HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI : “NGHIÊN CỨU CHỌN GIỐNG LACTOBACILLUS PHỤC VỤ SẢN XUẤT SỮA ĐẬU XANH LÊN MEN” HÀ NỘI 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI : “NGHIÊN CỨU CHỌN GIỐNG LACTOBACILLUS PHỤC VỤ SẢN XUẤT SỮA ĐẬU XANH LÊN MEN” Người thực : Lê Thị Ngọc Linh Mã sinh viên : 620884 Lớp : K62QLTP Khóa : 62 Người hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Thị Minh ThS Lê Minh Nguyệt Bộ môn : Quản lý chất lượng an toàn thực phẩm HÀ NỘI 2021 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan kết q trình nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu chọn giống Lactobacillus phục vụ sản xuất sữa đậu xanh lên men” em thực hiện, số liệu trích dẫn có nguồn gốc rõ ràng, kết trình bày khóa luận thu thập từ q trình thực nghiên cứu chưa cơng bố nghiên cứu trước Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nội dung trình bày khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng 09 năm 2021 Sinh viên thực Lê Thị Ngọc Linh i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp, cố gắng thân em nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, bạn bè người thân Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Minh – Khoa Tài nguyên Môi trường – Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trình thực đề tài hoàn thành luận văn Đồng thời, em xin cảm ơn ThS Lê Minh Nguyệt – Khoa Cơng nghệ Thực phẩm nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình làm luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo Khoa công nghệ Thực phẩm – Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Trong q trình nghiên cứu hạn chế kiến thức, tài liệu thời gian nên khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy để nội dung khóa luận em hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng 09 năm 2021 Sinh viên thực Lê Thị Ngọc Linh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii PHẦN I MỞ ĐẦU .1 1.1 Tính cấp thiết đề tài .1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài: 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan hạt đậu xanh 2.1.1 Giới thiệu đậu xanh 2.1.2 Thành phần dinh dưỡng đậu xanh 2.1.3 Công dụng đậu xanh 2.1.4 Tình hình sản xuất tiêu thụ hạt đậu xanh Việt Nam Thế giới .5 2.2 Tổng quan sữa hạt 2.2.1 Giới thiệu sữa hạt 2.2.2 Thành phần sữa hạt .8 2.2.3 Công dụng sữa hạt 2.2.4 Xu hướng sử dụng sữa hạt 2.3 Giới thiệu sữa lên men 12 2.3.1 Nguồn gốc sữa lên men 12 iii 2.3.2 Quá trình lên men lactic 13 2.4 Tình hình nghiên cứu sữa sữa hạt lên men giới Việt Nam 15 2.4.1 Tình hình nghiên cứu sữa sữa hạt lên men giới 15 2.4.2 Tình hình nghiên cứu sữa sữa hạt lên men Việt Nam 16 2.5 Tổng quan lactobacillus 18 2.5.1 Giới thiệu lactobacillus 18 2.5.2 Phân loại lactobacillus 18 2.5.3 Một số loài thuộc giống Lactobacillus thường sử dụng để lên men Lactic .19 PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 21 3.2 Phạm vi nghiên cứu 21 3.3 Vật liệu hóa chất 21 3.3.1 Vật liệu thí nghiệm 21 3.3.2 Thiết bị, dụng cụ phân lập vi sinh vật .21 3.3.3 Hóa chất pha mơi trường 21 3.4 Nội dung nghiên cứu 22 3.5 Phương pháp nghiên cứu 22 3.5.1 Phương pháp phân lập .22 3.5.2 Quan sát đặc điểm hình thái đặc tính sinh hóa 22 3.5.3 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa tuyển chọn vi sinh vật 23 3.5.4 Phương pháp sản xuất sữa đậu xanh lên men 26 3.5.5 Phương pháp sản xuất đánh giá chất lượng chế phẩm .29 3.5.6 Phương pháp đánh giá tiềm năng, khả sử dụng Lactobacillus phân lập 29 iv 3.5.7 Phương pháp phân tích số liệu 32 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết phân lập giống Lactobacillus có khả lên men để sản xuất sữa đậu xanh lên men 33 4.2 Kết tuyển chọn giống Lactobacillus có khả lên men để sản xuất sữa đậu xanh lên men .35 4.2.2 Các đặc điểm chủng CP3 BC2 .37 4.2.3 Kết đánh giá khả kích ứng với nhiệt độ pH chủng CP3 BC2 38 4.3 Kết đánh giá chất lượng chế phẩm từ chủng vi sinh vật chọn 44 4.4 Kết đánh giá tiềm chủng Lactobacillus phân lập thử nghiệm sản xuất sữa đậu xanh lên men 44 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 53 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Phân loại Lactobacillus 18 Bảng 3.1 Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm sinh học .29 Bảng Yêu cầu cảm quan sữa tươi nguyên liệu 29 Bảng 3.3: Bảng đánh giá chất lượng sản phẩm 30 Bảng 3.4: Danh mục tiêu quan hệ số quan trọng tương ứng .31 Bảng 3.5 Các mức chất lượng 31 Bảng 4.1 Các chủng vi sinh vật phân lập 34 Bảng 4.2 Kết xác định hình thái tế bào 35 Bảng 4.3 Kết hàm lượng axit lactic dịch lên men chủng phân lập 36 Bảng 4.4 Đánh giá khả thích ứng nhiệt độ VSV .39 Bảng 4.5 Đánh giá khả thích ứng pH VSV .39 Bảng 4.6 Kết đánh giá khả kháng khuẩn hai chủng CP3 BC2 .41 Bảng 4.7 Đặc điểm sinh học chủng VSV chọn 43 Bảng 4.8 Chất lượng chế phẩm vi sinh sử dụng chủng CP3 BC2 44 Bảng 4.9 Kết đánh giá cảm quan sữa đậu xanh 45 Bảng 4.10 Kết cho điểm CT1 .46 Bảng 4.11 Kết cho điểm CT2 46 Bảng 4.12 Kết cho điểm CT3 .47 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây đậu xanh Hình 2.2 Sản lượng sản xuất sữa nước, 2014 – Q1/2020 10 Hình 2.3 Cơ cấu thị trường sữa Việt Nam năm 2018 .11 Hình 2.4 Dự báo mức độ tăng trưởng dòng sản phẩm từ sữa .11 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất sữa đậu xanh lên men 27 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B) chủng CP3 nhuộm Gram kính hiển vi x40 .37 Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B) chủng BC2 nhuộm Gram kính hiển vi x40 .37 Hình 4.3 Khả di động chủng CP3 BC2 38 Hình 4.4 Khả đối kháng VSV gây bệnh đường ruột chủng CP3 .41 Hình 4.5 Thí nghiệm lên men sữa đậu xanh .48 vii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, với phát triển kinh tế, đời sống người dân ngày cải thiện nâng cao Con người dần hướng đến thực phẩm tự nhiên lành tính, đảm bảo chất lượng, cảm quan, giàu giá trị dinh dưỡng tốt cho sức khỏe Ngoài sản phẩm sữa bò, sữa tươi tiệt trùng, ngày sữa hạt dần nhiều người ưa chuộng giàu dưỡng chất từ nơng sản, có lợi cho sức khỏe gần gũi tự nhiên, đem đến hương vị mới, lựa chọn cho người tiêu dùng Sữa hạt tên gọi loại thức uống chế biến từ hạt Vì thế, có nhiều loại sữa “ thực vật” với tên gọi theo hạt để chế biến Trong đậu xanh số loại hạt sử dụng phổ biến Ngoài tác dụng làm thực phẩm, đậu xanh dùng để làm đẹp chữa bệnh hiệu giải độc, nhiệt, tiêu khát Loại thực phẩm sử dụng làm thuốc từ lâu đời Trong sách “ Nam dược thần hiệu” danh y Tuệ Tĩnh có viết: “ Đậu xanh khơng độc, nhiệt, làm mát nước tiểu, chữa lở loét, làm sáng mắt, trị nhiều bệnh” Một thành phần để sản xuất sữa hạt lên men giống Lactobacillus mang đặc tính probiotic, chủng vi sinh vật có lợi cần thiết để bổ sung vào hệ tiêu hóa người Việc sử dụng vi sinh vật probiotic thực tế mang lại nhiều ảnh hưởng tích cực sức khỏe người, thơng qua đặc tính probiotic vốn có chúng Điển hình, giống Lactobacillus sử dụng điều trị chứng bệnh rối loạn đường tiêu hóa, khắc phục số hạn chế việc điều trị kháng sinh dài ngày, giúp đồng hóa lactose sữa uống bệnh nhân khơng có khả dung nạp lactose sữa Bên cạnh đó, chúng cịn có khả ảnh hưởng đến hoạt tính chuyển hóa dinh dưỡng nhờ đồng hóa cholesterol, tạo vitamin giải phóng enzyme có lợi giúp cho việc tăng hệ số tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn, hấp thu chất dinh dưỡng cần thiết, đồng thời có tác dụng khử chất có khả gây ung thư hợp chất độc hại, kích thích điều hịa hệ khảo sát hoạt tính đối kháng hai chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu với chủng khuẩn kiểm định chuyên gây bệnh đường ruột cho người động vật Hoạt tính ức chế đánh giá thơng qua kích thước vành kháng khuẩn (( D-d)/2, mm) Kết thể bảng 3.4 Từ bảng 3.4, hai chủng có khả ức chế Gram âm Gram dương Nhờ có tồn chúng ruột người gây bất lợi cho vi khuẩn gây bệnh gây thối đường ruột Khả kháng khuẩn mà người thực đo không khác biệt với chủng Lactobacillus phân lập từ phân trẻ em thí nghiệm Hồng Quốc Khánh Phạm Thị Lan Thanh (2011) , có khác biệt kích thước vành kháng khuẩn Đặc biệt chủng Lactobacillus CP3 có khả ức chế vi khuẩn Salmonella Từ kết cho thấy hai chủng Lactobacillus CP3 Lactobacillus BC2 tạo hợp chất kháng khuẩn gồm acid hữu hợp chất kháng khuẩn khác Các hợp chất kháng khuẩn bacteriocin, hydro peroxide, diacetyl, reutorin Chính thành phần tạo khả ức chế vi khuẩn thị dịch ly tâm vi khuẩn Khi xét tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị, người thực nhận thấy chủng Lactobacillus CP3 có khả kháng mạnh kháng nhiều vi khuẩn thị chủng Lactobacillus BC2, đặc biệt ức chế Salmonella Khi tiến hành đo vòng kháng khuẩn đĩa petri, phương pháp đo thô sơ, dựa mắt thường dùng thước mm để đo Kết có độ tin cậy khơng cao, chưa có độ nhạy kết quả, ngồi cần chuẩn hóa độ dày môi trường, nồng độ vi khuẩn thị thể tích dịch ly tâm cho vào giếng thạch 40 Bảng 4.6 Kết đánh giá khả kháng khuẩn hai chủng CP3 BC2 VSV định kiểm Khả gây bệnh Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) CP3 BC2 E.coli Viêm ruột,tiêu chảy 2,34 2,08 Pseudomonas aeruginosa Viêm màng Trong tim; Viêm đường hô hấp, 2,75 2,53 Salmonella Tiêu chảy, ói mửa, buồn nơn 3,12 Pseudomonas aeruginosa E.coli Hình 4.4 Khả đối kháng VSV gây bệnh đường ruột chủng CP3 Qua kết khảo sát đặc tính sinh lý sinh hóa chủng cho thấy hai chủng mang đặc điểm : tế bào hình que, khơng có khả di động, hiếu khí tùy nghi, catalase âm tính, sử dụng nhiều nguồn đường khác để lên men Khi so sánh với khóa phân loại Bergey‟s (1986) (Bảng 3.3) cho phép kết luận chủng CP3 BC2 thuộc Họ: Lactobacillaceae Chi: Lactobacillus Dựa sở nguồn phân lập đặc điểm sinh lý- sinh hóa hai 41 chủng, cho phép xác định hai chủng thuộc chi Lactobacillus, kí hiệu lại Lactobacillus CP3 Lactobacillus BC2 42 Bảng 4.7 Đặc điểm sinh học chủng VSV chọn ST T KH CP3 Vịng kích thước 12mm Đặc điểm khuẩn lạc Hình dạng tế bào Trịn lồi Que dài Trắng sữa Tính chất gram Khả di động Hoạt tính catalase Lên men đường Hoạt tính Proteas e pH Gluco se Malto se Mann itol Lacto se Saccha rose Nhiệt độ (°C) Vòng đối kháng (D-d, mm) E.coli Pseudo monas aerugi nosa Salmo nella G+ - - - + + + + + 30°C 2,34 2,75 3,12 G+ - - - + + + + + 30°C 2,08 2,53 1,2 chuỗi ngắn BC2 12mm Tròn lồi Que dài Trắng sữa 1,2 chuỗi ngắn Ghi chú: (+) Dương tính (-) Âm tính 43 4.3 Kết đánh giá chất lượng chế phẩm từ chủng vi sinh vật chọn Sau phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật thích hợp, cần tiến hành đưa chủng vi sinh vật vào sản xuất chế phẩm làm tăng sinh khối vi sinh vật, dễ dàng đưa vào nguyên liệu tạo sản phẩm Các phương pháp hay chọn để sản xuất chế phẩm lên men chìm lên men bán rắn Tuy nhiên, phương pháp lên men bán rắn đặc biệt thích hợp với phát triển nấm chúng yêu cầu độ ẩm thấp so với vi khuẩn (Ogawa cộng sự, 1995) Ngoài ra, phương pháp lên men tương đối đơn giản, chi phí rẻ mang lại khả sinh tổng hợp enzym cao (Wang cộng sự, 2005) Cơ chất sử dụng cho phương pháp thường sản phẩm nông nghiệp dễ kiếm như: đậu xanh Vì vậy, tiến hành sản xuất chế phẩm dạng bán rắn theo quy định vi sinh vật, khoa môi trường, học viện nông nghiệp Việt Nam Chất lượng chế phẩm thể bảng 4.7 Bảng 4.8 Chất lượng chế phẩm vi sinh sử dụng chủng CP3 BC2 Chủng VSV Mật độ VSV hữu ích (108 CFU/ml) Mật độ VSV tạp CP3 3,14 0,16 >1,0x108 BC2 2,27 0,24