.4 Sơ đồ chất kìm hãm cạnh tranh: chất(S) chất kìm hãm (I) Hình 2.5 Lineweaver –Burk plot 10 Hình 2.6 Đồ thị đảo ngược kép mô tả kiểu ức chế phản ứng enzyme .11 Hình 2.7 Sự phụ thuộc vận tốc phản ứng vào [E] .13 Hình 2.8 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất 14 Hình 2.9 Tinh chất dưỡng trắng da Naris Nature Whitening Serum Nhật Bản .20 Hình 2.10 Hình ảnh tảo S.Platensis 1, S.Platensis 3, S.Platensis chụp kính hiển vi 21 Hình 2.11 Hình ảnh dụng cụ Soxhlets .23 Hình 2.12 Sơ đồ hoạt động chiết CO siêu tới hạn .25 Hình 2.13 Sơ đồ hoạt động chưng cất lôi nước .26 Hình 3.1 Máy đọc miễn dịch ELISA MR-96A Mindray Xuất xứ: Trung Quốc giếng ELISA (96 giếng ) 29 Hình 3.2 Hóa chất L-DOPA (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine) 98%– Hãng Sigma 30 Hình 3.3 Hóa chất acid arbutin 98% -Hãng Acros organics 32 Hình 3.4 Enzyme mushroom tyrosinase – Hãng Sigma Aldrich - Mỹ 33 Hình 4.1 Chiết bột tảo máy Soxhlet 41 Hình 4.2 Dịch chiết ba loại tảo sau chiết Soxhlet .41 Hình 4.3 Cao chiết ba loại tảo 42 Hình 4.4 Phản ứng đĩa microtiter 42 Hình 4.5 Phản ứng đĩa microtiter 44 vii DANH MỤC ĐỒ THỊ Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme khác đến phản ứng enzyme – chất .43 Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng nồng độ chất đến tốc phản ứng 44 Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng nồng độ arbutin đến khả ức chế enzyme tyrosinase 46 Biểu đồ 4.4 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate 47 Biểu đồ 4.5 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol (96%) .50 Biểu đồ 4.6 Mức độ ức chế enzyme dịch chiết ethanol .50 Biểu đồ 4.7 Linweaver- Burk plots hoạt động tyrosinase với chất LDOPA nồng độ dịch chiết tảo S platensis 50,200,400 800µg/ml 52 Biểu đồ 4.8 Linweaver- Burk plots hoạt động tyrosinase với chất LDOPA nồng độ dịch chiết tảo S platensis 50,200,400 800µg/ml 52 Biểu đồ 4.9 Linweaver- Burk plots hoạt động tyrosinase với chất LDOPA nồng độ dịch chiết tảo S platensis 50,200,400 800µg/ml 53 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT UVA : Tia cực tím B UVB : Tia cực tím B DNA : Deoxyribonucleic acid TYR : Tyrosinase L-DOPA : 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine) HQ : Hydroquinone DMSO : Dimethylsulfoside S Ob : Scenedesmus obliquus ix Bảng 4.5 Ảnh hưởng nồng độ enzyme khác đến khả phản ứng enzyme – chất Nồng độ enzyme (Units) Độ hấp thụ 10 20 30 40 50 Lần 0,591 1,023 1,521 1,723 1,702 Lần 0,621 1,147 1,607 1,948 1,601 Lần 0,545 1,286 1,431 1,611 1,570 Trung bình 0,586±0,04 1,152±0,13 1,52±0,09 1,761±0,17 1,624±0,07 OD 492 nm Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme khác đến phản ứng enzyme – chất Kết thu cho thấy tăng nồng độ enzyme, tốc độ phản ứng enzyme tăng nhanh, nhiên nồng độ enzyme tăng đến 40U phản ứng đạt cân Khi tăng nồng độ enzyme đến 50U tốc độ phản ứng bắt đầu có xu hướng giảm (Biểu đồ 4.1) Từ đó, chọn enzyme tyrosinase nồng độ 40U cho phản ứng sau thực cách tối ưu 4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ chất L-DOPA đến phản ứng Trong nghiên cứu nồng độ enzyme cố định 40 Units, nồng độ chất L-DOPA thay đổi từ đến mM Kết thu trình bày bảng 4.6 43 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ chất L-DOPA đến phản ứng Độ hấp thụ Nồng độ chất L-DOPA (mM) OD492 nm Lần 0,695 1,082 1,331 1,6843 1,665 Lần 0,654 1,073 1,421 1,671 1,651 Lần 0,701 1,071 1,572 1,721 1,640 1,408±0,01 1,692±0,03 1,652±0,01 Trung bình 0,683±0,02 1,075±0,01 Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng nồng độ chất đến tốc phản ứng Hình 4.5 Phản ứng đĩa microtiter Chú thích: Hàng từ trái qua phải: Cơ chất L-DOPA tăng dần từ đến mM Phản ứng lặp lại lần Kết thu cho thấy tăng nông độ chất L-DOPA tốc độ phản ứng enzyme tăng, nhiên nồng độ chất tăng đến mM phản ứng đạt cân Khi tăng nồng độ chất L-DOPA đến 5mM tốc độ phản ứng có xu 44 hướng giảm (Biểu đồ 4.2) Trong phản ứng động học enzyme, giá trị V max xác định tốc độ phản ứng đạt cực đạt (tính theo giá trị cường độ huỳnh quang bước sóng 492 nm, đồng thời giá trị Km xác định nồng độ chất L-DOPA mà tốc độ phản ứng ½ V max Giá trị Km xác định dựa vào thực nghiệm phương trình tuyến tính (Biểu đồ 4.2) Giá trị Km xác định = 1,3528 mM 4.2.3 Đánh giá khả phân giải arbutin enzyme tyrosinase dịch chiết vi tảo Arbutin chất làm đối chứng (+) sử dụng công nghiệp mỹ phẩm, có khả ức chế enzyme tyrosinse cao Dựa vào nghiên cứu, lựa chọn arbutin để so sánh đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase ba loại dịch chiết tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase tính theo cơng thức (1) Dựa sở xác định nồng độ enzyme nồng độ L-DOPA thí nghiệm trên, thí nghiệm này, phản ứng enzyme (đối chứng âm) sử dụng enzyme tyrosinase nồng độ 40 U, L-DOPA mM Đối với phản ứng có mặt chất ức chế arbutin, nồng độ arbutin sử dụng là: 10, 100, 500, 1000 µM Kết trình bày bảng 4.7, biểu đồ 4.8: Bảng 4.7 Bảng đo độ hấp thụ huỳnh quang đối chứng (+) Nồng độ (µM) 10µM 100µM 500µM 1000µM Độ hấp thụ OD 1,673 1,2937 0,8663 0,6957 Mức độ ức chế (%) 10,3189 30,6513 53,562 62,707 45 Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng nồng độ arbutin đến khả ức chế enzyme tyrosinase Từ kết biểu đồ ta thấy, nồng độ chất ức chế ảnh hưởng lớn đến khả ức chế enzyme tyrosinase Cụ thể nồng độ chất ức chế arbutin tăng từ 101000 µM phần trăm ức chế enzyme tyrosinase arbutin tăng từ 10,3189%, 30,6513%, 53,562%, đến 62,707% 4.3 Xác định động học enzyme tyrosinase có mặt dịch chiết tảo 4.3.1 Nghiên cứu khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết tảo dung môi ethyl acetate Khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết ba loại vi tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis dung môi ethyl acetate với nồng độ khác xác định cường độ huỳnh quang bước sóng 492nm Đối chứng enzyme tyrosinase nồng độ 50mg/ml, sử dụng để so sánh với enzyme sau bị ức chế dịch chiết ba loại tảo Từ thấy khả ức chế enzyme ba dịch chiết tảo ethyl acetate Kết trình bày bảng 4.8 46 Bảng 4.8 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate Nồng độ (µg/ml) 50 200 400 800 Mẫu cao chiết S.platensis 1.421±0,07 1.327±0,07 1.215±0,09 0.983±0,12 S.platensis 1.294±0.06 1.037±0.06 0.84±0.11 0.794±0.07 S.platensis 1.376±0.09 1.086±0.96 0.856±0.07 0.804±0.07 Arbutin 1.662±0.06 1.316± 0.09 0.868±0.09 0.72±0.06 Enzyme đối chứng 1.825 Biểu đồ 4.4 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate Kết bảng 4.8 cho thấy khả hấp thụ cường độ huỳnh quang bước sóng 492 nm ba dịch chiết tảo giảm dần tăng nồng độ dịch chiết Điều chứng tỏ dịch chiết tảo có khả ức chế enzyme tyrosinase Tuy nhiên, mức độ ức chế cao so với dịch chiết ethanol Trong số dịch chiết thử nghiệm, dich chiết tảo xoắn S.platensis cho khả ức chế enzyme cao nồng độ 800 (µg/ml), tiếp S.platensis thấp dịch chiết S.platensis 47 Bảng 4.9 Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại dịch chiết tảo dung môi ethyl acetate Nồng độ mẫu(µg/ml) Mức độ ức chế (%) 50 200 400 800 S.platensis 24.575±3.12 40.460±2.26 53.103±3.05 57.278±2.05 S.platensis 25.433±2.25 27.265±3.85 31.381±1.83 42.807±2.71 S.platensis 29.053±3.21 43.152±3.32 49.972±1.48 53.148±1.89 Arbutin 9,015±1.14 27.853±2.08 52.410±2.34 60.535±3.36 Biểu đồ 4.5 Mức độ ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate Kết bảng 4.8; 4.9 cho thấy dịch chiết biểu có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinae mức độ ức chế tỉ lệ với nồng độ dịch chiết Trong số dịch chiết tảo xoắn S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis khả ức chế enzyme tyrosinase tảo xoắn S platensis thể khả ức chế enzyme cao nồng độ 800 (µg/ml), tiếp S.platensis thấp dịch chiết S.platensis Mức độ ức chế enzyme tyrosinase S.platensis 1, S platensis 3, S.platensis : 57.2785 ; 53.1488 ; 42.8073 (%) 48 Khi so sánh với arbutin (chất có khả ức chế enzyme/đối chứng dương) cho thấy, khả ức chế enzyme dịch chiết thấp đáng kể Trong điều kiện thí nghiệm, khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết ba chủng vi tảo đạt ngưỡng 15-25% so với đối chứng (phản ứng không bổ sung chất ức chế) 4.3.2 Nghiên cứu khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết tảo dung môi ethanol (96%) Khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết ba loại tảo Spirulina platensis:S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis dung môi ethyl acetate nồng độ khác xác định cường độ huỳnh quang bước sóng 492 nm Đối chứng enzyme tyrosinase nồng độ 50mg/ml, sử dụng để so sánh với enzyme sau bị ức chế dịch chiết ba loại tảo Từ thấy khả ức chế enzyme ba dịch chiết tảo ethyl acetate Kết trình bày bảng 4.10 Bảng 4.10 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol (96%) Nồng độ (µg/ml) 50 200 400 800 S.platensis1 1.307±0.02 0.981± 0.01 0.799±0.02 0.753±0.05 S.platensis 1.394±0.01 1.221±0.03 1.091±0.01 0.978±0.02 S.platensis 1.332±0.02 1.107±0.01 0.996±0.01 0.898±0.02 Arbutin 1.675±0.01 1.297±0.01 0.882± 0.01 0.688±0.01 Enzyme đối chứng 1.825 Mẫu cao chiết 49 Biểu đồ 4.5 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol (96%) Kết bảng 4.11 cho thấy cường độ huỳnh quang bước sóng 492 nm ba dịch chiết tảo giảm dần tăng nồng độ dịch chiết Điều chứng tỏ dịch chiết tảo có khả ức chế enzyme tyrosinase Tuy nhiên, mức độ ức chế cao so với dịch chiết ethanol Trong số dịch chiết thử nghiệm, dich chiết tảo xoắn S.platensis cho khả ức chế enzyme cao nồng độ 800 (µg/ml), tiếp S.platensis thấp dịch chiết S.platensis Bảng 4.11 Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại dịch chiết tảo dung mơi ethanol (96%) Nồng độ (µg/ml) 50 200 400 800 S platensis 29,815±0,74 47,263±0,55 56,735±1,92 59,212±1,77 S platensis 24,98±1,12 33,556±2,31 41,731±1,26 47,58±2,92 S platensis 28,249±0,92 40,515±1,89 46,925±2,1 51,375±2,05 Mức độ ức chế (%) 50 70 Mức độ ức chế (%) 60 50 40 30 20 10 S.platensis S.platensis S.platensis Dịch chiết với nòng độ khác (mg/ml) 50 200 400 800 Biểu đồ 4.6 Mức độ ức chế enzyme dịch chiết ethanol Kết bảng 4.11; 4.12 cho thấy dịch chiết biểu có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinae mức độ ức chế tỉ lệ với nồng độ dịch chiết Trong số dịch chiết tảo xoắn S platensis 1, S platensis 3, S platensis khả ức chế enzyme tyrosinase tảo xoắn S platensis thể khả ức chế enzyme cao nồng độ 800 (µg/ml), tiếp S platensis thấp dịch chiết S platensis Mức độ ức chế enzyme tyrosinase S platensis 1, S platensis 3, S platensis 59,0564; 46,8850; 51,1775 (%) Khi so sánh với arbutin (chất có khả ức chế enzyme/đối chứng dương) cho thấy, khả ức chế enzyme dịch chiết thấp đáng kể Trong điều kiện thí nghiệm, nồng độ dịch chiết sử dụng đến 800µg /ml khả ức chế với đạt ngưỡng 15-25% so với đối chứng (phản ứng không bổ sung chất ức chế) 4.3.3 Phân tích động học enzyme tyrosinase có chất ức chế tham gia Khi chất ức chế dịch chiết ba loại tảo S platensis 1, S platensis 3, S platensis bổ sung nồng độ định mà làm tốc độ phản ứng giảm ½ lần nồng độ đạt giá trị IC50 Việc tăng nồng độ chất ức chế dẫn đến cạnh trannh vị trí xúc tác enzyme Khi tăng nồng độ chất ức chế tốc độ phản ứng giảm Km nồng độ chất hoạt tính enzyme đạt ½ vận tốc tối đa 51 Biểu đồ 4.7 Linweaver- Burk plots hoạt động tyrosinase với chất LDOPA nồng độ dịch chiết tảo S platensis 50,200,400 800µg/ml Biểu đồ 4.8 Linweaver- Burk plots hoạt động tyrosinase với chất LDOPA nồng độ dịch chiết tảo S platensis 50,200,400 800µg/ml 52 Biểu đồ 4.9 Linweaver- Burk plots hoạt động tyrosinase với chất LDOPA nồng độ dịch chiết tảo S platensis 50,200,400 800µg/ml Bảng 4.12 Tổng hợp Ic50, mức độ ức chế, Km Vmax ba dịch chiết tảo loại dung môi S platensis S platensis IC50 dung mơi 328,98 ethyl acetate (µg/ml) - 536,47 IC50 dung mơi 273,02 ethanol (µg/ml) - 470,41 Mức độ ức chế 57,2785 dung môi ethy actate (%) 42,8072 53.1488 Mức độ ức chế 59,0564 dung môi ethanol (96%) (%) 46,855 51,1775 Km (mM) 3,3 2,3 2.6 Vmax (µmol min-1) 0,12 0,33 0,25 Dịch chiết S platensis 53 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Ba chủng vi tảo S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis tảo cao chiết chiết dung mơi ethanol (96%) có khả ức chế enzyme tyrosinase cao chiết dung môi ethyl acetate nhiệt độ thời gian Đối với loại tảo Spirulina platensis có giá trị IC50 dung mơi ethanol ethy acetate 328,98 273,02 (µg/ml) Phần trăm ức chế 56,966 59,212% Giá trị đặc trưng cho ức lực enzyme với chất Km 3,3 (mM) Tốc độ phản ứng Vmax 0,12 (µmol min-1) Tảo Spirulina platensis khơng có giá trị IC50 Phần trăm ức chế dung môi ethanol 46,545%; 47,58% Giá trị đặc trưng cho ức lực enzyme với chất Km 2,3 (mM) Tốc độ phản ứng Vmax 0.33 (µmol min-1) Tảo Spirulina platensis có giá trị IC50 dung mơi ethanol ethyl acetate 536,47; 470,41 (µg/ml) Phần trăm ức chế 52,05 51,375% Giá trị đặc trưng cho ức lực enzyme với chất Km 2,6 (mM) Tốc độ phản ứng Vmax 0,25 (µmol min-1) Vậy sàng lọc khả ức chế eyme tyrosinase ba loại tảo trên, nhận thấy loại tảo Spirulina platensis có khả ức chế tốt sau đến tảo Spirulina platensis cuối Spirulina platensis 5.2 Kiến nghị Nghiên cứu thử nghiệm chun sau mức độ in vivo (mơ hình tế bào B16F10 mơ hình cá ngựa) để nghiên cứu khả ức chế enzyme tyrosinase tốt 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdillahi, H.S., Finnie, J.F., Van Staden, J., 2011 Anti-inflammatory, antioxidant, anti-tyrosinase and phenolic contents of four Podocarpus species used in traditional med-icine in South Africa Journal of Ethnopharmacology Vincent J Hearing, 2011 Determination of melanin synthetic pathways The Journal of investigative dermatology, 131(E1), E8–E11 Abuzaid, A.A., Hammad, D.M and Sharaf, E.M., 2015 Antioxidant and anticancer activity of Spirulina platensis water extracts International Journal of Pharmacology Akhtar, M.N., Sakeh, N.M., Zareen, S., Gul, S., Lo, K.M., Ul-Haq, Z., Shah, S.A.A., Ahmad, S., 2015 Design and synthesis of chalcone derivatives as potent tyrosinase inhibitors and their structural activity relationship Alam, M.N., Bristi, N.J., Rafiquzzaman, M., 2013 Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity Ali Nawaz, Taha Shafi, Abdul Khaliq, Hamid Mukhtar, Ikram ul Haq Institute of Industrial Biotechnology, GC University Lahore, Pakistan (2017) Tyrosinase: Sources, Structure and Applications by Asieh Bahrami, Mahmud Tareq Hassan Khan, J Munoz-Munoz, F GarciaMolina,F Garcia-Canovas, and Ali Akbar Saboury (2019) A comprehensive review on tyrosinase inhibitors by Bradford, M.M., 1976 A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Burnett C L Bergfeld W F MD FACP Belsito D V MD Hill R A Klaassen C D Liebler D C Marks J G Jr MD Shank R C Slaga T J Snyder P W DVM and Andersen F A (2010) Final Report of the Safety Assessment of Kojic Acid as Used in Cosmetic International Journal of Toxicology, 29 pp 244S-273S 55 10 Cengiz Sahin, S (2018) The potential of Arthrospira platensis extract as a tyrosinase inhibitor for pharmaceutical or cosmetic applications South African Journal of Botany, 119, 236–243 11 Duh, P D., Yen, D B and Yen, G C., 1992 Extraction and identification of an antioxidative component from edible oils Food Chemistry 12 GS.TS Mai Xuân Lương (2015) Giáo trình Enzyme 13 Jean-Yves Berthona , Rachida Nachat-Kappesa , Mathieu Beya , Jean-Paul Cadoreta , Isabelle Renimela and Edith Filaire (2017) Marine algae as attractive source to skin care 14 Miyake, T and Shibamoto, T., 1997 Antioxidative activities of natural compounds found in plants Journal of Agricultural Food Chemistry 15 Mukherjee, P.K., Biswas, R., Sharma, A., Banerjee, S., Biswas, S., Katiyar, C.K (2018) Validation of medicinal herbs for anti-tyrosinase potential Journal of Herbal Medicine, 16 Nguyễn Lê Anh Đào , Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trần Minh Phú (2018) Ảnh hưởng dung môi chiết tách đến hoạt tính chống oxy hóa cao chiết từ bột tảo Spirulina (Anthrospira platensis) 17 Phạm Đức Thuận (2016) Nghiên cứu đặc điểm sinh học công nghệ nuôi vi tảo biển Nannochloropsis oculata sử dụng làm thực phẩm chức 18 S Cengiz Sahin in Molecular Biology and Genetic Department, Science and Arts Faculty, Pamukkale University, Denizli, Turkey)( 2017)The potential of Arthrospira platensis extract as a tyrosinase inhibitor for pharmaceutical or cosmetic applications 19 Samaneh Zolghadri, Asieh Bahrami, Mahmud Tareq Hassan Khan, J Munoz-Munoz, F Garcia-Molina, F Garcia-Canovas, and Ali Akbar Saboury (2019) A comprehensive review on tyrosinase inhibitors 20 Sevilay Cengiz Sahin (2019) Scenedesmus obliquus: A Potential Natural Source for Cosmetic Industry 56 21 Sevilay Cengiz Sahin in Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Science and Art, Pamukkale University, Denizli, Turkey (2019) Scenedesmus obliquus: A Potential Natural Source for Cosmetic Industry 22 Yen, G.C., Chen, H.W and Duh, P.D., 1998 Extraction and identificaion of an antioxidative component from Jue Ming Zi (Cassia tora L.) Journal of Agricultural Food Chemistry 23 Zolghadri, S., Bahrami, A., Khan, M.T.H., Munoz-Munoz, J., GarciaMolina, F., Garcia-Canovas, F., Saboury, A.A (2019) A comprehensive review on tyrosinase inhibitors Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 34, 279–309 57