HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – – – – – – ✰ �– – – – – – KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH GIỐNG HOA CÚC TEDDY (CHRYSANTHEMUM SP.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – – – – – – ✰ �– – – – – – KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH GIỐNG HOA CÚC TEDDY (CHRYSANTHEMUM SP.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO Giảng viên hƣớng dẫn : PGS TS ĐỒNG HUY GIỚI Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ VY Lớp : K63CNSHB MSV : 637191 HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Bước đầu xây dựng quy trình nhân nhanh giống hoa cúc Teddy (Chrysanthemum sp.) phương pháp ni cấy in vitro” quy trình nghiên cứu độc lập, tiến hành công khai hướng dẫn PGS.TS Đồng Huy Giới Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực khơng có chép từ nguồn tài liệu khác Ngồi thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Nếu có vấn đề xảy ra, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm, kỷ luật trước môn nhà trường Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Vy i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, cố gắng, nỗ lực thân, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ tận tình thầy cô, bạn bè người thân! Trước tiên cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn PGS.TS Đồng Huy Giới, Bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người hướng dẫn trực tiếp, tận tình giúp đỡ em trình thực tập hồn chỉnh khóa luận tốt nghiệp! Em xin gửi lời cảm ơn thầy giáo, cô giáo, cán thuộc môn Sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, tạo điều kiện tốt cho em trình thực tập hoàn thành đề tài này! Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học tập thể thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt nam dìu dắt, truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường! Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất người thân, bạn bè, anh chị em – người bên cạnh, giúp đỡ em trình học tập thực đề tài! Do thời gian điều kiện có hạn nên đề tài tốt nghiệp em khơng tránh thiếu sót, kính mong thầy bạn bè đóng góp ý kiến để khố luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Vy ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH .vii DANH MỤC CÁC CỤM TỪ - KÝ HIỆU VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.2 Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.3 Các giai đoạn (bước) nhân giống in vitro 2.2 Giới thiệu chung cúc 2.2.1 Nguồn gốc 2.2.2 Phân loại hoa cúc 2.2.3 Đặc điểm thực vật học 2.2.4 Đặc điểm sinh thái 10 2.2.5 Tình hình sản xuất hoa Cúc 11 2.2.6 Một số công dụng hoa cúc 12 2.3 Một số kết nghiên cứu nhân giống Cúc giới Việt Nam 13 iii 2.3.1 Trên giới 13 2.3.2 Ở Việt Nam 16 PHẦN 3: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Mục tiêu nghiên cứu 20 3.2 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 20 3.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 20 3.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1 Tạo vật liệu khởi đầu 20 3.4.2 Nhân nhanh chồi in vitro hoa cúc Teddy 21 3.4.4 Tạo hoàn chỉnh 24 3.5 Bố trí thí nghiệm 25 3.6 Các tiêu theo dõi 26 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro hoa cúc Teddy 27 4.1.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng mẫu NaClO 5% đến khả sống phát sinh hình thái cúc Teddy 28 4.1.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng mẫu HgCl2 0.1% đến khả sống phát sinh hình thái cúc Teddy 29 4.2 Nhân nhanh chồi in vitro 31 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi cúc Teddy 32 4.2.2 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh chồi cúc Teddy.33 4.2.3 Ảnh hưởng kết hợp BA với α-NAA đến khả nhân nhanh chồi cúc Teddy 35 4.3 Ra rễ tạo hoàn chỉnh 37 4.3.1 Ảnh hưởng α- NAA đến khả rễ cúc Teddy 37 4.3.2 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ cúc Teddy 39 iv 4.3.3 Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến khả rễ cúc Teddy 41 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số giống hoa cúc Việt Nam phổ biến Bảng 2.2 Các nước xuất nhập hoa cúc hàng năm (triệu USD) 11 Bảng 4.1 Ảnh hưởng chất khử trùng NaClO 5% đến tỷ lệ mẫu tỷ lệ mẫu phát sinh chồi cúc Teddy (sau tuần nuôi cấy) 28 Bảng 4.2 Ảnh hưởng chất khử trùng HgCl2 0,1% đến tỷ lệ mẫu tỷ lệ mẫu phát sinh chồi cúc Teddy (sau tuần nuôi cấy) 30 Bảng 4.3 Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh cúc Teddy (chrysanthymum spp.) 32 Bảng 4.4 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh chồi giống hoa cúc Teddy 34 Bảng 4.5 Ảnh hưởng 0,4 mg/L BA kết hợp với α-NAA đến khả nhân nhanh cúc Teddy 36 Bảng 4.6 Ảnh hưởng α-NAA đến khả rễ cúc Teddy 38 Bảng 4.7 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ cúc Teddy40 Bảng 4.8 Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến khả rễ cúc Teddy 42 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Hình ảnh cúc Pink Teddy ( Chrysanthemum.spp) Hình 4.1 Doạn thân cúc Teddy 27 Hình 4.2 Mẫu cúc Teddy phát sinh chồi sau vào mẫu tuần 28 Hình 4.3 Mẫu cúc Teddy phát sinh chồi sau tuần vào mẫu 30 Hình 4.4 Cụm chồi cúc Teddy nhân môi trường MS bổ sung BA sau tuần nuôi cấy 32 Hình 4.5 Cụm chồi cúc Teddy nhân nhanh mơi MS có Kinetin (Kin) nồng độ khác (sau tuần nuôi cấy) 34 Hình 4.6 Cụm chồi cúc Teddy nhân nhanh mơi trường MS có 0,4 mg/L BA α-NAA nồng độ khác (sau tuần nuôi cấy) 35 Hình 4.7 Chồi cúc Teddy mơi trường MS có α-NAA sau tuần ni cấy 38 Hình 4.8 Chồi cúc Teddy môi trường bổ sung IBA sau tuần nuôi cấy 40 Hình 4.9 Chồi cúc Teddy mơi trường MS bổ sung than hoạt tính sau tuần nuôi cấy 42 vii DANH MỤC CÁC CỤM TỪ - KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Viết đầy đủ Viết tắt AC Activated charcoal BA Benzyl adenine CT Công thức CV% Sai số thí nghiệm ĐC Đối chứng ĐTST Điều tiết sinh trưởng GA3 Gibberellic acid HgCl2 Thủy ngân clorua 10 HClO Javen 11 IBA Indole-3-butyric acid 12 Ki Kinetin 13 LSD0,05 Độ lệch tiêu chuẩn mức %5 ‎ aĩ‎gn‎ 14 MS Muashige and Skoog, 1962 15 TB Trung bình 16 α-NAA α- Napthalene aceticacid viii - Thực tiếp thí nghiệm thích nghi vườn ươm để đánh giá tỷ lệ sống cúc Teddy vườn ươm - Tiếp tục tiến hành thí nghiệm tạo hồn chỉnh với kết hợp IBA than hoạt tính - Tiếp tục tiến hành thí nghiệm tạo callus từ tái sinh từ callus để phục vụ nghiên cứu ứng dụng sau 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt Bùi Thị Thu Hương, Đồng Huy Giới, (2019) “Ảnh hưởng số yếu tố dinh dưỡng chất điều tiết sinh trưởng đến phát sinh hình thái in vitro cúc Anh Thảo (Chrysanthemum sp.)” Công nghệ sinh học & Giống trồng số -2019 Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Bá Nam (2009) Ảnh hưởng hệthống chiếu sáng đơn sắc lên sựsinh trưởng phát triển hoa cúc (Chrysanthemum morifoliumcv “Nut”) ni cấy in vitro Tạp chí Cơng nghệ sinh học 7: 91-98 Dương Thị Tuyết, 2020 Đề tài khóa luận: “Nghiên cứu ảnh hưởng số chất điều tiết sinh trưởng đến khả sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro lan thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)”, khoa cơng nghệ sinh học, trường đại học Nông Lâm Đào Mạnh Khuyến, “ Hoa cảnh”, chủ đề 1- cảnh, nhà xuất Văn hóa Dân tộc, Hà Nội, 1993 Đào Thanh Vân Đặng Thị Tố Nga 2007 Giáo trình hoa NXB Nơng nghiệp Đặng Thị Thu Thảo, 2019 Đề tài “Thiết lập hệ thống tái sinh in vitro hoa cúc Chrysanthemum sp.”, Đại học Tơn Đức Thắng, Thành Phố Hồ Chí Minh Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2003 “Công nghệ trồng hoa cho thu nhập cao”, Quyển 1- hoa cúc, Nhà xuất nông nghiệp Đỗ Bé Thảo, “Khảo sát môi trường tạo rễ tiền dưỡng hoa cúc “Farm tím” (Chrysanthemum.sp) in vitro”, Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành hoa viên cảnh Đại học Cần Thơ”, 2009 47 Đồng Huy Giới Bùi Thị Thu Hương, 2020 Nghiên cứu sử dụng nano bạc nhân giống in vitro cúc Bách nhật (Gomphrena globosa L.) Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2021, 19(3):363-369 10 Hoài Vũ, “Hoa cúc làm thuốc”, 2019, sức khỏe đời sống https://suckhoedoisong.vn/hoa-cuc-lam-thuoc-16937909.htm 11 Hoàng Thanh Tùng, Trương Thị Bích Phượng , Dương Tấn Nhựt, 2015 “Hệ Thống Vi Thủy Canh Trong Nhân Giống Cây Cúc Trắng (Chrysanthemum Morifolium)” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(4): 1127-1137, 2015 12 Huyên Thảo, 2018, "Hoa cúc Mùa thu - Danh hoa Danh dược", Cây thuốc quý, Tạp chí Dược Liệu Đời Sống số 164: 14 -17 13 Huỳnh Thị Anh Đài, 2018, Báo cáo“Đồ án tốt nghiệp xây dựng quy trình nhân giống in vitro cúc nhỏ pico (chrysanthemum sp.)”, Bộ Giáo Dục Và Đào Tạo trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, Viện khoa học ứng dụng Hutech, 14 Lâm Ngọc Phương Phạm Lê Tuấn 2007 Hiệu IAA BA đến tái sinh trực tiếp chồi từ hoa cúc (Chrysanthemum sp.) Trong: Dương Tấn Nhựt (chủ biên) Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa Hội nghị Khoa học, năm 2007 Nhà xuất Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Trang 87 92 15 Nguyễn Hồng Lộc (1998), Giáo trình ni cấy mơ tế bào thực vật, Nhà xuất Trường Đại học Khoa học Huế 16 Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội 17 Nguyễn Mộng Thúy 2009 Môi trường nhân nhanh chồi hoa cúc “Farm Tím” (Chrysanthemum sp.) phương pháp ni cấy mô 48 Luận văn tốt nghiệp Đại học, chuyên ngành Hoa viên cảnh, Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ 18 Nguyễn Thị Diệu Hương Và Dương Tấn Nhựt (2004), “hồn thiện quy trình nhân nhanh hoa cúc (chrysanthymum indicum L.) bệnh kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng”, Phân viện Sinh học Đà Lạt, đăng tạp chí Sinh học, Hà Nội 19 Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Kim Yến, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Duy, Dương Tấn Nhựt (2012) “Ảnh hưởng than hoạt tính lên khả định hướng rễ hồng mơn cúc ni cấy in vitro” Tạp chí Sinh học 34(3): 377-388 20 Nguyễn Văn Đính, Nguyễn Thị Oanh, Lê Thu Hằng, La Việt Hồng 2017 “Nghiên cứu giải phẫu hoa cúc cấy mô giai đoạn vườn ươm số biện pháp kỹ thuật nhân giống” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(76)/2017 21 Phan Xuân Huyên, Trương Ngọc Thảo Vy, Nguyễn Thị Phượng Hoàng, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Đinh Văn Khiêm, 2020 Nghiên cứu nhân giống in vitro sinh trưởng phát triển ex vitro hoa cúc chi (Chrysanthemum indicum L.) Đà Lạt - Lâm Đồng Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 19(1): 175-184, 2021 22 Trần Hợp Nguyễn Bội Quỳnh, (1993) Cây gỗ kinh tế Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 23 Trương Hữu Tuyên, 1979, kỹ thuật trồng hoa, Nxb Nơng thơn Hà Nội 24 Văn Hồng Long, Bùi Văn Thế Vinh Dương Tấn Nhựt 2012 Giá thể Nylon rễ hoa cúc (Chrysanthemum spp.) Hội nghị khoa học năm 2007, NXB Nông nghiệp, trang 71-79 25 Võ Văn Chi, 2003, 2004, Từ điển thực vật thông dụng, Tập 2, Nhà xuất Khoa học 49 26 Võ Văn Chi, 2019 Từ điển thuốc Việt Nam Phần 1- đại cương, tái lần thứ Nhà xuất Y học 27 Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1998), phân loai thực vật học, Nxb đại học trung học chuyên nghiệp, Hà Nội * Tài liệu Tiếng Anh 28 Gao Y., Chen B., & Zhang J (2011) Anther Culture Of Garden Chrysanthemum Acta Horticulturae, (923), 103–110 29 George Edwin F 1996 Plant propagation by tissue culture Part In practical, 2nd Edition, Exegtics Limited 30 George M (1966) The strawberry: History, Breeding and Physiology Holt, Rinehart & Winston 31 Gul A (2001) Microprpagation of Chrysanthemum PhD Thesis M Sc thesis Department of Botany, University of Peshawar 32 Karim M.Z, Amin M.N, Azad M.A.K., Begum F., Islam M.M and Alam R 2002 Effect of different plant growth regulators on in vitro shoot multiplication of Chrysanthemum morifolium through in vitro culture Online journal of biological sciences 3(6): 553-560 33 Karim M.Z, Amin M.N, Azad M.A.K., Begum F., Islam M.M and Alam R 2003 Rapid multiplication of Chrysanthemum morifolium through in vitro culture Pakistan journal of biological sciences 5(11): 1170-1172 34 Lazar M., Cachita C D (1983) Micropropagation of Chrysanthemum III Chrysanthemum multiplication in vitro from captitulum explants Product and Vegetable Horticulture, 32: 44-47 35 Letham, D S (1963) Zeatin, a factor inducing cell division isolated from Zea mays Life sciences, 2(8), 569-573 36 Linneaus, C 1753 Species plantarum, Salvius, Stockholm, Sweden vol 50 37 Manu Pant, Ankita Lal & Rashi Jain (2015) A simple cost effective method for mass propagation of Chrysanthemum morifolium and antibacterial activity assessment of in vitroraised plantlets Journal of Applied Pharmaceutical Science 5(7): 103-111 38 Mohamad Shatnawi , Arwa Al-Fauri , Husein Megdadi , Mohammed Kair Al-Shatnawi , Rida Shibli , Saead Abu-Romman and Abdul lateif Al-Ghzawi, 2010 , “In Vitro Multiplication of Chrysanthemum morifolium Ramat and it is Responses to NaCl Induced Salinity”, Jordan Journal of Biological Sciences Volume 3, Number 3, ISSN 1995-6673, Pages 101 - 110 39 Murashige T and Skoog F (1962) A rivised medium for rapid growth and boiassays with tobaco tissue culture Physiol-Plant (15): 473-439 40 Nongkran Kaosayaphunth Kasetsart Univ, 1989, "Effect of IBA on rooting ability of chrysanthemum terminal cutting", , Bangkok (Thailand) Faculty of Agriculture Dept of Horticulture 41 Singh, K., & Arora, J S (1995) In vitro multiplication of Chrysanthemum morifolium Ramat cv Riot J Ornam Hort, 2(1-2), 63-68 42 Van Staden J., Zazimalova E., George E.F 2008 Plant growth regulators II: Cytokinins, their analogues and antagonists In: George E.F., Hall M.A., De Klerk G.J (eds.) Plant Propagation by Tissue Culture Springer, Netherlands, pp 205–226 43 Zafarullah, A., Ilyas, S., Naz, S., Aslam, F., & Manzoor, F (2013) Effect of culture media and growth regulators on in vitro propagation of Chrysanthemum indicum L Pakistan Journal of Science, 65(4), 462466 51 Analysis of variance New table : 16/05/2022 - 20:44:58 - [Version : 30/04/2020] Analysis of variance Thí nghiệm: ảnh hưởng BA đến tạo chồi cúc teddy He so nhan choi Variable He so nhan choi N R² 36 Adj R² 0.98 CV 0.98 6.64 Analysis of variance table (Partial SS) S.V Model SS df MS F p-value 124.58 24.92 275.48