HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG POLYPHENOL, HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HĨA CỦA DƢỢC LIỆU NGƢU TẤT, HOA NGŨ SẮC Ngƣời thực : Phạm Thị Thoan Mã sinh viên : 637077 Lớp : K63CNSHA Khoa : Công nghệ sinh học Ngƣời hƣớng dẫn : PGS.TS Nguyễn Thanh Hải : TS Nguyễn Thị Thanh Hà HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu, hình ảnh kết báo cáo trung thực, khách quan chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khoa học Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn, tài liệu tham khảo đƣợc rõ nguồn gốc danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Hà Nội, ngày … tháng … năm 2021 Sinh viên Phạm Thị Thoan i LỜI CẢM ƠN Quá trình thực luận văn tốt nghiệp giai đoạn quan trọng ý nghĩa thời sinh viên Trong q trình hồn thành luận văn tốt nghiệp em đƣợc tiếp thu kỹ nghiên cứu kiến thức quý báu trƣớc lập nghiệp Để đạt đƣợc kết này, em xin phép đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến ngƣời giúp đỡ em suốt thời gian học tập trƣờng Em xin phép gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Ban giám đốc, phịng ban Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, Khoa Công nghệ sinh học, thầy cô tận tình giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn tốt nghiệp Với lịng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thanh Hải TS Nguyễn Thị Thanh Hà, ngƣời truyền đạt vốn kiến thức quý báu, tận tình hƣớng dẫn, bảo, giúp đỡ em thời gian nghiên cứu hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn bạn bè, anh chị nhƣ gia đình động viên, quan tâm, giúp đỡ hỗ trợ tạo điều kiện để em hồn thành khóa luận tốt Vì kiến thức, kinh nghiệm nhƣ trình độ lý luận em hạn chế nên luận án tốt nghiệp khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp quý thầy cô để em học hỏi nhiều kiến thức chun mơn hồn thiện báo cáo khóa luận tới Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Phạm Thị Thoan ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC ĐỒ THỊ x TÓM TẮT KHÓA LUẬN xii I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.3 Ý nghĩa II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên 2.2 Ngƣu Tất 2.2.2 Thành phần hóa học Ngƣu Tất 2.2.3 Công dụng dịch chiết Ngƣu Tất 2.3 Hoa Ngũ Sắc 2.3.1 Đặc điểm thực vật Hoa Ngũ Sắc 2.3.2 Thành phần hóa học hoa Ngũ Sắc 2.3.3 Công dụng Hoa Ngũ Sắc 2.4 Polyphenol 2.4.1 Tổng quan polyphenol 2.4.2 Phân loại polyphenol 10 2.4.3 Vai trò polyphenol 13 2.5 Hoạt tính chống oxy hóa 14 2.5.1 Sơ lƣợc gốc tự 14 2.5.2 Tổng quan hoạt tính chống oxi hoá 15 2.5.3 Một số q trình chống oxi hố hợp chất polyphenol 16 iii 2.6 Tổng quan chủng vi khuẩn sử dụng 18 2.7 Một số nghiên cứu Hoa Ngũ Sắc Ngƣu Tất giới nƣớc 20 2.7.1 Một số nghiên cứu Ngƣu Tất 20 2.7.2 Một số nghiên cứu dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc 21 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Vật liệu nghiên cứu 24 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 3.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 24 3.1.3 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 24 3.2 Nội dung nghiên cứu 25 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.3.1 Phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu 25 3.3.2 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết dƣợc liệu vi khuẩn 29 3.3.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polyphenol 35 3.3.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 36 3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 37 IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Xác định đƣờng kính vịng vơ khuẩn dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc Ngƣu Tất theo phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch 38 4.4.1 Xác định đƣờng kính vịng vơ khuẩn dịch chiết dƣợc liệu Ngƣu Tất theo phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch 38 4.4.2 Xác định đƣờng kính vịng vơ khuẩn dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc theo phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch 41 4.2 Kết xác định đƣờng kính vịng vơ khuẩn tinh dầu Hoa Ngũ Sắc theo phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch phƣơng pháp xông 44 4.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dƣợc liệu 45 iv 4.4 Xác định hàm lƣợng polyphenol dƣợc liệu 49 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị 53 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 59 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các thành phần hóa học lá, thân, rễ Hoa Ngũ Sắc Bảng 1: Kết xác định đƣờng kính vịng vơ khuẩn(mm)của dịch chiết Ngƣu Tất chủng vi khuẩn 39 Bảng 2: Kết xác định đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc chủng vi khuẩn 42 Bảng 3: Hoạt tính chống oxi hố chất chuẩn VTME xác định theo phƣơng pháp DPPH tạo nồng độ khác ( AA%) 45 Bảng 4: Hoạt tính chống oxi hố quy đổi VTME (mg) dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc Ngƣu Tất 48 Bảng 5: Sự thay đổi giá trị OD Values theo nồng độ chất chuẩn acid chlorogenic (mg/ml) 50 Bảng 6: Hàm lƣợng polyphenol tổng số quy đổi theo mg acid chlorogenic/ 100mg dƣợc liệu khô dƣợc liệu Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc 51 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Hình ảnh Ngƣu Tất Hình 2: Cấu trúc hóa học Niuxixinsterone D Hình 2.3: Cây hoa ngũ sắc Hình 4: Cấu trúc Flavnoid 10 Hình 5: Phân loại hợp chất polyphenol 11 Hình 6:Công thức cấu tạo hai axit axit hydroxybenzoic hydroxycinnamic 12 Hình 7: Hình ảnh mơ trình hình thành gốc tự đo 15 Hình 8: Sơ đồ chế chống oxy hóa 17 Hình 1: Hình ảnh dƣợc liệu đƣợc nghiền thành bột mịn Hình A hình ảnh bột mịn dƣợc liệu Ngƣu Tất Hình B hình ảnh bột mịn dƣợc liệu hoa Ngũ Sắc 26 Hình 2: Quá trình chuyển dƣợc liệu vào ống falcon 15ml 27 Hình 3: Máy quay chân khơng RE-501 Rotary evaporator 27 Hình 4: Dƣợc liệu sau cô cao pha loãng ống eppendorf 1,5ml bảo quản tủ lạnh 28 Hình 5: Tinh dầu hoa Ngũ Sắc thu đƣợc sau phân ly 29 Hình 6: Sơ đồ mô tả phƣơng pháp trộn khuẩn 30 Hình 7: Đƣờng kính vịng vơ khuẩn tạo dịch chiết dƣợc liệu sau 24 nuôi cấy môi trƣờng thạch Muller Hinton 30 Hình 8: Dụng cụ đục lỗ có đƣờng kính 10mm 31 Hình 9: Máy đo đƣờng kính vịng vơ khuẩn 31 Hình 10: Vùng ức chế có đƣờng kính khơng xác định Edwards-Jones cộng (2004) 33 Hình 11: Hình đĩa khuẩn sau 24h nuôi cấy nhiệt độ 37°C phƣơng pháp xông tinh dầu hoa Ngũ Sắc 33 vii Hình 12: Hình ảnh đĩa khuẩn sau 24h ni cấy nhiệt độ 37°C phƣơng pháp khuếch tán tinh dầu hoa Ngũ Sắc 34 Hình 13: Cơ chế phản ứng chuyển màu xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số, sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu's phenol reagent 35 Hình 14: Máy đo OD 36 Hình 15: Cơ chế phản ứng DPPH với chất chống oxy hóa 37 Hình 1: Hình ảnh đối chứng DMSO khơng tạo vịng vơ khuẩn đĩa thạch chứng minh khả không độc không ảnh hƣởng đến phát triển vi khuẩn ( A) Nhỏ dung dịch DMSO có độ pH lần lƣợt 3, 4, 5, 12, 13; vi khuẩn E coli ATCC 35218 mọc bình thƣờng quanh giếng nhỏ DMSO (B) 38 Hình 2: Kích thƣớc đƣờng kính vịng vơ khuẩn dƣợc liệu Ngƣu Tất chủng vi khuẩn B subtilis Sal (Salmonella ATCC 13311) Hình bên trái kết đƣờng kính vịng vô khuẩn dịch chiết methanol chủng vi khuẩn B subtilis nồng độ 2g/ml, 1g/ml, 0.5g/ml, 0.25g/ml Hình phải kết đƣờng kính vịng vơ khuẩn dịch chiết ethanol chủng vi khuẩn Sal (Salmonella ATCC 13311) nồng độ 2g/ml, 1g/ml, 0.5g/ml, 0.25g/ml 41 Hình 3: : Kết đƣờng kính vịng vơ khuẩn Hoa Ngũ Sắc hai dịch chiết methanol hexan vi khuẩn B.subtilis nồng độ 2g/ml, 1g/ml, 0.5g/ml, 0.25g/ml 43 Hình 4: Hình ảnh đối chứng ethyl acetate khơng tạo vịng vơ khuẩn đĩa thạch chứng minh khả không độc không ảnh hƣởng đến phát triển vi khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923 theo hai phƣơng pháp khuếch tán ( A) xông (B) 44 viii Hình 5: Các cuvet thể thay đổi màu sắc dung dịch DPPH tạo hoạt tính chống oxi hóa VTME (chất chuẩn) nồng độ khác (từ trái sang: Control, VTME 0,1 mg/ml; 0,15 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,35 mg/ml) 46 Hình 6: Các cuvet thể thay đổi màu sắc dung dịch DPPH tạo dung môi dƣợc liệu Ngƣu Tất dung môi nồng độ 40mg/ml 47 Hình 7: Các cuvet cho thấy thay đổi màu sắc dung dịch DPPH tạo dung môi acetone, ethanol, hexan, ethyl acetate dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc nồng nồng độ khác 48 Hình 8: Hoạt tính chống oxi hố tổng số dƣợc liệu Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc quy đổi theo hàm lƣợng VTME (mg/100mg dƣợc liệu ) 49 Hình 9: So sánh hàm lƣợng polyphenol (quy đổi theo mg acid chlorogenic/ 100 mg dƣợc liệu) dƣợc liệu Ngƣu Tất, Hoa Ngũ Sắc 52 ix 12,7mm, 7,3mm Chúng nhận thấy sai khác kết phƣơng pháp chiết tinh dầu khác 4.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dƣợc liệu Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng VTME làm chất chuẩn để quy đổi khả chống oxy hóa dƣợc liệu Để làm đƣợc nhƣ vậy, trƣớc hết tiến hành thiết lập đồ thị chuẩn nồng độ VTME với khả oxi hóa DPPH Kết thu đƣợc biểu diễn thể bảng 4.3 đồ thị 4.3 Bảng 3: Hoạt tính chống oxi hố chất chuẩn VTME xác định theo phƣơng pháp DPPH tạo nồng độ khác ( AA%) L1 L2 0.768 0.79 Lần Lần Lần Lần 0.1 0.026 0.024 0.486 0.654 29.036 0.15 0.025 0.025 0.561 0.613 26.822 0.2 0.026 0.025 0.556 0.456 37.435 0.25 0.022 0.024 0.462 0.451 43.555 0.3 0.028 0.030 0.370 0.349 56.966 0.35 0.029 0.029 0.450 0.395 48.763 Control VTME (mg/ml) Blank Sample 45 AA% Mức độ gia tăng mật độ quang (OD) 60 50 40 30 20 y = 193.1x - 2.2526 R² = 0.9813 10 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Nồng độ vitamin E (mg/ml) Đồ thị 1: Mối tƣơng quan nồng độ VTME (mg/ml) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang (OD value) Kết cho thấy mối tƣơng quan thuận hàm lƣợng VTME mức độ tăng giá trị mật độ quang đƣợc tạo phản ứng với thuốc thử DPPH, hệ số xác định R² 0,9813 p value < 0,001 Tƣơng quan sử dụng để quy đổi tƣơng đƣơng mức độ gia tăng giá trị mật độ quang tạo dịch chiết phản ứng với thuốc thử DPPH Hình 5: Các cuvet thể thay đổi màu sắc dung dịch DPPH tạo hoạt tính chống oxi hóa VTME (chất chuẩn) nồng độ khác (từ trái sang: Control, VTME 0,1 mg/ml; 0,15 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,35 mg/ml) 46 Vì dịch chiết có chứa hoạt chất chống oxy hoá khả màu dung dịch DPPH khác Vì chúng tơi tiến hành tăng giảm nồng độ phù hợp cho dịch chiết Việc tăng giảm nồng độ phù thuộc mức chống oxy hóa dịch chiết với DPPH chƣa tới ngƣỡng màu chất chuẩn dẫn đến sai kết xác định hoạt tính chống oxy hóa dƣợc liệu cần phải tăng nồng độ dƣợc liệu Nếu OD dịch chiết dƣợc liệu thấp với control cần phải giảm nồng độ, ngƣợc lại OD cao control cần phải tiến hành tăng nồng độ dịch chiết Đối với dƣợc liệu Ngƣu Tất tồn dịch chiết dƣợc liệu nồng độ 20mg/ml cho kết OD cao control Chúng tiến hành tăng nồng độ dịch chiết Ngƣu Tất nhƣ sau: Ngƣu Tất ethanol 40mg/ml, Ngƣu Tất nƣớc nóng 40 mg/ml, Ngƣu Tất methanol 40 mg/ml, Ngƣu tất ethyl acetate 80mg/ml, Ngƣu Tất acetone 100 mg/ml, Ngƣu Tất hexan 200 mg/ml Hình 6: Các cuvet thể thay đổi màu sắc dung dịch DPPH tạo dung môi dƣợc liệu Ngƣu Tất dung môi nồng độ 40mg/ml Đối với dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc nồng độ 20mg/ml OD dung môi dịch chiết nằm ngƣỡng màu chất chuẩn là: Methanol, nƣớc nóng Bốn dung mơi cịn lại chúng tơi tiến hành tăng nồng độ: Hoa Ngũ Sắc ethanol 80mg/ml, Hoa Ngũ Sắc acetone 80mg/ml, Hoa Ngũ Sắc ethyl 200mg/ml, Hoa Ngũ Sắc hexan 200mg/ml 47 Hình 7: Các cuvet cho thấy thay đổi màu sắc dung dịch DPPH tạo dung môi acetone, ethanol, hexan, ethyl acetate dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc nồng nồng độ khác Bảng 4: Hoạt tính chống oxi hố quy đổi VTME (mg) dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc Ngƣu Tất Dung môi Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc Ethanol 0.736±0.370 0.308±0.008 Methanol 0.259±0.026 0.471±0.042 Nƣớc nóng 0.338±0.086 0.485±0.094 Hexan 0.001±0.000 0.001±0.000 Acetone 0.079±0.019 0.095±0.019 Ethyl acetate 0.071±0.022 0.001±0.000 48 Hoạt tíh chống oxi hố quy đổi vể 100mg VTME 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 acetone ethanol ethyl methanol acetate Hoa Ngũ Sắc Ngƣu Tất nƣớc nóng hexan Hình 8: Hoạt tính chống oxi hoá tổng số dƣợc liệu Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc quy đổi theo hàm lƣợng VTME (mg/100mg dƣợc liệu ) Từ bảng số liệu 4.4 hình 4.8, nhận thấy đƣợc dịch chiết dƣợc liệu Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc có hoạt tính chống oxi hố hoạt tính chống oxi hố phụ thuộc vào nồng độ, dung mơi chiết xuất Các dung mơi khác có độ phân cực khác khả hồ tan chất có hoạt tính chống oxi hố có dƣợc liệu khác Trong dung môi đƣợc sử dụng nghiên cứu, nhận thấy dung mơi nƣớc nóng, ethanol, methanol có hoạt tính chống oxi hố cao dung mơi cịn lại Hoạt tính chống oxi hố cao dịch chiết Ngƣu Tất ethanol 0.736 VTME/100mg dƣợc liệu Dung môi hexan hai dƣợc liệu Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc dung môi ethyl acetate dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc cho hoạt tính chống oxi hố thấp 0.001 VTME/100mg dƣợc liệu 4.4 Xác định hàm lƣợng polyphenol dƣợc liệu Để xác định đƣợc hàm lƣợng polyphenol có dƣợc liệu Trƣớc tiên, Chúng tơi tiến hành đo hàm lƣợng polyphenol tổng số sử dụng acid chlorogenic làm chất chuẩn để quy đổi hàm lƣợng polyphenol dƣợc liệu sang hàm lƣợng mg chất chuẩn Để có đƣợc đồ thị đƣờng chuẩn mối tƣơng quan hàm lƣợng acid chlorogenic với thay đổi giá trị mật độ quang phổ Mối tƣơng quan đƣợc đánh giá số giá trị OD values dung dịch phản ứng với thuốc thử Folin Ciocalteu bƣớc sóng 750nm thu đƣợc đồ thị 49 Bảng 5: Sự thay đổi giá trị OD Values theo nồng độ chất chuẩn acid chlorogenic (mg/ml) Acid chlorogenic Mức độ gia tăng mật độ quang N1 N2 0.123 0.120 Blank Blank 0.1 0.061 0.184 0.062 0.182 0.2 0.306 0.297 0.245 0.3 0.408 0.518 0.4 0.511 0.5 Mean SD 0.122 0.002 0.235 0.240 0.007 0.347 0.456 0.402 0.077 0.600 0.450 0.538 0.494 0.062 0.630 0.606 0.569 0.544 0.556 0.018 0.6 0.77 0.771 0.709 0.709 0.709 0.00 0.7 0.947 0.940 0.886 0.878 0.882 0.006 0.8 1.038 1.026 0.977 0.964 0.971 0.009 0.9 1.340 1.160 1.279 1.098 1.189 0.128 1.263 1.310 1.248 1.225 1.225 0.033 Mức độ gia mật độ quang 1.4 y = 1.2565x - 0.0122 R² = 0.9909 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Đồ thị 2: Mối tƣơng quan hàm lƣợng chất chuẩn acid chlorogenic (mg/ml) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang (OD value) Kết cho thấy mối quan hệ tƣơng quan thuận hàm lƣợng axit chlorogenic mức độ thăng giá trị đo mật độ quang đƣợc tạo phản với thuốc thử Folin 50 Ciocaulteu, hệ số xác định R2 0.9909 p value < 0,001 Hàm tƣơng quan sử dụng để quy đổi tƣơng đƣơng mức giá trị mật độ quang tạo chất chuẩn axit chlorogenic Bảng 6: Hàm lƣợng polyphenol tổng số quy đổi theo mg acid chlorogenic/ 100mg dƣợc liệu khô dƣợc liệu Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc Dung môi Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc Ethanol 0.728±0.000 0.616±0.004 Methanol 0.601±0.025 1.278±0.226 Nƣớc nóng 0.704±0.000 0.978±0.318 Hexan 0.076±0.011 0.256±0.011 Acetone 0.456±0.321 0.408±0.007 Ethyl 0.106±0.004 0.318±0.021 51 Hàm lƣợng polyphenol quy đổi (mg acid chlorogenic/ 100 mg dƣợc liệu 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 acetone ethanol hexan Hoa Ngũ Sắc ethyl acetate methanol nƣớc nóng Ngƣu Tất Hình 9: So sánh hàm lƣợng polyphenol (quy đổi theo mg acid chlorogenic/ 100 mg dƣợc liệu) dƣợc liệu Ngƣu Tất, Hoa Ngũ Sắc Từ bảng số liệu 4.4 hình 4.9 cho thấy đƣợc hàm lƣợng polyphenol dƣợc liệu Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc dao động từ 0.076-1.278 mg acid chlorogenic/ 100 mg dƣợc liệu Dung môi hexan dƣợc liệu Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc cho hàm lƣợng polyphenol thấp lần lƣợt 0.076 0.256 mg acid chlorogenic/ 100 mg dƣợc liệu Dịch chiết Hoa Ngũ Sắc methanol cho hàm lƣợng polyphenol cao 1.278 mg acid chlorogenic/ 100 mg dƣợc liệu Methanol ethanol dung môi cho khả kháng khuẩn tốt dung mơi cịn lại hai dƣợc liệu Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc Ngồi dung mơi cho hàm lƣợng polyphenol hoạt tính chống oxi hố cao Theo Nguyễn Thị Thanh Hà cs (2021) dƣợc liệu có hàm lƣợng polyphenol hoạt tính chống oxi hố cao có khả ức chế vi khuẩn tốt 52 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trong nghiên cứu khảo sát sơ tác dụng kháng khuẩn dƣợc liệu Ngƣu Tất Hoa Ngũ Sắc, tinh dầu Hoa Ngũ Sắc chủng vi khuẩn, tinh dầu Hoa Ngũ Sắc Escheria coli (E coli) ATCC 25922; E coli ATCC 85922; E coli ATCC 35218; Staphylococcus aureus (S aureus) ATCC 25923; S aureus ATCC 25023; Pseudomonas aeruginosa (P Aeruginosa) ATCC 9027; Bacillus subtilis (B subtilis) ATCC 7953; Geobacillus stearothermophilus (G Stearothermophilus) ATCC 7953, Salmonella ATCC 13311 Đối với dƣợc liệu Ngƣu Tất, dịch chiết Ngƣu Tất methanol vi khuẩn G philus ATCC 7953 cho đƣờng kính vịng vơ khuẩn cao 14.25mm nồng độ 2000mg/ml Với dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc, dịch chiết ethanol chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus (S aureus) ATCC 25923 có kích thƣớc đƣờng kính vịng vơ khuẩn 6.76mm Nghiên cứu khả kháng khuẩn tinh dầu hoa Ngũ Sắc, nhận thấy tinh dầu Hoa Ngũ Sắc khơng tác có dụng ức chế chủng sử dụng nghiên Thông qua kết thí nghiệm lý giải đƣợc phần khoa học việc sử dụng dƣợc liệu dân gian để điều trị bệnh có liên quan đến nhiễm khuẩn có Nghiên cứu giúp ích cho việc chọn lọc dƣợc liệu có tác dụng kháng khuẩn mạnh số chủng vi khuẩn định Ngồi mục đích nghiên cứu khả ức chế vi khuẩn chúng tơi cịn tiến hành khảo sát hàm lƣợng polyphenol hoạt tính chống oxi hóa dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc Ngƣu Tất Qua đánh giá giá nhận thấy đƣợc mối tƣơng hàm lƣợng polyphenol lớn hệ số chống oxi hóa hợp chất polyphenol dƣợc liệu có tính oxi hóa cao loại dƣợc liệu nghiên cứu Cũng cho thấy mối tƣơng quan với khả kháng khuẩn Trong nghiên cứu chúng tôi, dịch chiết dung môi methanol ethanol dƣợc liệu thấy đƣợc có hàm lƣợng polyphenol hoạt tính chống oxi hố cao cho đƣờng kính vịng vơ khuẩn có kích thƣớc lớn so với dung mơi cịn lại 5.2 Kiến nghị Q trình chiết xuất đóng vai trị quan trọng việc thu lấy thành phần hoạt chất nhƣ tạo hoạt tính sinh học dịch chiết thu đƣợc Vì cần 53 phải có thêm nghiên cứu khảo sát việc chiết xuất dung môi khác phƣơng pháp chiết xuất khác để chọn đƣợc dung môi phƣơng pháp chiết xuất phù hợp loại dƣợc liệu mang lại đƣợc hoạt tính sinh học cao Việc xác định khả kháng khuẩn dƣợc liệu phụ thuộc vào chủng vi khuẩn sử dụng Vì cần phải nghiên cứu thêm nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh ngƣời, động vật Từ chọn lọc đƣợc dƣợc liệu có tính kháng khuẩn mạnh nhóm vi khuẩn gây bệnh ứng dụng làm thuốc giúp chống bệnh vi khuẩn gây nên mà không gây tƣợng kháng thuốc Đối với tinh dầu Hoa Ngũ Sắc, cần phải nghiên cứu thêm khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn có khả gây bệnh viêm xoang với phƣơng pháp khác Vì số nghiên cứu sử dụng tinh dầu Hoa Ngũ Sắc để điều chế thành dung dịch chữa viêm xoang đƣợc thử nghiệm lâm sàng cho thấy hiệu cao Cần có nghiên cứu sâu nhƣ sử dụng HPLC để xác định hàm lƣợng nhóm hoạt chất thực vật giải thích đƣợc nhóm chất chịu trách nhiệm cho tác dụng chúng vi khuẩn 54 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc Aviram, Michael D., L eslie R., Mira V., Nina K., Marielle C., Raymond H., Tony P., Dita F & Bianca (2000) Pomegranate juice consumption reduces oxidative stress, atherogenic modifications to LDL, and platelet aggregation: studies in humans and in atherosclerotic apolipoprotein E–deficient mice The American journal of clinical nutrition 71(5): 10621076 Bouarab.C, Lynda F., Valérian L., Pierre C., Yohann L.A., Lucie O., Nadia D., Pascal B & Claire (2019) Antibacterial properties of polyphenols: characterization and QSAR (Quantitative structure–activity relationship) models Frontiers in microbiology 10: 829 Cheynier & Véronique (2012) Phenolic compounds: from plants to foods Phytochemistry reviews 11(2): 153-177 Chou, Ya-Chun Ho, Chi-Tang Pan & Min-Hsiung (2018) Stilbenes: chemistry and molecular mechanisms of anti-obesity Current Pharmacology Reports 4(3): 202-209 Cueva, Carolina M A., Victoria M.A., Pedro J.B., Gerald V., Francisca B., Angela R., Concepción L.R., Teresa R., Juan M.B & Bega (2010) Antimicrobial activity of phenolic acids against commensal, probiotic and pathogenic bacteria Research in microbiology 161(5): 372-382 Devi, Uma Murugan.P, Suja S., Selvi.S, Chinnaswamy S., Vijayanand.P & E (2007) Antibacterial, in vitro lipid per oxidation and phytochemical observation on Achyranthes bidentata Blume Pakistan Journal of Nutrition Dröge & Wulf (2002) Free radicals in the physiological control of cell function Physiological reviews Gnanamani, Arumugam H., Periasamy P.S & Maneesh (2017) Staphylococcus aureus: Overview of bacteriology, clinical diseases, epidemiology, antibiotic resistance and therapeutic approach Frontiers in Staphylococcus aureus 4: 28 Guo G., Shela Y., Kazutaka K., Elena L., Hanna L., Antonin L., Maria C., Milan G., Ivan S., Uri T & Simon (2020) Antibacterial activity of olive oil polyphenol extract against Salmonella Typhimurium and Staphylococcus aureus: Possible Mechanisms Foodborne Pathogens and Disease 17(6): 396-403 He, Gang Guo, Wei Lou, Zhiyuan Zhang & Hu (2014) Achyranthes bidentata saponins promote osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells through the ERK MAPK signaling pathway Cell biochemistry and biophysics 70(1): 467-473 Janovska, Dagmar K., Katerina K & L (2003) Screening for antimicrobial activity of some medicinal plants species of traditional Chinese medicine Czech journal of food sciences 21(3): 107 Ju, Yan Liang, Hui Du, Kaicheng Guo, Zifeng Meng & Dali (2022) Isolation of triterpenoids and phytosterones fromAchyranthes bidentata Bl to treat breast cancer based on network pharmacology Editors Elsevier Khatri, Deepa Chhetri & Sumit Bahadur Baruwal (2020) Reducing sugar, total phenolic content, and antioxidant potential of nepalese plants BioMed Research International 2020 55 Kotzekidou & P (2014) Geobacillus stearothermophilus (Formery stearothermophilus Encyclopedia of Food Microbiology 129-134 Bacillus Kouame, Bi K.F., Daouda K., Landry B., Gustave T., Illa Robins, Richard C., Jean C T & Felix (2018) Chemical constituents and antibacterial activity of essential oils from flowers and stems of Ageratum conyzoides from Ivory Coast Records of Natural Products 12(2) Lodise Jr & Thomas P (2016) Pseudomonas aeruginosa Clin Infect Dis 63: e61-e111 Merkl, Roman H.V, Iveta F., Vladimír Š & Jan (2010) Antimicrobial and antioxidant properties of phenolic acids alkyl esters Czech Journal of Food Sciences 28(4): 275-279 Neelabh, Choudhury N., Akhtar K & Navneet (2017) Study on methanolic extract of Ageratum conyzoides for its ability to act as an antioxidant and to suppress the microbial growth The Pharma Innovation 6(11, Part C): 170 Okunade & Adewole L (2002) Ageratum conyzoides L.(asteraceae) Fitoterapia 73(1): 1-16 Pandey, Kanti Bhooshan Rizvi & Syed Ibrahim (2009) Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease Oxidative medicine and cellular longevity 2(5): 270-278 Popa, VI D., Mariana V., Irina A & N (2008) Lignin and polyphenols as allelochemicals Industrial crops and products 27(2): 144-149 Prabhu, Shweta M., Aleena C., Hinal K., Shiv M & Rahul (2021) Classifications of polyphenols and their potential application in human health and diseases.Int J Physiol Nutr Phys Educ 6: 293-301 Rasouli, Hassan F., Mohammad H K & Reza (2017) Polyphenols and their benefits: A review International Journal of Food Properties 20(sup2): 1700-1741 Šamec, Dunja K., Erna Š., Ivana V B., Valerija S S Branka & (2021) The role of polyphenols in abiotic stress response: The influence of molecular structure Plants 10(1): 118 Shahidi, Fereidoon Yeo & Ju Dong (2018) Bioactivities of phenolics by focusing on suppression of chronic diseases: A review International journal of molecular sciences 19(6): 1573 Singla, Rajeev K D., Ashok K G., Arun S., Ramesh K F., Marco A., Sara M H., Moawiya A A & Masnat (2019) Natural polyphenols: Chemical classification, definition of classes, subcategories, and structures Oxford University Press 1397-1400 Sultana, Mudasir V., Pawan K R., Rajinder P., Shahid D MA & (2012) Quantitative analysis of total phenolic, flavonoids and tannin contents in acetone and n-hexane extracts of Ageratum conyzoides International Journal of ChemTech Research 3: 996999 Tan, Yinfeng An , Ni Li, Yonghui Cheng, Shouqian Zhang, Junqing Zhang, Xiaopo Li & Youbin (2016) Two new isoflavonoid glucosides from the roots of Achyranthes bidentata and their activities against nitric oxide production Phytochemistry Letters 17: 187-189 Thomer, Lena S., Olaf M & Dominique (2016) Pathogenesis of Staphylococcus aureus bloodstream infections Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease 11: 343-364 56 Vattem V, Lin D.A., Labbe Y.T., Shetty R.G & K (2004) Phenolic antioxidant mobilization in cranberry pomace by solid-state bioprocessing using food grade fungus Lentinus edodes and effect on antimicrobial activity against select food borne pathogens Innovative food science & emerging technologies 5(1): 81-91 Vita & Joseph A (2005) Polyphenols and cardiovascular disease: effects on endothelial and platelet function The American journal of clinical nutrition 81(1): 292S-297S Wang, Changsheng Hua, Dehong &Yan Chunyan (2015) Structural characterization and antioxidant activities of a novel fructan from Achyranthes bidentata Blume, a famous medicinal plant in China Industrial Crops and Products 70: 427-434 Yang, Chung S Landau, Janelle M H., Mou.T N & Harold L (2001) Inhibition of carcinogenesis by dietary polyphenolic compounds Annual review of nutrition 21(1): 381-406 ZhangZhang, Mei Zhou & Zhong-Yu Wang (2012) Phytoecdysteroids from the roots of Achyranthes bidentata Blume Molecules 17(3): 3324-3332 이예슬 김미선 김덕진 손호용 (2013).토우슬과 회우슬의 에탄올 추출물의 성분 및 생리활성 비교 Microbiology and Biotechnology Letters 41(4): 416-424 Cowan M.M (1999) Plant products as antimicrobial agents Clinical Microbiology Reviews 12: 564-82 Xie, Y.; Yang, W.; Tang, F.; Chen, X.; Ren & L (2015) Antibacterial activities of flavonoids: Structure-activity relationship and mechanism Curr, Med Chem, 22, 132–149 PhungTan Phat & Le Hoang Ngoan (2016) Isolation of three polymethoxylated flavones from Ageratum conyzoides L growing in Can Tho city Can Tho University Journal of Science 04: 13-19 Tài liệu nƣớc Bùi Thị Tho & Nguyễn Thị Thanh Hà (2009) Giáo trình Dƣợc liệu Thú y Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội Bùi Thị Tho (2003) "Thuốc kháng sinh nguyên tắc sử dụng chăn nuôi", NXB Hà Nội Bùi Thị Tho Nguyễn Thành Trung (2010), Khảo sát tác dụng Xuân Hoa ((Pseuderanthemum palatiferum) điều trị bệnh tiêu chảy lợn con, Chi hội Thú y – Đại học Nông nghiệp Hà Nội Đỗ Tất Lợi, 1995 “Những thuốc vị thuốc Việt Nam” Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội Huỳnh Kim Diệu (2010) Hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh cá số thuốc nam Đồng sơng Cửu Long Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ (15b): 222229 Lê Thị Thanh Hƣơng, Hà Văn Quân, Đỗ Văn Vệ Nguyễn Trung Thành (2015) “Điều tra thuốc kinh nghiệm sử dụng thuốc đồng bào dân tộc Tày xã Văn An, huyện Văn Quan, tỉnh Lạng Sơn” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 31, Số 45-55 57 Nguyễn Thanh Hải Bùi Thị Tho (2013) “Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) E Coli gây bệnh E.Coli kháng Ampicillin, Kannamycin” Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 11, số 6: 804-808 Nguyễn Thị Kim Liên (2018) Khảo sát thành phần flavonoid Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides L Asteraceae) Journal of Science and Technology 1(2): 63-68 Nguyễn Thị Trần Thụy (2009) Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vƣờn sinh protease kiềm Luận văn thạc sĩ sinh học Trƣờng ĐH Sƣ Phạm TP Hồ Chí Minh (3): 37-39 Phạm Kim Mãn, Phạm Văn Thanh, Vũ Thu Kim Nguyễn Quang Hoan (2017) Chế tạo bột bedentin làm thuốc hạ cholesterol có mẫu từ Ngƣu Tất Tạp chí dƣợc liệu, số 3+4: 1821 Võ Văn Chi, 1997 “Từ điển thuốc Việt Nam” Nhà xuất Y học Lê Huy Chính cộng sự, 2003 Vi sinh y học Nhà xuất Y Học 58 PHỤ LỤC Hình 1: Dung dịch chuẩn McFarland mức khác để so sánh độ đục nồng độ vi khuẩn tƣơng ứng với độ đục 59