Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng MỤC LỤC A. MỞ ĐẦU Error: Reference source not found B. NỘI DUNG Error: Reference source not found 1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen Error: Reference source not found 2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen Error: Reference source not found 3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật . Error: Reference source not found 3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp Error: Reference source not found 3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens Error: Reference source not found 3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus Error: Reference source not found 3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp Error: Reference source not found 3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun) Error: Reference source not found 3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation)Error: Reference source not found 3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) Error: Reference source not found 3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm . . Error: Reference source not found 3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học Error: Reference source not found 3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) Error: Reference source not found 4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển genError: Reference source not found 4.1. Lợi ích Error: Reference source not found 4.2. Nguy cơ tiềm ẩn Error: Reference source not found Thủy Hồng 1 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng 5. Những thành tựu, triển vọng chủ yếu trong tạo giống cây trồng chuyển gen Error: Reference source not found 6. Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển gen Error: Reference source not found 6.1. Chuyển gen kháng sâu Error: Reference source not found 6.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏError: Reference source not found 6.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh Error: Reference source not found 6.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật Error: Reference source not found 6.5. Chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng các chất dinh dưỡng của cây Error: Reference source not found 6.6. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc Error: Reference source not found 7. Quy trình tạo hoa hồng xanh bằng kỹ thuật RNA interference (RNAi) Error: Reference source not found C. KẾT LUẬN Error: Reference source not found TÀI LIỆU THAM KHẢO Error: Reference source not found A. MỞ ĐẦU Một trong các kỹ thuật của công nghệ tế bào thực vật là kỹ thuật chuyển gen. Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật tạo ra cơ thể lai mang những tính trạng mong muốn. Phương pháp này được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây khác. Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai giữa những cá thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ do đó không thể tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gần cũng phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả mong muốn và Thủy Hồng 2 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng thông thường những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong những loài có họ hàng gần nhau. Kể từ năm 1984, là lúc người ta bắt đầu tạo được cây trồng chuyển gen và đến nay đã có những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng chuyển gen ra đời như lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả năng sản xuất những loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau. Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống. Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của những cơ thể chuyển gen. Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như sau: - Tăng sản lượng - Giảm chi phí sản xuất - Tăng lợi nhuận nông nghiệp - Cải thiện môi trường Thủy Hồng 3 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Những cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đã giúp giảm chi phí sản xuất. Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những cây chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Chẳng hạn như: - Lúa gạo giàu vitamin A và sắt - Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột - Vacxin thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây - Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng - Dầu ăn có lợi cho sức khỏe hơn từ đậu nành và cải dầu Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao gồm: - Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm - Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hoang dại - Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen - Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một số vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những vấn đề này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin tin cậy và có cơ sở khoa học. Thủy Hồng 4 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Triển vọng của công nghệ chuyển gen thực vật là rất lớn, cho phép tạo ra các giống cây trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho con người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, không thể luôn luôn có được. Đối với sự phát triển của công nghệ sinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệt quan trọng. Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống. B. NỘI DUNG 1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau: - Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency) - Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai Thủy Hồng 5 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng - Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau. Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu được tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây. - Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan. - Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN ngoại lai. Vì thế, cho đến nay chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm. - Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gen - Các ADN (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome - Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi mà nó được đưa vào - Trong khi đó, ADN của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem). Thủy Hồng 6 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng 2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gen có thể thực hiện nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà khoa học tin rằng Agrobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các cây trồng. Nhưng sau đó kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium không thể thực hiện được trên cây ngũ cốc (một lá mầm) vì thế mà hàng loạt các kỹ thuật chuyển gen khác đã được phát triển đó là các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp như bắn gen bằng vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) Đến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa. Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với cây chuyển gen ở thực vật. Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau: - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm - Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cADN hoặc từ thư viện genomic ADN) - Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp - Biến nạp vào E. coli - Tách chiết ADN plasmid - Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau đã kể trên - Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc - Tái sinh cây biến nạp - Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo khác ) Thủy Hồng 7 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng rẽ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh. Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận ADN ở phần lớn sinh vật là thành tế bào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym và dưới những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng. Sau khi biến nạp người ta tách những enzym phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo thành. Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo thành cây hoàn chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen. 3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. 3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens * Nguyên lý chung Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn Gram âm) để chuyển gen ở thực vật là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định. Sự chuyển gen ở thực vật dùng A. tumefaciens dựa trên nguyên lý như hình sau Thủy Hồng 8 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Hình1. Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gen cần chuyển (T-DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp Thủy Hồng 9 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand từ vùng T-DNA trên Ti-plasmid. Sau đó vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand và một số protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác với T-strand tạo ra phức hệ (T- complex). Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm. Hình 2. Vi khuẩn A.tumefaciens Cụ thể như sau: Phương pháp này sử dụng Ti plasmid của A.tumefaciens hoặc Ti plasmid của Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plamid gồm hai thành phần: T- DNA và vùng Vir. T- DNA có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính nhờ vậy mà có thể gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào. T- DNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục bộ (auxin, cytokinie), gen tổng hợp các chất Opine và gen gây khối u. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất kì đoạn nào trong vùng này cũng có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật. Trong plasmid vị trí của T- DNA được giới hạn bởi bờ trái và bờ phải. Thủy Hồng 10 Bộ gen của vi khuẩn Ti plasmid [...]... cyanidin, pelargonidin và delphinidin Gen cyanidin mã hóa một enzyme làm thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành chu trình cyanidin dẫn đến biểu hiện các màu đỏ, hồng hay màu tím hoa cà Trong khi đó gen delphinidin không hiện di n trong cây hoa hồng sẽ mã hóa một enzyme khá tương đồng cho việc thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành sự tổng hợp màu theo chu trình delphinidin Một loại enzyme khác có tên gọi là dihydroflavinol... delphinidin trên hoa hồng Yếu tố mới chính là một gen nhân tạo Gen này được tạo ra bởi nhóm các nhà di truyền học của công ty Suntory bằng kỹ thuật mới là RNA interference, viết tắt là RNAi Kỹ thuật này được tư vấn bởi viện CSIRO nhằm mục đích tắt sự hoạt động của gen hình thành màu đỏ trong hoa hồng Chính gen này đã đánh bại những nỗ lực của nhóm nghiên cứu Florigene nhằm làm hoạt hóa chu trình delphinidin... biểu bì thường chứa các sắc tố tạo màu sắc hoa Có 3 nhóm anthocyanin cơ bản được phát hiện là dẫn xuất của các chất pelargonidin, cyanidin và delphinidin Các sắc tố là dẫn xuất của pelargonidin thường có màu da cam, hồng và đỏ; của cyanidin có màu đỏ hoặc màu hoa cà; của delphinidin có màu tía, màu xanh và màu xanh đen Sự phối hợp của 3 nhóm anthocyanin này tạo ra phổ màu sắc hoa rất rộng Trên cơ sở... việc dùng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế hoạt động của gen DFR trong hoa hồng đỏ dẫn đến ức chế chu trình cyanidin và sau đó chuyển gen delphinidin với một gen DFR hoàn toàn mới nhằm hoàn chỉnh chu trình tổng hợp Thủy Hồng 30 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng delphinidin trong hoa hồng Cùng lúc đó các nhà nghiên cứu của công ty Suntory, Nhật Bản cũng có cùng ý tưởng bằng cách dùng kỹ thuật RNAi để... hoa hồng truyền thống bằng cách kết hợp một ít yếu tố cũ, một ít yếu tố mới, một ít yếu tố vay mượn và cuối cùng là một ít yếu tố tạo ra màu xanh Yếu tố tạo ra màu xanh trên hoa hồng chính là gen delphinidin mà các nhà di truyền của công ty Florigene đã clone từ loài hoa păng-xê để tổng hợp trực tiếp màu xanh trên cây hoa hồng Yếu tố vay mượn chính là gen iris nhằm tạo ra enzyme DFR (the dihydroflavonol... nằm trên plasmid của vi khuẩn, được gọi chung là Cry (crystal) Hình 5 Chuyển gen kháng sâu bệnh Thủy Hồng 24 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng 6.2 Chuyển gen kháng thuốc di t cỏ Thuốc di t cỏ glyphosat là thuốc có tác dụng di t cỏ tốt, dễ tự phân hủy và ít gây ô nhiễm môi trường Cơ chế di t cỏ là thuốc kìm hãm sự hoạt động của một enzym có tên là enol pyruvat sikimat phosphat synthetase (EPSPS)... bào cánh hoa thường mang tính di truyền Cánh hoa hồng thông thường có nồng độ pH khoảng 4,5 Chính vì vậy, để tạo ra các cánh hoa hồng có nồng độ pH thấp thì rất hạn chế Vì vậy, các nhà khoa học mới nghĩ đến kỹ thuật ức chế gen bằng kỹ thuật RNAi nhằm xác định những gen ảnh hưởng đến tính axít của cánh hoa hay điều chỉnh màu của cánh hoa theo những hướng khác Thủy Hồng 31 Kỹ thuật chuyển gen thực vật &... bao gồm kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phản ứng LCP (Ligase Chain Reaction), khuếch đại dựa trên trình tự axit nucleic (NASBA), kỹ thuật dấu vân tay (RFLP, AFLP, RAPD…), lai mẫu dò, sao chép trình tự duy trì liên tục (3SR) và khuếch đại enzym sao chép Q * Phương pháp dựa trên cơ sở protein: bao gồm điện di gel SDS một chiều, điện di gel SDS hai chiều, phân tích Western blot và kỹ thuật ELISA... trắng Trong hoa hồng không có gen delphinidin để hình thành màu theo chu trình của nó Chu trình delphinidin có thể hình thành màu đỏ hoặc xanh trên hoa dưới sự tác động của DRF và pH Để tạo ra một bông hồng màu xanh, các nhà nghiên cứu Florigene cần một loại bông hồng trắng trong đó gene DFR đã bị bất hoạt Vào năm 2001, TS.Waterhouse đã thảo luận việc sử dụng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế một gen mong muốn... hai công ty Florigene và Suntory dưới sự trợ giúp về mặt kỹ thuật của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Úc Châu (CSIRO) Hoa hồng xanh có thể được coi là chén thánh (Holy Grail) của những nhà lai tạo hoa hồng kể từ năm 1840 Khi đó hiệp hội làm vườn của Anh và Bỉ đã treo giải thưởng 500.000 francs cho người đầu tiên tạo được hoa hồng màu xanh Các nhà di truyền học phân tử của công ty Florigene và Suntory đã đoạt . thu được giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống. Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm. not found C. KẾT LUẬN Error: Reference source not found TÀI LIỆU THAM KHẢO Error: Reference source not found A. MỞ ĐẦU Một trong các kỹ thuật của công nghệ tế bào thực vật là kỹ thuật chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng MỤC LỤC A. MỞ ĐẦU Error: Reference source not found B. NỘI DUNG Error: Reference source not found 1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển