13 CHƯƠNG 3: TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG 11 3.1 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) HPLC là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do: có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số l ĩnh vực khác. Hợp chất có thể phân tích bằng sắc ký lỏng như acid amin, protein, acid nucleic, hydrocacbon, carbohydrate, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu, các hợp chất vô cơ… Dựa vào sự khác nhau về cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà người ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến. Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng pha thường và sắc ký lỏng pha đảo.  Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động, dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.  Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký pha thường, pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn. Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa. Dung môi sử dụng là dung môi phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền, do đó sắc ký lỏng pha đảo được sử dụng nhiều nhất. 3.2 CÁC THÔNG SỐ CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG 12 3.2.1 Hệ số phân bố Cân bằng của một cấu tử trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình đơn giản sau: A pha động  A pha tĩnh 14 Hệ số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố và được tính như sau: Cs: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh Cm: nồng độ cấu tử trong pha động S: Pha tĩnh M: Pha động K tùy thuộc bản chất pha tĩnh, pha động và chất hòa tan. K nhỏ: chất di chuyển nhanh; K lớn: chất di chuyển chậm. Thông thường K  1 để chất có ái lực với pha tĩnh nếu không thì nó sẽ di chuyển nhanh quá làm cho khó tách. Hai chất muốn tách ra khỏi nhau thì phải có K khác nhau. 3.2.2 Thời gian lưu t R Là thời gian để chất phân tích sau khi tiêm vào cột đến đầu dò được tính theo công thức: t R = t’ R + t M t M : thời gian lưu chết của cấu tử không bị giữ lại trên cột, được tính gần đúng theo công thức: 2 M 0,5 ( ) t Ldc V   trong đó: L: chiều dài cột, cm time M S C C K  15 dc: đường kính cột, cm V: tốc độ dòng pha động, mL/phút Có thể nhận danh chất thông qua thời gian lưu vì trong điều kiện thí nghiệm trên cột thiết bị sắc ký lỏng nhất định, thời gian lưu của chất đó là một đại lượng xác định. Thời gian lưu càng lớn thì hệ số phân bố càng lớn. 3.2.3 Hệ số dung lượng Để mô tả tốc độ lưu của cấu tử phân tích trong cột người ta sử dụng một hệ số quan trọng gọi là hệ số dung lượng k’. Cs.Vs ' C.V MM M Vs kK V  Vs: thể tích pha tĩnh Vm: thể tích pha động k' có thể tính theo công thức k’ phải > 1 để peak của chất tan tách khỏi peak của dung môi nhưng không quá lớn vì lúc đó thời gian phân tích sẽ kéo dài và mũi bị tù do chất ở trong cột quá lâu. Khoảng k’ lý tưởng là từ 2 đến 5 nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp chúng ta có thể chấp nhận k’ trong khoảng từ 0,5 đến 20. k’ tăng hoặc giảm tùy thuộc độ mạnh của dung môi pha động. Trong s ắc ký phân bố pha đảo ngược, độ mạnh của dung môi tăng theo phần trăm chất hữu cơ. Thông thường trong sắc ký phân bố pha đảo ngược, khi giảm dung môi hữu cơ trong pha động 10% thì k’ sẽ tăng lên gấp 2 đến 3 lần. 3.2.4 Hiệu năng Khi nói đến hiệu năng của cột là nói đến khả năng tách mũi sắc ký của một cấu tử trên cột. Độ hiệu năng N được biểu diễn như số đĩa lý thuyết của cột. N càng lớn hiệu năng tách của cột càng lớn. M MR ' t tt k   2 2 1 R 2 R w t 5,55 w t 16 H L N                 16 Với W: bề rộng mũi sắc ký W 1/2 : bề rộng của mũi ở phân nửa chiều cao Số đĩa lý thuyết càng lớn, bề rộng W càng nhỏ, mũi càng nhọn. 3.2.5 Độ chọn lọc  22 2 11 1 ' α ' RM R RM R Ktt t Ktt t     Độ chọn lọc  là một thông số rất quan trọng, liên quan tới khả năng tách của các cấu tử cần phân tích, nó tùy thuộc bản chất của pha tĩnh, pha động. Hai chất tách được khi  # 1 và  càng lớn, khả năng tách càng cao. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ chọn lọc như thành phần dung môi pha động, pH của môi trường, bản chất của pha tĩnh, nhiệt độ. Trong đó sự thay đổi pha động từ dung môi này sang dung môi khác sẽ làm  thay đổi đáng kể. 3.2.6 Độ phân giải Độ phân giải (R s ) tùy thuộc vào điều kiện pha động, pha tĩnh và đặc tính của hợp chất cần phân tích mà ta có được sắc ký đồ với những mũi phủ lên nhau hoặc tách hẳn nhau. Độ phân giải R s là một thông số dùng để đánh giá mức độ tách phổ, khả năng tách của các mũi sắc ký sẽ có ý nghĩa quan trọng trong việc phân tích một cách định lượng. Phương trình trên thích hợp cho việc tính R s khi 2 mũi tách hẳn nhau (R s  1,5). Trong trường hợp R s nhỏ hơn, tức mũi bị trùng lấp thì việc xác định W 1 và W 2 sẽ khó khăn hơn là W 1/2 (1) và W 1/2 (2) lúc này R s sẽ được tính theo: 21 1/2(1) 1/2(2) 1,18 RR tt Rs WW    ' A ' B A B K K K K α  2 ww tt R 21 RR S 12    17 2 2 '1 41 '1 s k RN k              Khi k’ 1 = k’ 2 , →1:  1' 1 4'1 s k RN k         Để có thể phân tích một cách định lượng thì 2 mũi kề nhau phải tách hẳn nhau, tức R s  1,3. Khi R s  1 cần phải thay các thông số thực nghiệm để làm tăng R s . Tóm lại: khi tiến hành một quy trình phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, thì cần chú ý tới khả năng phân tách của các mũi trên sắc ký đồ. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng lên phép xác định và tùy theo yêu cầu cần phân tích định tính, định lượng hay bán định lượng mà chúng ta sẽ tối ưu hóa các thông số thực nghiệm của pha tĩnh cũng như pha động cho hợp chất cần nghiên cứu. 3.3 GIỚI THIỆU CÁC BỘ PHẬN CỦA THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính: bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký phân tích, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu. Hình 10: Mô hình cơ bản của HPLC. Nguyên lý hoạt động: mẫu sau khi được tiêm vào cột sẽ được pha động lôi kéo qua cột. Dựa vào khả năng tương tác khác nhau giữa các chất có trong nền mẫu với pha tĩnh và pha động mà chúng được tách ra khỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi bộ dò cụ thể. 18 Sắc ký lỏng có thể ghép với nhiều loại đầu dò khác nhau như đầu dò phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis, đầu dò huỳnh quang FLD, đầu dò chỉ số khúc xạ RID, đầu dò điện hóa ECD, đầu dò khối phổ MS… Hiện nay đầu dò khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong phân tích vết và các hợp chất nhận danh chính xác. Tùy theo tính chất của chất cần khảo sát mà ta có thể chọn lựa pha tĩnh, pha động (bảng 1). Loại cột Pha tĩnh Dung môi Chất cần phân tích C18 Octyldecyl ACN, MeOH, H 2 O Không phân cực C8 Octyl ACN, MeOH, H 2 O Không phân cực Phenyl Styryl ACN, MeOH, H 2 O Axit béo, chất có liên kết đôi Cyano Cyanopropyl ACN,MeOH,H 2 O, THF Xeton, aldehyd Amino Aminopropyl ACN, MeOH, H 2 O, THF, CHCl 3 , CH 2 Cl 2 Đường, anion Diol Dihydroxyhexyl ACN, MeOH, H 2 O, THF Protein SAX Aromatic Quaterany Đệm Anion Aromatic Đệm SCX Acid sulfonic ACN, MeOH, H 2 O Cation Alkyl ether Đệm Diethyl aminoethyl DEAE Diethylamine ACN, MeOH, H 2 O Protein, anion Alkyl ether Đệm CM Acid acetic ACN, MeOH, H 2 O Protein, cation Si Hexane Silica Silanol chloroform Hợp chất hữu cơ phân cực, đồng phân Bảng 1: Loại cột, pha tĩnh, pha động và hợp chất phân tích thông dụng 13 . 19 Để định lượng anthocyanin trong các dịch trích bằng phương pháp HPLC người ta còn kết hợp đầu dò UV/Vis với đầu dò ECD. Không giống HPLC bán định lượng chỉ để làm sạch, HPLC- UV/Vis- ECD dùng để phân tích. Chất phân tích được tiêm tự động và cùng với pha động tới cột. Các hợp phần khác tương tác khác nhau với pha tĩnh và pha động. Chất phân tích sau khi được rửa giải đi đến detector một cách riêng biệt. Phương pháp HPLC-UV/Vis-ECD có một số đặc điểm sau:  Pha động: Pha động trong HPLC được đưa liên tục vào hệ thống. Pha động có thể theo chương trình gradient dòng hoặc đẳng dòng, nhưng pha động cố định thường mất thời gian lâu và khó tách các mũi. Hiện nay thường dùng nhất là dạng gradient. Khi rửa giải trong sắc ký pha đảo, lượng dung môi hữu cơ tăng dần lên. Tại lúc tiêm mẫu, một lượng pha động yếu hơn đi vào hệ (ít hợp phần hữu cơ hơn). Sau đó lại t ăng tỉ lệ hữu cơ trong pha động lên để rửa giải tất cả những chất bị giữ lại ở pha tĩnh.  Cột 10 : Có nhiều loại pha tĩnh khác nhau, dẫn đến cơ chế rửa giải cũng khác nhau. Trong nghiên cứu này sử dụng cột pha đảo với pha tĩnh không phân cực và pha động phân cực. Pha tĩnh chứa các hợp phần giống RMe 2 SiCl với R là các nhóm alkyl (C 18 H 37 hoặc C 8 H 17 ). Hợp phần không phân cực có ái lực với pha tĩnh nên thời gian lưu dài hơn. Thời gian lưu có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi độ phân cực của pha động. Đường kính trong của cột lớn tạo sức chứa lớn, được dùng trong HPLC bán điều chế để làm sạch anthocyanin. Cột phân tích dùng trong HPLC-UV/Vis-ECD có đường kính trong ID nhỏ hơn (C 18 250 x 4.6mm). 3.3.1. Đầu dò UV-Vis Đầu dò có gắn đèn UV (thường là đèn deuterim 190-360nm) và đèn Vis (đèn tungsten, 360-800nm). Vì vậy các hợp phần hấp thu ánh sáng từ khoảng 180- 800nm sẽ được đầu dò phát hiện. Chất phân tích sau khi rửa giải ra khỏi cột chuyển qua 1 tế bào cảm biến hình trụ. Ánh sáng trong vùng UV/Vis truyền qua tế bào tới mảng quang điện. Nếu chất phân tích hấp thu được ánh sáng ở 1 bước sóng nào đó, mảng quang điện sẽ phát hiện ra sự thay 20 đổi. Tín hiệu phát ra từ mảng quang điện sẽ chuyển tới bộ khuếch đại đến bộ ghi đo và hệ thống thu dữ liệu. Cường độ dòng sáng truyền qua cell đo (I) tỉ lệ với nồng độ của chất phân tích theo định luật Lamber- Beer ( - hệ số hấp thu phân tử, c- nồng độ (mol/L), l- chiều dài đường truyền quang (l luôn là 1 cm), I o là cường độ của tia sáng tới cell): A=   l  c 10 0 A log tiem I I DientichECD C FVn DientichUV C l             Anthocyanin có 2 bước sóng hấp thu ở 530nm và 280nm, vì vậy có thể sử dụng đầu dò UV/Vis. Trong HPLC định lượng, có thể dùng UV/Vis kết hợp với ECD hoặc với MS. 3.3.2. Đầu dò ECD: 3.3.2.1 Tính chất điện hóa của anthocyanin: Hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất thiên nhiên phụ thuộc vào số lượng các phân tử hiện diện trong mẫu và cấu trúc của chúng, ví dụ vị trí nhóm -OH hay -OCH 3 . Anthocyanin có đặc tính chống oxi hóa do các nhóm -OH trên vòng thơm. Chất chống oxi hóa là một chất khử khi tương tác với các gốc tự do, nghĩa là chúng bị oxi hóa trên bề mặt điện cực. Chất chống oxi hóa ngăn sự hình thành và hoạt động của oxi và nitơ. Ta có thể thấy ở hình 11, nhóm catechol ở vòng B và các nhóm resorcinol ở vòng A của catechin có thể bị oxi hóa. Vòng A và B không liên hợp nhau nên sự oxi hóa các nhóm -OH của vòng này không ảnh hưởng tới các nhóm -OH trên vòng kia. Cấu trúc catechin có các nhóm -OH gắn vào vòng thơm có thể bị oxi hóa. Vòng B dễ bị oxi hóa hơn vòng A, vì vậy khi áp thế 100 ÷ 800mV thì các -OH trên vòng B sẽ bị oxi hóa, trên 1500mV vòng A sẽ bị oxi hóa. 21 Hình 11: Sự oxi hóa của các nhóm catechol. Một số nghiên cứu cho thấy các nhóm -OH ở vị trí meta (trên vòng A) khó bị oxi hóa hơn ở vị trí para hoặc ortho (trên vòng B). Kết quả là, anthocyanin sẽ bị oxi hóa nhiều bước ở các thế áp khác nhau, tùy vào thứ tự oxi hóa của các nhóm -OH khác nhau. So với đầu dò UV/Vis, đầu dò ECD nhạy hơn và chọn lọc hơn đối với anthocyanin có hàm lượng nhỏ. Cơ chế của quá trình oxi hóa xảy ra theo thứ tự sau: 1. Sự oxi hóa các nhóm -OH trên vòng B ở thế dương bé 2. Sự oxi hóa các nhóm -OH trên vòng A ở thế cao hơn Thế oxi hóa tùy thuộc vào pH, khi pH tăng lên sẽ làm giảm thế oxi hóa. Nói chung, các nhóm -OH ở vị trí ortho trên vòng B bị oxi hóa ở 450mV. Nhóm methoxyl và đường làm tăng khả năng chống oxi hóa của anthocyanin. Vòng A và B không liên hợp nhau nên sự oxi hóa của các nhóm -OH trên vòng A không ảnh hưởng đáng kể tới sự oxi hóa các nhóm -OH ở vòng B và ngược lại. Vì vậy từ phương pháp quang phổ có thể kết luận rằng vòng A không ảnh hưởng trên tính chất phổ của các gốc tự do t ừ vòng B. 3.3.2.2 Nguyên lý của HPLC/ECD 6,14,15,16 22 Thiết kế máy HPLC - ECD về mặt cơ bản không khác gì HPLC truyền thống, ngoại trừ đầu dò quang học được thay bằng đầu dò ECD. Đầu dò ECD được dùng từ 1974. Lược đồ về cơ chế mô tả hệ thống HPLC - ECD ở hình 14. Thiết bị gồm bơm để đẩy dung môi động bằng áp suất hệ thống. Cột phân tích chứa vật liệu nhồi cột (thường là lớp nền trơ đượ c phủ với bề mặt kị nước, chẳng hạn các dẫn xuất của hydrocacbon đa vòng) để phân tách chất dựa trên thời gian lưu. Đầu dò điện hóa nối trực tiếp với cột. Để tăng hiệu suất và độ lặp lại, mẫu được tiêm bằng hệ thống tiêm mẫu tự động, bộ tạo gradient điều khiển thành phần pha động, tất cả các hệ thống này đều phục vụ cho máy tính và máy tính thu phổ sắc ký đồ. Để làm phong phú phần dữ liệu, đầu dò PDA nối trực tiếp và đặt trước đầu dò ECD. Thành phần pha động chứa nồng độ chất điện ly cao để thuận tiện cho dòng đi qua đầu dò ECD. Thường pha động ở môi trường acid chứa Li 3 PO 4 hoặc Na 3 PO 4 . Li 3 PO 4 dễ tan trong dung môi hữu cơ (MeOH hoặc ACN) và vi khuẩn không phát triển khi có mặt Li nên Li 3 PO 4 thường ưa dùng trong dung môi động. Cần làm sạch dung môi động với khí trơ He để loại oxi vì oxi cản trở việc phát hiện chất phân tích siêu nhạy. Khi chất phân tích đi qua điện cực làm việc (điển hình là điện cực Cacbon nhưng thường là điện cực kim loại), phản ứng hóa học xảy ra nhờ đó chất phân tích mất một (hoặc nhiều) điện tử. Nhữ ng điện tử này được phát hiện bằng một dòng chảy qua điện cực làm việc. Vì thế, tín hiệu hóa học chuyển thành tín hiệu điện tử mà không cần chất mang từ tính trung gian. Dòng chảy qua điện cực làm việc vào một thời điểm nào đó là một hàm tuyến tính với số phân tử bị oxi hóa tại bề mặt điện cực. Thế điện hóa củ a điện cực làm việc có thể biến đổi để xác định một cách chọn lọc chất phân tích; bất kì chất nào ra khỏi cột sắc ký mà không bị oxi hóa dưới thế áp vào thì đầu dò sẽ không phát hiện được. Do đó ECD có một chức năng chọn lọc nội tại mà các hệ thống đầu dò khác không có. Thêm vào đó, ECD cực kỳ nhạy, giới hạn phát hiện nhỏ gấp 10 ÷ 1000 lần độ nhạy c ủa đầu dò UV/Vis và gấp 10 lần đầu dò huỳnh quang. [...]... Cột sắc ký lỏng cho phép tách chất cần quan tâm, khối phổ cho phép tách ion cần quan tâm và cho biết phân tử lượng của chất phân tích Một hệ thống LC/MS/MS sẽ phân mảnh ion mẹ thành các ion con và tách các ion con để định danh và định lượng Một hệ LC/MS cơ bản gồm hệ thống bơm sắc ký lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký, đầu dò khối phổ Nhiệm vụ của đầu dò khối phổ:  Nhận danh hóa chất: Một mũi trên sắc. .. thiệu về LC/MS/MS12 Sắc ký lỏng ghép khối phổ là một thiết bị lý tưởng cho các phòng thí nghiệm LC/MS là phương pháp được dùng trong phân tích vết và các hợp chất cần nhận danh chính xác vì trong những điều kiện vận hành nhất định ngoài thời gian lưu đặc trưng, hóa chất còn được nhận danh bằng khối phổ của nó Độ nhạy LC/MS tùy thuộc vào hợp chất cần phân tích và giao diện sử dụng Trong sắc ký lỏng ghép... khối phổ:  Nhận danh hóa chất: Một mũi trên sắc ký đồ với thời gian lưu xác định đặc trưng cho hóa chất, tR này chính là thời gian từ lúc hóa chất bắt đầu vào cột và ra khỏi cột để vào đầu dò khối phổ 30 Mũi này biểu diễn tổng cường độ các ion sinh ra từ phân tử hóa chất thông qua kỹ thuật ion hóa xác định Tổng các mũi này trên sắc đồ hợp thành sắc đồ tổng ion (total ion chromatogram) Mũi này cũng... Cuối cùng, các ion có tỉ lệ khối lượng/điện tích đặc trưng được phát hiện Dòng ra của đầu dò được khuếch đại và ghi đo Chất phân tích từ sắc ký lỏng hoặc bơm xy lanh chuyển qua kim phun, tạo các giọt tích điện ở cuối đầu kim Dòng He không tích điện trung hòa chất lỏng và giúp dung môi bay hơi thành giọt Khi dung môi bay hơi, các phân tử chất phân tích bị đẩy gần nhau hơn, 35 chúng đẩy lẫn nhau và các... tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion: OH· + M → (M-H)- + H2O  Kỹ thuật phun ion ESI: - Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế và sau đó được phun mịn bằng khí N2 thoát ra chung quanh ống mao quản - Dưới tác dụng của điện thế cao, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản - Sau đó các phân... bởi đầu dò điện hóa n: số electron trao đổi liên quan tới quá trình điện cực C: nồng độ của chất hoạt động điện cực Vtiêm: thể tích tiêm (L) F: hằng số Faraday = 96500 (C/mol) ntiêm là số mol chất phân tích được tiêm vào máy Nếu biết được số electron trao đổi n trong hợp chất có tính điện hóa, sẽ biết được nồng độ chất phân tích từ diện tích peak ở sắc ký đồ HPLC- ECD 26 Hình 14: Sơ đồ của hệ HPLC-... nhiều điện tử (tức là chất phân tích bị oxi hóa) Những điện tử này được phát hiện dưới hình thức dòng điện chạy qua điện cực làm việc Do đó thông tin hóa học về chất phân tích được chuyển thành tín hiệu điện mà không cần chất mang từ tính hoặc quang học trung gian Dòng chạy qua pin điện hóa ở bất kì thời điểm nào đều tuyến tính với số mol được oxi hóa trên bề mặt pin tại thời điểm đó Thế điện hóa của... lọc hơn dựa trên thế oxi hóa; bất kì hợp chất nào đi ra khỏi cột mà không oxi hóa dưới thế áp vào cell đo thì đầu dò sẽ không nhận ra Do vậy đầu dò ECD có một chức năng chọn lọc nội tại mà các đầu dò quang học không có Tuy nhiên, loại đầu dò này ít nhiều không hiệu quả vì chỉ có 5 - 10% chất phân tích chuyển qua điện cực làm việc sẽ khuếch tán đến bề mặt điện cực và thực hiện quá trình điện hóa Do... dung dịch ở phần biên giúp các điều kiện được thỏa mãn Vì vậy, đầu dò nhạy hơn 10 - 20 lần đầu dò ampe vì cải thiện được sự truyền khối Trong thực hành đầu dò ampe và đầu dò coulom không khác nhau nhiều về độ nhạy nhưng nhìn chung đầu dò culong được ưa chuộng hơn 3.3.2.3 Cơ chế Các chất có thể khử hoặc oxi hóa trải qua phản ứng oxi hóa trên bề mặt điện cực, tạo sự thay đổi dòng và được đầu dò ECD ghi... pin điện hóa: 1 cặp điện cực được đặt vào trong pin và áp thế dọc theo điện cực Khi thế đủ lớn, phản ứng diễn ra và xuất hiện dòng điện Cường độ dòng I được ghi đo theo thời gian, diện tích peak ứng với tổng điện tích Q trao đổi giữa điện cực và chất có hoạt tính điện hóa, được tính theo công thức sau: Diện tích peak = Q = i dt 25 Định luật điện phân Faraday liên kết Q với nồng độ chất hoạt động điện . tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà người ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng. 13 CHƯƠNG 3: TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG 11 3.1 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) HPLC là một phương pháp tách và phân tích. theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng pha thường và sắc ký lỏng pha đảo.  Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung