HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO CÂY TRẦU BÀ XANH (EPIPREMNUM AUREUM ) BẰNG XỬ LÝ SODIUM AZIDE” Sinh viên thực : Nguyễn Thúy Nga Giảng viên hƣớng dẫn : TS Ninh Thị Thảo Mã sinh viên : 637340 Lớp : K63CNSHD Bộ Môn : Công nghệ sinh học Thực vật Khoa :Công nghệ sinh học HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan kết đề tài khóa luận tốt nghiệp ―Nghiên cứu tạo đột biến in vitro trầu bà xanh (Epipremnum aureum) xử lý sodium azide‖ trung thực Đề tài đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn TS Ninh Thị Tất số liệu, bảng hình ảnh đƣợc lấy từ thực tiễn trình thực đề tài khóa luận Một lần em xin cam đoan chịu trách nhiệm với số liệu kết đƣợc sử dụng đề tài khóa luận Hà Nội, ngày 10 tháng 07 năm 2022 Ngƣời thực Nguyễn Thúy Nga i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc đề tài khóa luận tốt nghiệp, lời cho phép em đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới: - Các thầy (cô) khoa Công nghệ sinh học, đặc biệt thầy (cô) Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - TS Ninh Thị Thảo – ngƣời hƣớng dẫn, bảo em suốt trình thực đề tài - Bố mẹ, bạn bè ngƣời bên giúp đỡ, động viên em thời gian em thực đề tài Do thân em thiếu kinh nghiệm nên khơng tránh khỏi sai sót thực Em mong nhận đƣợc lời nhận xét, góp ý từ thầy (cơ) để em hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 07 năm 2022 Ngƣời thực Nguyễn Thúy Nga ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT x PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu trầu bà xanh 2.1.1 Sơ lƣợc phân bố 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc tính sinh học sinh thái 2.1.4 Giá trị sử dụng 2.2 Khái quát xử lý đột biến chọn tạo giống trồng 2.2.1 Khái niệm đột biến 2.2.2 Các tác nhân gây đột biến 2.2.3 Cơ chế di truyền đột biến 2.2.4 Kỹ thuật RAPD 2.2.4.1 Giới thiệu kỹ thuật RAPD 2.2.4.2 Những ƣu điểm kỹ thuật RAPD 2.2.4.3 Nhƣợc điểm kỹ thuật RAPD 2.2.4.4 Ứng dụng kỹ thuật RAPD 2.2.5 Giới thiệu Sodium Azide iii 2.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống trồng xử lý đột biến in vitro PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu 12 3.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 12 3.3 Nội dung nghiên cứu 13 3.3.1 Nội dung 1: Xử lý tạo đột biến sodium azide (NaN3) 13 3.3.2 Đánh giá khả sinh trƣởng trì biến dị chồi sau xử lý với NaN3 sau lần cấy chuyển 15 3.3.3 Đánh giá khác di truyền dòng trầu bà xanh đột biến 16 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 3.4.1 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 16 3.4.2 Phƣơng pháp xử lý đột biến 16 3.4.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA trầu bà xanh 16 3.4.4 Phƣơng pháp đánh giá sai khác di truyền thị phân tử RAPD 18 3.4.5 Chỉ tiêu theo dõi 20 3.4.6 Phân tích số liệu 20 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Xử lý tạo đột biến chồi trầu bà xanh (Epipremnum) sodium azide (NaN3) 21 4.1.1 Ảnh hƣởng nồng độ NaN3 đến khả sống sinh trƣởng chồi trầu bà xanh (Epipremnum aureum) 21 4.1.2 Ảnh hƣởng thời gian xử lý NaN3 1,0 mM đến khả sống sinh trƣởng chồi trầu bà xanh 23 4.1.3 Ảnh hƣởng nồng độ NaN3 bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đến khả sống sinh trƣởng chồi trầu bà xanh 26 4.2 Đánh giá trì biến dị chồi trầu bà xanh qua lần cấy chuyển 28 4.2.1 Đánh giá khả sinh trƣởng trì biến dị chồi trầu bà xanh sau xử lý NaN3 nồng độ khác lần cấy chuyển thứ 28 4.2.2 Đánh giá khả sinh trƣởng trì biến dị chồi trầu bà xanh sau xử lý NaN3 thời gian khác lần cấy chuyển thứ 31 4.3 Đánh giá sai khác di truyền dòng biến dị giả định sau xử lý NaN3 thị RAPD 33 iv 4.3.1.Kết xác định nồng độ độ tinh DNA tổng số 34 4.3.2 Kết phân tích RAPD – PCR 35 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 Tài liệu tham khảo nƣớc 41 Tài liệu tham khảo quốc tế 41 PHỤ LỤC 43 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các mồi RAPD đƣợc sử dụng nghiên cứu……………………18 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR………………………………………….19 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR…………………………………… 19 Bảng 4.1 Ảnh hƣởng nồng độ NaN3 đến khả sống sinh trƣởng chồi (sau tuần) ……………………………………………………… 21 Bảng 4.2 Ảnh hƣởng thời gian xử lý NaN3 1,0 mM đến khả sống sinh trƣởng chồi sau tuần…………………………………………… 24 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng nồng độ NaN3 bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đến khả sống sinh trƣởng chồi……………………………….26 Bảng 4.4 Khả sinh trƣởng trì biến dị chồi sau xử lý NaN3 nồng độ khác lần cấy chuyển 1……………………………28 Bảng 4.5 Khả sinh trƣởng trì biến dị chồi sau xử lý NaN3 1,0 mM khoảng thời gian khác lần cấy chuyển 1………………………… 31 Bảng 4.6 Kết kiểm tra nồng độ độ tinh DNA mẫu trầu bà xanh…………………………………………………………………….32 Bảng 4.7 Kết RAPD – PCR………………………………………………33 Bảng 4.8 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu đối chứng mẫu biến dị giả định…………………………………………………………… ……….36 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây trầu bà xanh (Epipremnum aureum)…………………………… Hình 2.2 Cấu trúc 2D Sodium azide (NaN3)……………………………….9 Hình 3.1 Chồi in vitro trầu bà xanh……………………………………….12 Hình 4.1 Chồi trầu bà xanh đƣợc xử lý NaN3 nồng độ khác sau tuần ……………………………………………………………………… 23 Hình 4.2 Chồi trầu bà xanh xử lý NaN3 1,0 mM khoảng thời gian khác sau tuần ………………………………………………… 25 Hình 4.3 Chồi trầu bà xanh nuôi cấy môi trƣờng bổ sung NaN3 nồng độ khác nhau…… 27 Hình 4.4 Chồi in vitro trầu bà xanh sau tuần nuôi cấy mơi trƣờng bổ sung trực tiếp NaN3…………………………………………… ….27 Hình 4.5 Chồi in vitro trầu bà xanh sau tuần cấy môi trƣờng bổ sung NaN3 trực tiếp ……………………………………………………… … 28 Hình 4.6 Chồi trầu bà xanh sau xử lý NaN3 nồng độ khác 60 phút nuôi cấy môi trƣờng MS + mg/l BA + mg/l adenin sulfat lần cấy chuyển 1……………………………… .30 Hình 4.7 Chồi trầu bà xanh sau xử lý NaN3 1,0 mM các khoảng thời gian khác nuôi cấy môi trƣờng trƣờng MS + mg/l BA + mg/l adenin sulfat lần cấy chuyển 1……………………… …… 33 Hình 4.8 Các dịng biến dị giả định (DC) cơng thức đối chứng, (D1) dịng có chiều cao cao vƣợt trội, (D2) dịng có hình thái thon vii dài, (D3) dịng có hình thái tƣơng tự chồi đối chứng nhƣng có nhiều chồi ………… 34 Hình 4.9 Kết phản ứng RAPD – PCR mẫu trầu bà xanh………… 37 Hình 4.10 Sơ đồ hình biết mối tƣơng quan di truyền mẫu đối chứng dòng biến dị giả định trầu bà xanh (N1) mẫu đối chứng, (N2) chiều cao vƣợt trội, (N3) thon dài, (N4) hình thái tƣơng tự đối chứng nhƣng nhiều chồi……………………… ……………………….…… 38 viii BA DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Benzyl adenin CT Công thức DNA Deoxyribonucleic Acid EI Ethylene imin EMS Ethyl methanesulfonate LSD 0.05 Sai khác nhỏ có ý nghĩa MS Môi trƣờng Murashige Skoog, 1962 NMU Nitroso metyl ure PCR Polymerase chain reaction P-value Probability value RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TAE Tris – acetate EDTA ix Dựa vào bảng 4.7, kết nhân PCR mẫu trầu bà xanh với 15 mồi cho thấy tất mồi cho băng đa hình Hình 4.9 Kết phản ứng RAPD – PCR mẫu trầu bà xanh Hệ số tƣơng đồng di truyền phản ảnh mối quan hệ di truyền mẫu, hệ số tƣơng đồng di truyền cao sai khác mặt di truyền nhỏ ngƣợc lại, hệ số tƣơng đồng di truyền nhỏ sai khác mặt di truyền lớn Kết phân tích hệ số di truyền mẫu trầu bà xanh phần mềm NTSYSpc 2.1 đƣợc thể bảng 4.8 Bảng 4.8 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu đối chứng mẫu biến dị giả định DC D1 D2 DC 1,000 D1 0,690 1,000 D2 0,127 0,290 1,000 D3 0,727 0,745 0,290 D3 1,000 Dựa theo hệ số tƣơng đồng di truyền xác định đƣợc bảng 4.9 hệ số tƣơng đồng dòng trầu bà xanh giao động khoảng từ 0,127 – 0,727 37 Hệ số tƣơng đồng di truyền cao 0,727 mẫu có hình thái tƣơng đồng đối chứng nhƣng nhiều chồi mẫu đối chứng Hệ số tƣơng đồng di truyền thấp 0,127 mẫu thon dài đối chứng Từ hệ số tƣơng đồng di truyền, sử dụng phƣơng pháp UPGMA thông qua phần mềm NTSYSpc 2.1, có sơ đồ mối quan hệ dịng trầu bà xanh hình 4.10 4.10 Sơ đồ hình biết mối tƣơng quan di truyền mẫu đối chứng dòng biến dị giả định trầu bà xanh (DC) mẫu đối chứng, (D1) chiều cao vƣợt trội, (D2) thon dài, (D3) hình thái tƣơng tự đối chứng nhƣng nhiều chồi Từ sơ đồ hình 4.9 cho thấy dịng trầu bà xanh biến dị giả định có khác mặt di truyền Dòng biến dị giả định thon dài đối chứng có hệ số tƣơng đồng di truyền 72,7% Mẫu biến dị giả định cao vƣợt trội hình thái tƣơng tự mẫu đối chứng nhƣng nhiều chồi có hệ số tƣơng đồng di truyền 74,5% Từ bảng hệ số tƣơng đồng (Bảng 4.8) sơ đồ hình (Hình 4.9) cho 38 thấy có biến đổi DNA mẫu trầu bà xanh Ta chia mẫu thành nhóm: Nhóm gồm mẫu đối chứng Nhóm nhóm gồm dịng biến dị giả định (chiều cao vƣợt trội) dòng biến dị giả định (hình thái tƣơng tự đối chứng nhƣng có nhiều chồi) Nhóm dịng biến dị giả định (lá thon dài) Qua phân tích khác biệt hệ số tƣơng đồng dòng biến dị giả định với dòng đối chứng cho thấy có biến đổi DNA trầu bà xanh đƣợc xử lý đột biến sodium azide Viện nghiên cứu Nông nghiệp, Đại học Ahmadu Bello Zaria, Nigeria (2007) xử lý hạt cà chua khô sodium azide nồng độ 1,0, 2,0 4,0 mM để xác định ảnh hƣởng đột biến đặc điểm hình thái cà chua Sự khác biệt có ý nghĩa lớn (P 0,05) so la/choi (la) Variable N so la/choi (la) 50 R² 0,16 Adj R² CV 0,08 67,75 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 1,06 0,27 2,06 0,1013 Nong NaN3 (mM) 1,06 0,27 2,06 0,1013 Error 5,80 45 Total 6,86 49 0,13 44 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=0,32332 Error: 0,1288 df: 45 Nong NaN3 (mM) Means n S.E 0,50 0,26 10 0,11 A 2,50 0,53 10 0,11 A B 1,00 0,53 10 0,11 A B 0,00 0,66 10 0,11 B 5,00 0,66 10 0,11 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) he so nhan choi (lan) Variable N he so nhan choi (lan) 50 R² Adj R² 0,82 0,81 CV 23,78 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 1,88 0,47 52,23 0,05) chieu cao choi Variable N R² chieu cao choi 50 0,43 Adj R² CV 0,38 26,03 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 19,00 4,75 8,37 0,05) he so nhan choi (lan) Variable N he so nhan choi (lan) 50 R² 0,46 Adj R² 0,41 CV 55,75 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 0,73 0,18 9,44 0,05) so la/choi (la) Variable N so la/choi (la) 50 R² Adj R² 0,10 0,02 CV 46,02 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 0,79 0,20 1,28 0,2932 thoi gian 0,79 0,20 1,28 0,2932 Error 7,00 45 Total 7,80 49 0,16 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=0,35537 Error: 0,1557 df: 45 thoi gian Means n S.E 60 0,70 10 0,12 A 0,73 10 0,12 A 90 0,90 10 0,12 A 30 0,93 10 0,12 A 120 1,03 10 0,12 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) 51