HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO PHƠI BỊ THỊT IN VITRO HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO PHƠI BỊ THỊT IN VITRO Ngƣời thực : NGUYỄN THỊ LAN ANH Lớp : K63CNSHA Mã sinh viên : 637003 Giảng viên hƣớng dẫn : TS NGUYỄN KHÁNH VÂN PGS TS NGUYỄN XUÂN CẢNH HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực, chƣa đƣợc sử dụng công bố luận văn, luận án cơng trình khoa học trƣớc Các thơng tin, trích dẫn đƣợc sử dụng khóa luận đƣợc ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo quy định Nếu không nhƣ nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài mình! Hà Nội, ngày 06 tháng 07 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Lan Anh i LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám đốc Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi, nơi em thực tập khóa luận tốt nghiệp tạo điều kiện thuận lợi để em đƣợc học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Để hồn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp em nhận đƣợc hƣớng dẫn khoa học TS Nguyễn Khánh Vân PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh Em xin gửi tới thầy hƣớng dẫn lịng biết ơn sâu sắc tận tình giúp đỡ, động viên dìu dắt em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Khóa luận tốt nghiệp khó hồn thành khơng nhận đƣợc hỗ trợ Th.S Vũ Thị Thu Hƣơng; chị Phạm Thị Kim Yến; chị Nguyễn Thị Lệ Hƣơng; chị Hoàng Thị Âu cán Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi Em trân trọng giúp đỡ quý báu Xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ, giảng viên môn Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam bảo, hƣớng dẫn em q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè động viên, ủng hộ, giúp đỡ em suốt trình thực tập tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng 07 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Lan Anh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa nghiên cứu 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Buồng trứng trình hình thành tế bào trứng 2.1.1 Quá trình hình thành, cấu tạo hoạt động buồng trứng bò 2.1.2 Cấu tạo hình thành tế bào trứng 2.2 Cấu tạo tinh trùng trình hình thành tinh trùng 2.2.1 Cấu tạo tinh trùng 2.2.2 Quá trình hình thành tinh trùng 2.3 Sự thành thục in vitro tế bào trứng bò (IVM) 10 2.3.1.Sự thành thục nhân tế bào trứng 10 2.3.2 Sự thành thục tế bào chất 11 2.3.3 Vai trò tế bào cumulusđến thành thục tế bào trứng 12 iii 2.3.4 Vai trị mơi trường ni thành thục in vitro tế bào trứng bò 13 2.4 Thụ tinh ống nghiệm (in vitro) 14 2.4.1 Khái niệm thụ tinh 14 2.4.2 Quá trình thụ tinh in vitro 15 2.5 Nuôi phôi ống nghiệm (in vitro) 17 2.5.1 Q trình phát triển phơi 17 2.5.2 Môi trường nuôi phơi bị in vitro 17 2.6 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 19 III ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 20 3.2 Nội dung nghiên cứu 20 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Phương pháp thu buồng trứng bò từ lò mổ 20 3.3.2 Phương pháp thu tế bào trứng bò từ buồng trứng lò mổ 20 3.3.3 Phân loại tế bào trứng bò sau thu 21 3.3.4.Phương pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng bò 22 3.3.5 Phương pháp đánh giá khả thành thục in vitro tế bào trứng sau nuôi thành thục in vitro 22 3.3.6 Phương pháp thụ tinh in vitro tế bào trứng bò thành thục in vitro 23 3.3.7 Phương pháp nuôi phôi in vitro 24 3.3.8.Phương pháp nhuộm phơi bị với Hoechst 33342 24 3.3.9 Phương pháp xử lí số liệu 24 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Đánh giá chất lƣợng tế bào trứng bò thu từ buồng trứng bò lò mổ 25 4.2 Đánh giá khả thành thục in vitro tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ 27 4.3 Đánh giá khả tạo phơi bị in vitro từ tế bào trứng bò thu từ lò mổ 30 iv 4.3.1 Đánh giá khả xâm nhập tinh trùng vào tế bào trứng bò sau thụ tinh in vitro 30 4.3.2 Đánh giá khả tạo phôi bò in vitro tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ 32 V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT IVM In vitro Maturation IVF In vitro Fertilization NST Nhiễm sắc thể FSH Follicle Stimulating Hormone LH Luteinizing Hormone IGF-I Insulin-like Growth CR1aa Môi trƣờng dịch ống dẫn trứng tổng hợp BSA Albumin huyết bò FCS Huyết thai bê (Fetal calf serum) SOF Môi trƣờng dịch ống dẫn trứng tổng hợp vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Chất lƣợng tế bào trứng bò thu từ buồng trứng bò thịt lò mổ 25 Bảng Khả thành thục in vitro tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ 27 Bảng Khả xâm nhập tinh trùng vào tế bào trứng bò sau thụ tinh in vitro 30 Bảng Khả tạo phơi bị in vitro tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ 33 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Cấu tạo buồng trứng Hình Hình dạng cấu tạo tinh trùng bò Hình Thu tế bào trứng bị phƣơng pháp chọc hút 21 Hình Phân loại tế bào trứng trƣớc nuôi 22 Hình Tế bào trứng sau loại bỏ tế bào cumulus có xuất thể cực thứ 23 Hình Buồng trứng bị thịt thu lị mổ 26 Hình Tế bào trứng bò loại A, B sau thu 26 Hình Tế bào trứng bò với xuất thể cực thứ 28 Hình Tế bào trứng bị sau ni thành thục in vitro 29 Hình 10 Tế bào trứng khơng có tinh trùng xâm nhập sau thụ tinh in vitro (có tiền nhân thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro) 31 Hình 11 Tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập sau thụ tinh in vitro (có tiền nhân thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro) 32 Hình 12 Phơi bị phân chia ngày thứ sau thụ tinh in vitro 33 Hình 13 Phơi nang bị ngày thứ sau thụ tinh in vitro 34 Hình 14 Phơi nang bị in vitro đƣợc nhuộm Hoechst 33342 để kiểm tra tổng số tế bào/phôi nang 35 viii 4.2 Đánh giá khả thành thục in vitro tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lị mổ Chúng tơi đánh giá khả thành thục in vitro tế bào trứng bò dựa khả sống thành thục tế bào trứng sau nuôi thành thục in vitro Các tế bào trứng sống sau nuôi thành thục tế bào trứng có tế bào chất đồng nguyên vẹn, màng tế bào chất không bị tổn thƣơng Các tế bào trứng thành thục in vitro tế bào trứng xuất thể cực thứ (Hình 8) sau ni thành thục in vitro Kết thể bảng Bảng Khả thành thục in vitro tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ Thí nghiệm Số tế bào Số tế bào trứng % số tế bào trứng Số tế bào trứng trứng nuôi sống sau nuôi sống sau nuôi thành thục sau nuôi thành thục thành thục in vitro thành thục in vitro thành thục in vitro (%Mean ± SE) % số tế bào trứng thành thục sau nuôi thành thục in vitro (%Mean ± SE) 31 24 77,42 23 74,19 53 47 88,68 45 84,91 68 62 91,18 56 82,35 46 40 86,96 39 84,78 25 23 92 20 80 36 33 91,67 30 83,33 41 40 97,56 38 92,68 58 49 84,48 41 70,69 Tổng 358 318 88,96 ± 2,09 292 81,74 ± 2,44 27 Lý giải cho tƣợng tế bào trứng bị thu từ buồng trứng lị mổ chết sau ni thành thục in vitro thời gian từ lúc thu buồng trứng lò mổ lúc kết thúc trình thu tế bào trứng thƣờng kéo dài 3-5 tiếng, điều ảnh hƣởng đến khả sống tế bào trứng Kết nuôi thành thục in vitro tế bào trứng bị chúng tơi cao so với Nguyễn Hữu Đức cs (2003), Nguyễn Văn Lý (2006) (tƣơng ứng 81,74% so với 65,61% 76,83%) nhƣng lại thấp so với Nguyễn Thị Hƣơng cs (2015) (tƣơng ứng 81,74% so với 89,31%) Sự khác kết nghiên cứu nguồn gốc chất lƣợng tế bào trứng, môi trƣờng nuôi thành thục in vitro… Thể cực thứ Hình Tế bào trứng bị với xuất thể cực thứ Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng 358 tế bào trứng bị loại A, B thu đƣợc từ buồng trứng lò mổ Kết bảng cho thấy tỷ lệ tế bào trứng sống sau nuôi thành thục in vitro đạt 88,96%, tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro đạt 81,74% Môi trƣờng nuôi thành thục yếu tố có vai trị quan trọng ảnh hƣởng đến khả thành thục in vitro tế bào trứng bò sau nuôi thành thục in vitro Trong nghiên cứu bổ sung FSH vào môi 28 trƣờng nuôi thành thục in vitro tế bào trứng bò FSH (Follicle Stimulating hormone) hormone có tác dụng tích cực đến trình thành thục in vitro tế bào trứng, kích thích phát triển tế bào trứng Biểu đặc trƣng tế bào trứng thành thục giãn nở tế bào cumulus bao xung quanh (Hình 9) với xuất thể cực thứ (Culter cs., 2015) Hình Tế bào trứng bị sau ni thành thục in vitro Sự giãn nở tế bào cumulus có vai trị quan trọng cho thành cơng q trình thụ tinh hỗ trợ cho di chuyển tinh trùng tiến tới tế bào trứng trình thụ tinh (Widayati Pangestu, 2015) Sự có mặt FSH kích thích q trình thành thục nhân tế bào trứng thành thục tế bào chất Bên cạnh đó, FSH cịn hỗ trợ cho giãn nở tế bào cumulus, qua nâng cao hiệu trình thụ tinh phát triển đến giai đoạn phôi nang tế bào trứng sau thụ tinh (Widayati Pangestu, 2020) Nguyễn Thị Hƣơng cs (2015) nhận thấy việc bổ sung FSH vào môi trƣờng nuôi thành thục in vitro tế bào trứng bò làm tăng tỷ lệ tế bào trứng bị thành thục sau ni thành thục in vitro 29 4.3 Đánh giá khả tạo phôi bò in vitro từ tế bào trứng bò thu từ lò mổ 4.3.1 Đánh giá khả xâm nhập tinh trùng vào tế bào trứng bò sau thụ tinh in vitro Trong nghiên cứu này, đánh giá khả xâm nhập tinh trùng vào tế bào trứng sau thụ tinh in vitro dựa tỷ lệ tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro Tế bào trứng khơng có tinh trùng xâm nhập tế bào trứng có tiền nhân (Hình 10), tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập tế bào trứng có từ tiền nhân trở lên sau thụ tinh in vitro (Hình 11) Kết thể bảng Bảng Khả xâm nhập tinh trùng vào tế bào trứng bị sau thụ tinh in vitro Thí nghiệm Số tế bào trứng thụ tinh Tế bào trứng có tinh Tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập trùng xâm nhập Có tiền nhân Có > tiền nhân n, % (Mean ± SE) n, % (Mean ± SE) n, % (Mean ± SE) 14 12 (85,71) 11 (78,57) (7,14) 13 10 (76,92) 10 (76,92) (0) 11 (72,73) (72,73) (0) 10 (90) (80) (10) 12 (66,67) (66,67) (0) 17 13 (76,47) 13 (76,47) (0) 15 11 (73,33) 11 (73,33) (0) 16 13 (81,25) 13 (81,25) (0) Tổng 108 84 82 77,96 ± 2,45 76,02 ± 1,66 2,14 ± 1,42 Kết thể bảng cho thấy, tỷ lệ tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro đạt 77,96%; tỷ lệ tế bào trứng có tiền nhân đạt 76,02% tỷ lệ tế bào trứng có > tiền nhân đạt 2,14% Tỷ lệ tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro 30 thấp so với Nguyễn Khánh Vân cs (2021) Theo Nguyễn Khánh Vân cs (2021), tỷ lệ tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro đạt 80,91% Hình 10 Tế bào trứng khơng có tinh trùng xâm nhập sau thụ tinh in vitro (có tiền nhân thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro) Hiện tƣợng tế bào trứng có > tiền nhân thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro đƣợc gọi đa tinh trùng Đây tƣợng có nhiều tinh trùng xâm nhập đƣợc vào bên tế bào trứng Trong trình thụ tinh in vitro, số lƣợng tinh trùng đƣợc sử dụng nhiều so với trình thụ tinh in vivo (Van Soom cs., 2002) Đa tinh trùng tƣợng phổ biến trình thụ tinh in vitro tế bào trứng bò nhiều nguyên nhân chƣa đƣợc làm rõ Hiện tƣợng đa tinh trùng có liên quan đến mức độ hóa rắn màng zona pellucida (Massimiliano cs., 2012) Khi mức độ hóa rắn màng zona pellucida q trình thụ tinh khơng đủ làm cho tinh trùng dễ xâm nhập vào bên tế bào trứng hơn, qua làm tăng số lƣợng tinh trùng xâm nhập vào bên tế bào trứng dẫn đến tƣợng tế bào trứng đa tinh trùng sau thụ tinh cao 31 Hình 11 Tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập sau thụ tinh in vitro (có tiền nhân thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro) 4.3.2 Đánh giá khả tạo phơi bị in vitro tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ Để đánh giá hiệu tạo phơi bị in vitro tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ, dựa tỷ lệ tế bào trứng phân chia (Hình 12), tỷ lệ tạo phơi nang (Hình 13) ngày thứ thứ sau thụ tinh in vitro; trung bình tổng số tế bào/phơi nang.Để đếm tổng số tế bào/phôi nang sử dụng kỹ thuật nhuộm phơi với Hoescht 33342 (Hình 14) Kết thể bảng Kết bảng cho thấy, tỷ lệ tế bào trứng phân chia, tỷ lệ tạo phôi nang ngày thứ thứ sau thụ tinh in vitro tƣơng ứng đạt 77,34% 31,06% Tỷ lệ tế bào trứng bò phân chia ngày thứ sau thụ tinh in vitro thấp so với Nguyễn Khánh Vân cs (2021) (tƣơng ứng 77,34% so với 80,04%), nhƣng cao so với Đỗ Kim Lành cs (2021) (tƣơng ứng 77,34% so với 76,34%) Tuy nhiên tỷ lệ tạo phôi nang ngày thứ sau thụ tinh in vitro thấp so với Nguyễn Khánh Vân cs (2021), Đỗ Kim Lành cs (2021) (tƣơng ứng 31,06% so với 35,68% 34,16%) Sự khác 32 kết nghiên cứu chất lƣợng tế bào trứng, chất lƣợng tinh trùng, môi trƣờng ni phơi….giữa phịng thí nghiệm Bảng Khả tạo phơi bị in vitro tế bào trứng bị thu từ buồng trứng lị mổ Thí nghiệm Số tế bào trứng thụ tinh Phân chia Phôi nang n, % (Mean ± SE) n, % (Mean ± SE) Trung bình tổng số tế bào/phơi nang (Mean ± SE) (88,89) (22,22) 114,06 32 24 (75) 12 (37,5) 111,04 45 34 (75,56) 13 (28,89) 96,04 29 22 (75,86) (31,04) 102,04 (87,5) (37,5) 91,02 13 (69,23) (30,77) 90,04 23 19 (82,61) (26,09) 108,04 25 19 (76) (36) 109,08 Tổng 184 142 57 77,34 ± 2,41 31,06 ± 1,98 102,67 ± 3,42 Hình 12 Phơi bị phân chia ngày thứ sau thụ tinh in vitro Trong nghiên cứu này, sử dụng mơi trƣờng SOFaa có bổ sung huyết thai bê (FCS) làm mơi trƣờng ni phơi bị in vitro SOFaa môi trƣờng phổ biến đƣợc sử dụng cho q trình ni phơi bị in vitro Mơi trƣờng 33 bao gồm thành phần tƣơng tự môi trƣờng dịch ống dẫn trứng bò nhƣ hormone, yếu tố tăng trƣởng đƣợc bổ sung thêm số acid amin Sự có mặt yếu tố môi trƣờng nuôi phôi làm tăng khả phát triển phôi trƣớc cấy chuyển (Block cs., 2011) Hình 13 Phơi nang bị ngày thứ sau thụ tinh in vitro Trong nghiên cứu này, bổ sung FCS thời điểm sau thụ tinh in vitro Việc bổ sung FCS thời sau thụ tinh nâng cao hiệu tạo phơi bị in vitro Theo Sena-Netto cs (2020), Gosmez cs (2008) việc bổ sung FCS vào môi trƣờng nuôi phôi thời điểm ngày sau thụ tinh đẩy nhanh phát triển phôi dâu đến giai đoạn phôi nang Mặc dù nay, vai trị FCS đến phát triển phơi chƣa đƣợc hồn tồn hiểu rõ, nhiên có liên quan đến yếu tố tăng trƣởng, acid amin khả chống oxy hóa FCS môi trƣờng nuôi phôi Các yếu tố giúp tăng tỷ lệ tạo phôi nang, chất lƣợng phôi tạo từ mơi trƣờng ni có FCS tốt khơng có FCS (Sena-Netto cs., 2020) 34 Việc bổ sung FCS vào môi trƣờng nuôi phôi cải thiện tăng sinh tế bào hỗ trợ trình giãn nở phơi (Neira cs., 2010) Bên cạnh đó, có mặt FCS mơi trƣờng ni phơi làm giảm tƣợng apoptosis tế bào Apoptosis đóng vai trị quan trọng phát triển phơi, hoạt động nhƣ biện pháp kiểm sốt chất lƣợng thơng qua chế loại bỏ tế bào bất thƣờng bị hỏng không hoạt động (Sena-Netto cs., 2020) Hình 14 Phơi nang bị in vitro đƣợc nhuộm Hoechst 33342 để kiểm tra tổng số tế bào/phôi nang Mặc dù FCS hỗ trợ cho phát triển phơi bị, nhiên nghiên cứu chúng tơi bổ sung FCS vào mơi trƣờng ni phơi bị in vitro nồng độ 2,5% (v/v) Theo Sudano cs (2011) diện FCS môi trƣờng ni phơi làm tăng hàm lƣợng lipid phơi bị in vitro, điều khơng có lợi cho q trình bảo quản lạnh phơi bị in vitro Do đó, việc giảm nồng độ FCS xuống 2,5% (v/v) môi trƣờng ni phơi bị in vitro cần thiết để trì hiệu tạo phơi nang bị in vitro có chất lƣợng Chất lƣợng phôi nang yếu tố cần thiết để khẳng định tỷ lệ có chửa sau cấy chuyển phơi (Rizos cs., 2003) Trung bình tế bào/phơi nang (Hình 14) đƣợc coi thƣớc đo chất lƣợng phơi mức độ Trong nghiên cứu 35 trung bình tổng số tế bào/phơi nang đạt 102,67 tế bào/phôi nang Kết thấp so với Fatehi cs (2005, Nguyễn Khánh Vân cs (2021) Sự khác kết nghiên cứu chất lƣợng tế bào trứng, chất lƣợng tinh trùng, môi trƣờng nuôi phôi in vitro 36 V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Các kết nghiên cứu cho thấy: - Trung bình thu đƣợc 7,78 tế bào trứng bò loại A, B/buồng trứng phƣơng pháp chọc hút từ buồng trứng bò thịt lò mổ - Tỷ lệ tế bào trứng bò sống thành thục in vitro sau nuôi thành thục môi trƣờng nuôi thành thục in vitro tƣơng ứng đạt 88,96% 81,74% - Tỷ lệ tế bào trứng bị có tinh trùng xâm nhập, tỷ lệ tế bào trứng có tiền nhân sau thụ tinh in vitro tƣơng ứng đạt 77,96% 76,02% - Tỷ lệ tế bào trứng bò phân chia, tạo phôi nang sau thụ tinh in vitro tƣơng ứng đạt 77,34% 31,06% - Trung bình tổng số tế bào/phơi nang đạt 102,67 5.2 Đề nghị Có thể sử dụng phơi bị thịt in vitro đƣợc tạo từ tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ làm nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu phơi bị nhƣ: đơng lạnh phơi bị, tạo phơi bị chuyển gen, cấy chuyển phơi bị… 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt Đỗ Thị Kim Lành, Nguyễn Thị Ngọc Anh, Hoàng Thị Kim Chi, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Bá Trƣờng, Sử Thanh Long, Nguyễn Văn Thành 2021 Nghiên cứu nâng cao hiệu tạo phơi bị thụ tinh ống nghiệm Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 19(1): 25-32 Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ƣớc, Lê Văn Ty, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thùy Anh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên 2003 Kết thụ tinh ống nghiệm cấy phơi bị lai Sind Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội: 699-702 Nguyễn Mộng Hùng 1993 Bài giảng Sinh học phát triển NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Hƣơng, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Khánh Vân, Đỗ Văn Hƣơng, Vũ Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Lệ Hƣơng 2015 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi trứng, nuôi phôi lên hình thành phát triển phơi bị sữa cao sản Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, số 2(9): 17-22 Nguyễn Khánh Vân, Phạm Thị Kim Yến, Vũ Thị Thu Hƣơng, Phạm Doãn Lân 2021 Ảnh hƣởng tế bào cumulus đến hiệu thụ tinh tạo phơi bị in vitro Tạp chí Khoa học Kỹ thuật chăn nuôi số 271 Nguyễn Văn Lý 2006 Luận án tiến sỹ Nông nghiệp Viện Chăn nuôi Phan Lê Sơn 2013 Luận án tiến sỹ Học Viện Nông nghiệp Việt Nam * Tài liệu tiếng Anh Bearden, H J., & Fuquay, J W (2000) Applied animal reproduction (5th edition) Upper Saddle River, NJ: Prentice-Hall Block J, Hansen PJ, Loureiro B, Bonill L 2011 Improving post-transfer survival of bovine embryos produced in vitro: actions of insulin-like growth factor-1, colony stimulating factor-2 and hyaluronan Theriogenology 76: 1602-1609 Brackett BG, Oliphant G 1975 Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro Biol Reprod, 12(2): 260-274 Byskov AG, Hoyer PE 1994 Embryology of mammalian gonads andducts In: Knobil E, Neill JD, editors The physiology of reproduc-tion, 2nd ed New York: Raven Press, Ltd p 487–540 Culter S, May-Tal MD, Vega MMD, Keltzt MMD, McGovern PGM 2015 In vitro maturation and its role in clinical assisted reproductive technology Obstetr Gynecol Surv, 70(1): 45-57 38 DeFelici M and Pesce M (1994) Growth factors in mouse primordial germ cellmigration and proliferation Prog Growth Factor Res 5,135±143 Dyce, A.L & Wirth, W.W (1966) Reappraisal of some Indian Culicoides species in the subgenus Avaritia (Diptera: Ceratopogonidae) International Journal of Entomology 25 (2–3), 221–225 Dyce, K.M., Sack, W.O and Wensing, C.J.G (1987): Textbook of Veterinary Anatomy W.B Saunders Company, Philadelphia, London, Torono Erickson B 1966 Development and senescence of the postnatal bovine ovary J Anim Sci 1966a;25:800–805 10 Fatehi AN, Bernard AJR, Ben C, Eric JS, Bart MG, Mart MB and Rob van den H 2005 Presence of cumulus cells during in vitro fertilization protects the bovine oocyte against oxidative stress and improves first cleavage but does not affect further development Zygote 13 (May): 177-185 11 French-Constant, R H and Roush, R T 1991 Resistance detection and docmentation; the relative roles of pesticidal and biochemical assays In “Pesticide Resistance to Arthropods” ( R T Roush and B E Tabashnik, Eds.), pp 4–38 Chapman and Hall, New York 12 Galli C and Lazzari G 2008 The manipulation of gametes and embryos in farm animals Reprod Domestic Anim 43: 1-7 13 Gardner, (1994) Intelligence in Theory and Practice: A Response to Elliot W Eisner, Robert J Sternberg, and Henry M Levin Teachers College Record, 95, 576-583 14 Godin I., Wylie CC TGF beta inhibits proliferation and has a chemo-tropic effect on mouse primordial germ cells in culture Development 1991; 113: 1451– 1457 15 Gopichandran N, Leese H J 2006 The effect of paracrine/ autocrine interactions on the in vitro culture of bovine preimplantation embryos Reproduction, 131, 269–277 16 Gordon, (2003) The Meanings and Implications of Convergence In K Kawamoto (Ed.), Digital Journalism: Emerging Media and the Changing Horizons of Journalism (pp 57-74) 17 Gosmez E, Rodríguez A, Moz M, Caam0 JN, Hidalgo CO, Morán E, Facal N, Díez C 2008 Serum free embryo culture medium improves in vitro survival of bovine blastocysts to vitrification Theriogenology 69: 1013-1021 18 Hirshfield , A & Desanti , A M ( 1995 ) Patterns of ovarian cell proliferation embryonic period and the first three weeks postpartum Biology of Reproduction , 53 , 1208-1221 19 Johan E J Smitz and Rita G Cortvrindt 2002 The earliest stages of folliculogenesis in vitro Reproduction 123, 185–202 39 20 Jurandy 2015.Visual rhythm-based time series analysis for phenology studies ICIP: 4412-4416 21 Massimiliano P, Roberto B, Giuseppe F, Maria CF, Luciano L, Giuseppe M, Maurizio M, Carmine P, Tiziana P, Michela R, Lakamy S, Fulvio U, Marco DS 2012 Whole –depth change in bovine zona pellucida biomechanics after fertilization: How relevant in hindering polyspermy? PLOS ONE Vol 7, Issue 9, e45696: 1-7 22 Massimo de felici* and maurizio pesce 1994 Growth factors in mouse primordial germ cell migration and proliferation Pro,crrss in gnrnlh facror rewonh Vol , 135 143 23 Moore M, et al (2007) Arg-Pro-X-Ser/Thr is a consensus phosphoacceptor sequence for the meiosis-specific Ime2 protein kinase in Saccharomyces cerevisiae Biochemistry 46(1):271-8 24 Neglia G, Marin M, Di Palo R, Wilding M, Caracciolo di Brienza V, Dale B, Gasparrini B, Zicarelli L 2001 A comparison of in vitro maturation in buffalo (Bubalus bubalis) and bovine oocytes using confocal microscopy Theriogenology 55:488 25 Neira JA, Tainturier D, Pena MA, Martal J 2010 Efect of the association of IGF-I, IGF-II, bFGF, TGF-β1, GM-CSF and LIF on the development of bovine embryos produced in vitro Theriogenology 73: 595-604 26 Park, (1989) Causes and consequences of life-satisfaction among primary, junior high, senior high school students Korean Journal of Health Psychology, 5, 94-118 27 Rizos D, A Gutierrez-Adan, S Perez-Garnelo, J De La Fuente, M.P Boland and P Lonergan.2003 Bovine embryo culture in the presence or absence of serum: Implications for blastocyst development, cryotolerance, and messenger rna expression Biol Reprod 68: 236-243 28 Russell, 1983 Use by juvenile barramundi, Lates calcarifer (Bloch), and other fishes of temporary supralittoral habitats in a tropical estuary in northern Australia Aust J Mar Freshwat Res 34(5):805-811 29 Sagirkaya H, Misirlioglu M, Kaya A, First N L, Parrish J J, Memili E 2006 Developmental and molecular correlates of bovine preimplantation embryos Reproduction, 131, 895-904 30 Sena-Netto SB, Spricigo JFW, Leme LO, Guimaraes ALS, Caixeta FMC, Dode MAN and Pivato I 2020 The replacement of fetal bovine serum with bovine serum albumin during oocytes maturation and embryo culture does not improve blastocyst quality after slow freezing cryopreservation Biopreservation and Biobanking, Vol 18, No 3: 171-179 31 Senger, 1997.The function and interaction of `on' and `off' transients in vision II Neurophysiology Experimental Brain Research, 19 (1974), pp 507-523 40 32 Siard MA, Richard F, Blondin P, Robert C 2006 Contribution of the oocytes to embryo quality Theriogenology 65: 126-136 33 Smitz and Cortvrindt 2002 The earliest stages of folliculogenesis in vitro Reproduction 123, 185–202 34 Sudano MJ, Paschoal DM, Rascado Tda S, Magalhãé LC, Crocomo LF, de LimaNeto JF, da Cruz Landim-Alvarenga F 2011 Lipid content and apoptosis of in vitro produced bovine embryos as determinants of susceptibility to vitrification Theriogenology, 75(7): 1211-1220 35 Swain, (2010) Gravitatomagnetic Analogs of Electric Transformers arXiv: 1006.5754 36 Tervit, H R., Whittingham, D C and Rowson, L E A (1972) Successful culture in vitro of sheep and cattle ova J Reprod Fert 30, 493-497 37 Thompson, R K ; Mustafa, A F ; McKinnon, J J ; Maenz, D ; Rossnagel, B., 2000 Genotypic differences in chemical composition and ruminal degradability of oat hulls Can J Anim Sci., 80 (2): 377-379 38 Van Soom A, Tanghe S, De Pauw I, Maes D and de Kruif A 2002 Function of the cumulus oophorus before and during mamalian fertilization Reprod Dom Anim 37: 144-151 39 Widayati DT and Pangestu M 2015 In vitro maturation rate of Bligon goat oocytes supplemented with gonadotropin In: Proceeding of the 6th International seminar on Tropical Animal Production Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia 40 Zeron YA, Ocheretny O, Keda A, Borochov D, Skla Arav A 2001 Seaonal changes in bovine fertility: relation to developmental competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition of follicles Reproduction, 121: 447-454 41