Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh diệt vi khuẩn Xanthomanas oryzae gây bệnh bạc lá lúa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số: 60420114 Đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa Học viên: Từ Thị Bẩy Lớp: CHST _ K15 Hƣớng dẫn: TS Đào Thị Hồng Vân Hà Nội, 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Hồng Vân - Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Kỹ sư Đặng Văn Tiến, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận án này. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên,góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv MỤC LỤC MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC BẢNG x MỞ ĐẦU 1 PHẦN I. TỔNG QUAN 3 1.1. XẠ KHUẨN 3 1.1.1. Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên 3 1.1.2. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới 4 1.2. ĐẶC ĐIỂM VÀ CẤU TẠO CỦA XẠ KHUẨN 5 1.2.1. Đặc điểm hình thái 5 1.2.2. Cấu tạo của xạ khuẩn 6 1.2.3. Sự sinh trƣởng và phát triển 8 1.2.4. Sự hình thành bào tử 9 1.2.5. Sinh tổng hợp chất kháng sinh 11 1.3. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP 13 1.3.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 13 1.3.2. Phân loại và định tên xạ khuẩn 13 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn . 16 1.4. TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH 18 1.4.1. Phƣơng pháp hấp phụ 18 1.4.2. Một số chất hấp phụ 19 1.4.3. Một số chất nhả hấp phụ 21 1.5. BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA 22 1.5.1. Thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra đối với cây lúa 22 1.5.2. Biểu hiện của bệnh bạc lá trên lúa 23 1.5.3. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 1.5.4. Cơ chế gây bệnh 24 1.5.5. Sử dụng xạ khuẩn trong phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa 25 PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. VẬT LIỆU 26 2.1.1. Chủng giống vi sinh vật 26 2.1.2. Hóa chất 26 2.1.3. Thiết bị 26 2.1.4. Môi trƣờng 27 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1. Bảo quản giống 27 2.2.2. Xác định đặc điểm sinh học 28 2.2.3. Xác định sinh khối 29 2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh 29 2.2.5. Nghiên cứu điều kiện lên men 30 2.3. NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH CÓ TRONG DỊCH LÊN MEN 31 2.3.1. Đánh giá khả năng hấp phụ chất kháng sinh trên các chất hấp phụ 31 2.3.2. Xác định nồng độ chất hấp phụ 31 2.3.3. Thử các dung môi nhả hấp phụ chất kháng sinh 31 2.3.4. Xác định pH và thời gian nhả hấp phụ 31 2.3.5. Xác định tỷ lệ các thành phần của hỗn hợp dung môi 32 2.3.6. Chạy sắc ký giấy chất kháng sinh 32 2.4. ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT 32 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH 33 3.1.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn 33 3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh 34 3.1.3. Khả năng đối kháng trong môi trƣờng dịch thể 37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi 3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN TB 5.4 38 3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy 38 3.2.2. Đặc điểm hình thái bào tử 41 3.2.3. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa 42 3.3.NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces oligocarbophilus TB5.4 47 3.3.1. Lựa chọn môi trƣờng nhân giống và môi trƣờng lên men 47 3.3.2.Ảnh hƣởng của nguồn cacbon thay thế 48 3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ 49 3.3.4. Ảnh hƣởng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S. oligocarbophilus TB5.4 50 3.3.5. Ảnh hƣởng của tỷ lệ tiếp giống đến sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S. oligocarbophilus TB5.4 50 3.3.6. Ảnh hƣởng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh ở chủng S. oligocarbophilus TB5.4 51 3.3.7.Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. oligocarbophilus TB5.4 52 3.4. TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH TỪ DỊCH LÊN MEN CỦA CHỦNG S. oligocarbophilus TB5.4 53 3.4.1. Đánh giá khả năng của kháng sinh trên các chất hấp phụ 53 3.4.2. Xác định nồng độ than hoạt tính 54 3.4.3. Nghiên cứu nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính 55 3.4.4. Xác định pH và thời gian nhả hấp phụ tốt nhất 56 3.4.5. Xác định tỷ lệ thành phần hỗn hợp dung môi sử dụng cho quá trình nhả hấp phụ chất kháng sinh 57 3.4.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố đến tính chất hoá lý của chất kháng sinh từ chủng S. oligocarbophilus TB5.4 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii 3.5. ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH SAU LÊN MEN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN S. oligocarbophilus TB5.4 ĐẾN KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA THÓC 60 3.5.1.Ảnh hƣởng của dịch kháng sinh thô đến khả năng nầy mầm của hạt 60 3.5.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dịch sau lên men đến quá trình nảy mầm của hạt 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined. KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 65 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT KTKS Khuẩn ty khí sinh KTCC Khuẩn ty cơ chất RF Cuống bào tử thẳng hay lƣợn sóng (Rectus-Flexibilis) RA Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu (Retinaculum aperturm) DNA Deoxyribonucleic acide RNA Ribonucleic acide CSBT Cuống sinh bào tử BMBT Bề mặt bào tử MT Môi trƣờng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Biểu hiện của lá lúa bị khi bị nhiễm bệnh bạc lá Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn Xanthomonas oryzae Hình 3.1 Vòng đối kháng chủng vi khuẩn X. oryzae 020 đƣợc tạo ra bởi các chủng xạ khuẩn bằng phƣơng pháp cục thạch Hình 3.2. Hoạt tính kháng chủng lại chủng vi khuẩn X. oryzae 020 từ dịch sau lên men của các chủng xạ khuẩn bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch Hình 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng TB5.4 trên môi trƣờng ISP4 sau 7 ngày nuôi ở nhiệt độ 28 C Hình 3.4. Hình dạng chuỗi và bề mặt bào tử chủng TB5.4 (x 15.000) Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn S. oligocarbophilus TB5.4 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn S. oligocarbophilus TB5.4 Hình 3.7. Nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính với các dung môi Hình 3.8. Định tính chất kháng sinh tách chiết và hệ số Rf có trong dịch sau lên men của chủng S.oligocarbophilus TB5.4 bằng sắc ký giấy Hình 3.9. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dịch ngâm ủ đến khả năng nảy mầm của hạt. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ x DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Sự phân bố theo nhóm màu của xạ khuẩn Bảng 3.2. Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn Bảng 3.3. Khả năng đối kháng của dịch sau lên men của các chủng xạ khuẩn với các chủng vi sinh vật kiểm định đối. Bảng 3.4. Đặc điểm nuôi cấy của chủng TB5.4 sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 28 C Bảng 3.5. Đặc điểm khuẩn lạc của chủng TB5.4 trên một số môi trƣờng Bảng 3.6. Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng TB5.4 Bảng 3.7. Khả năng đồng hoá đƣờng của chủng TB5.4 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến sinh trƣởng của chủng TB5.4 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng của chủng TB5.4 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng TB5.4 Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn TB5.4 với chủng chuẩn Streptomyces oligocarbophilus Bảng 3.12. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. oligocarbophilus TB5.4 trên một số MT lên men Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới hoạt tính kháng sinh của chủng S.oligocarbophilus TB5.4 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ tới hoạt tính kháng sinh của chủng S. oligocarbophilus TB5.4 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S. oligocarbophilus TB5.4 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S. oligocarbophilus TB5.4 Bảng 3.17. Ảnh hƣởng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. oligocarbophilus TB5.4 [...]... Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa , bao gồm các nội dung chính sau: 1 Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa từ các mẫu đất thu thập tại Nam Định và Thái Bình 2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, phân loại đến loài chủng xạ khuẩn 3 Nghiên cứu một số điều kiện lên... hoặc không vàng, có khi chỉ một đƣờng chỉ vi n màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng (hình 1.1) Hình 1.1 Biểu hiện của lá lúa bị khi bị nhiễm bệnh bạc lá 1.5.3 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa Vi khuẩn gây bệnh bạc lá là Xanthomonas oryzae (Uyeda et Ishiyama) Còn gọi là Pseudomonas oryzae Magrou, Xanthomonas oryzae pv oryzae Vi khuẩn X oryzae hình que hai đầu hơi tròn, có một lông... chất kháng sinh quý, trong đó có kháng sinh chống lại vi khuẩn Xanthomonas oryzae đây là tác nhân gây bệnh bạc lá Vấn đề đặt ra là làm 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu sao để sản xuất ra những chế phẩm sinh học có khả năng diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae trong phòng trừ bệnh bạc lá lúa phục vụ sản xuất nông nghiệp Với mục đích đó, tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh. .. khi nghiên cứu chọn lọc các chủng có hoạt tính cao Nhƣ vậy, sự hình thành bào tử và khả năng sinh kháng sinh ở xạ khuẩn có mối quan hệ nghịch [16, 24] 1.2.5 Sinh tổng hợp chất kháng sinh Xạ khuẩn là nhóm sinh vật có khả năng sinh kháng sinh cao, 60 - 70% xạ khuẩn phân lập đƣợc từ đất có khả năng này Trong số 9000 chất kháng sinh đã đƣợc biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra Chi... cân bằng Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử Đó là điểm cần lƣu ý trong khi nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn [12] Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn, ngƣời ta thƣờng mô tả hai pha: pha sinh trƣởng (trophophase): khuẩn ty sơ cấp phát triển nhanh với nguyên sinh chất đồng nhất làm giảm nguồn cacbon, nitơ và pH; pha sinh tổng... khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh thì xạ khuẩn là nhóm sinh vật có tiềm năng lớn Trong số, khoảng 9000 chất kháng sinh hiện đƣợc biết trên thế giới thì có khoảng 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn Hầu hết các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ tác động rộng, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loài vi sinh vật khác nhau Xạ khuẩn có nhiều trong đất, sử dụng các chủng xạ khuẩn có... sử dụng các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh tạo chế phẩm sinh học nhằm ức chế các nhóm vi sinh vật gây bệnh có trong đất góp phần hạn chế các bệnh có thể gây ra đối với cây trồng Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra đƣợc phát hiện đầu tiên ở Nhật Bản vào khoảng năm 1884-1885 Bệnh phổ biến ở hầu hết các nƣớc trồng lúa trên thế giới, đặc biệt là châu Á (Nhật... xạ khuẩn và vi khuẩn nhƣ: - Một số xạ khuẩn nhƣ các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium - Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào - Đƣờng kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với vi khuẩn Đồng thời xạ khuẩn thƣờng không chứa vách ngăn - Xạ khuẩn. .. nhóm xạ khuẩn hiếm 1.2 ĐẶC ĐIỂM VÀ CẤU TẠO CỦA XẠ KHUẨN 1.2.1 Đặc điểm hình thái Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt Trên môi trƣờng đặc xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc khô, kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi tùy từng loại và điều kiện hoàn cảnh Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn ƣớt nhƣ ở vi khuẩn, nấm men mà thƣờng có dạng thô ráp, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên gọi là xạ khuẩn. .. Trung tâm Học liệu Khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng chắc (dùng que cấy không di đƣợc khuẩn lạc của xạ khuẩn vì khuẩn ty cơ chất bám sâu trong thạch) Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc của xạ khuẩn không thể lẫn với khuẩn lạc của nấm vì khuẩn ty của xạ khuẩn thƣờng mảnh hơn của nấm mốc (khuẩn ty cơ chất 0,8µm; khuẩn ty khí sinh 1,14µm), đƣờng kính khuẩn ty nấm có . 1.5. BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA 22 1.5.1. Thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra đối với cây lúa 22 1.5.2. Biểu hiện của bệnh bạc lá trên lúa 23 1.5.3. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa. Xanthomonas oryzae trong phòng trừ bệnh bạc lá lúa phục vụ sản xuất nông nghiệp. Với mục đích đó, tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh. i VI N HÀN LÂM KH&CN VI T NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số: 60420114 Đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh diệt vi khuẩn