1 1 S S ả ả n xu n xu ấ ấ t protein t protein trên quy mô l trên quy mô l ớ ớ n n 2 2 Nuôi c Nuôi c ấ ấ y c y c á á c vi sinh v c vi sinh v ậ ậ t trên quy mô l t trên quy mô l ớ ớ n l n l à à phương ph phương ph á á p kinh t p kinh t ế ế nh nh ấ ấ t t do c do c ó ó c c á á c ưu đi c ưu đi ể ể m sau: m sau: - - S S ử ử d d ụ ụ ng c ng c á á c môi trư c môi trư ờ ờ ng đơn gi ng đơn gi ả ả n, r n, r ẻ ẻ ti ti ề ề n. n. - - C C á á c chu k c chu k ỳ ỳ lên men ng lên men ng ắ ắ n ng n ng à à y. y. - - C C ó ó th th ể ể ki ki ể ể m so m so á á t tr t tr ạ ạ ng th ng th á á i sinh lý c i sinh lý c ủ ủ a vi a vi sinh v sinh v ậ ậ t trong qu t trong qu á á tr tr ì ì nh lên nh lên men v men v à à đ đ ả ả m b m b ả ả o đư o đư ợ ợ c t c t í í nh đ nh đ ồ ồ ng nh ng nh ấ ấ t c t c ủ ủ a c a c á á c c m m ẻ ẻ lên men. lên men. 3 3 Nuôi c Nuôi c ấ ấ y c y c á á c vi sinh v c vi sinh v ậ ậ t trên quy mô l t trên quy mô l ớ ớ n l n l à à phương ph phương ph á á p kinh t p kinh t ế ế nh nh ấ ấ t t do c do c ó ó c c á á c ưu đi c ưu đi ể ể m sau: m sau: - - C C ó ó th th ể ể k k ế ế ho ho ạ ạ ch h ch h ó ó a vi a vi ệ ệ c thu ho c thu ho ạ ạ ch protein ch protein m m ộ ộ t c t c á á ch h ch h ợ ợ p lý, ph p lý, ph ù ù h h ợ ợ p v p v ớ ớ i c i c á á c qu c qu á á tr tr ì ì nh nh phân t phân t á á ch v ch v à à tinh s tinh s ạ ạ ch đ ch đ ầ ầ u ra. u ra. - - Hi Hi ệ ệ u su u su ấ ấ t protein c t protein c ó ó th th ể ể đư đư ợ ợ c tăng lên nhi c tăng lên nhi ề ề u u l l ầ ầ n b n b ằ ằ ng c ng c á á ch c ch c ả ả i thi i thi ệ ệ n c n c á á c ch c ch ủ ủ ng truy ng truy ề ề n th n th ố ố ng ng v v à à ph ph á á t tri t tri ể ể n qu n qu á á tr tr ì ì nh lên men, c nh lên men, c ù ù ng v ng v ớ ớ i vi i vi ệ ệ c c s s ử ử d d ụ ụ ng thêm công ngh ng thêm công ngh ệ ệ DNA t DNA t á á i t i t ổ ổ h h ợ ợ p. p. 4 4 Nuôi c Nuôi c ấ ấ y c y c á á c vi sinh v c vi sinh v ậ ậ t trên quy mô l t trên quy mô l ớ ớ n l n l à à phương ph phương ph á á p kinh t p kinh t ế ế nh nh ấ ấ t t do c do c ó ó c c á á c ưu đi c ưu đi ể ể m sau: m sau: - - C C á á c k c k ỹ ỹ thu thu ậ ậ t t t t á á i t i t ổ ổ h h ợ ợ p DNA c p DNA c ũ ũ ng m ng m ở ở ra c ra c á á c c cơ h cơ h ộ ộ i cho vi i cho vi ệ ệ c s c s ả ả n xu n xu ấ ấ t sinh kh t sinh kh ố ố i enzyme t i enzyme t ừ ừ vi vi ệ ệ c nuôi c c nuôi c ấ ấ y nh y nh ữ ữ ng lo ng lo à à i vi sinh v i vi sinh v ậ ậ t đòi h t đòi h ỏ ỏ i i đi đi ề ề u ki u ki ệ ệ n sinh trư n sinh trư ở ở ng kh ng kh ắ ắ c khe như c khe như : m : m ôi trư ôi trư ờ ờ ng ng dinh dư dinh dư ỡ ỡ ng đ ng đ ắ ắ t ti t ti ề ề n ho n ho ặ ặ c ph c ph ả ả i b i b ổ ổ sung c sung c á á c nhân c nhân t t ố ố c c ả ả m m ứ ứ ng (inducers) ng (inducers) 5 5 Nuôi c Nuôi c ấ ấ y c y c á á c vi sinh v c vi sinh v ậ ậ t trên quy mô l t trên quy mô l ớ ớ n l n l à à phương ph phương ph á á p kinh t p kinh t ế ế nh nh ấ ấ t t do c do c ó ó c c á á c ưu đi c ưu đi ể ể m sau: m sau: - - C C á á c enzyme c c enzyme c ủ ủ a c a c á á c d c d ạ ạ ng vi sinh v ng vi sinh v ậ ậ t s t s ố ố ng ng ở ở đi đi ề ề u ki u ki ệ ệ n kh n kh ắ ắ c nghi c nghi ệ ệ t ( t ( sinh trư sinh trư ở ở ng ng ở ở c c á á c đi c đi ề ề u u ki ki ệ ệ n c n c ự ự c đoan c c đoan c ủ ủ a nhi a nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ , mu , mu ố ố i, i, á á p l p l ự ự c th c th ẩ ẩ m m th th ấ ấ u u , , ki ki ề ề m) nh m) nh ờ ờ k k ỹ ỹ thu thu ậ ậ t t t t á á i t i t ổ ổ h h ợ ợ p DNA nay c p DNA nay c ó ó th th ể ể sinh trư sinh trư ở ở ng thu ng thu ậ ậ n l n l ợ ợ i trong c i trong c á á c nuôi c c nuôi c ấ ấ y y mesophilic mesophilic ( ( ưa nhi ưa nhi ệ ệ t trung b t trung b ì ì nh 20 nh 20 - - 40 40 o o C), v C), v à à c c ó ó th th ể ể s s ả ả n xu n xu ấ ấ t c t c á á c enzyme v c enzyme v ớ ớ i c i c á á c đ c đ ặ ặ c đi c đi ể ể m ch m ch ị ị u u nhi nhi ệ ệ t ho t ho ặ ặ c ch c ch ị ị u mu u mu ố ố i i ở ở n n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ cao. cao. 6 6 Lên men E. coli t Lên men E. coli t á á i t i t ổ ổ h h ợ ợ p p C C á á c enzyme c c enzyme c ó ó ngu ngu ồ ồ n g n g ố ố c t c t ừ ừ c c á á c sinh v c sinh v ậ ậ t t prokaryote c prokaryote c ó ó th th ể ể đư đư ợ ợ c s c s ả ả n xu n xu ấ ấ t d t d ễ ễ d d à à ng trên ng trên quy mô l quy mô l ớ ớ n v n v ớ ớ i hi i hi ệ ệ u su u su ấ ấ t cao trong c t cao trong c á á c v c v ậ ậ t ch t ch ủ ủ E. coli E. coli t t á á i t i t ổ ổ h h ợ ợ p. C p. C á á c qu c qu á á tr tr ì ì nh lên men n nh lên men n à à y c y c ó ó th th ể ể đư đư ợ ợ c ti c ti ế ế n h n h à à nh nh ở ở quy mô t quy mô t ừ ừ 3.000 3.000 - - 6.000 L, 6.000 L, v v à à không đòi h không đòi h ỏ ỏ i c i c á á c bư c bư ớ ớ c c c c ấ ấ y gây (inoculum y gây (inoculum cuture) ph cuture) ph ứ ứ c t c t ạ ạ p. M p. M ộ ộ t c t c ấ ấ u tr u tr ú ú c v c v ậ ậ t ch t ch ủ ủ th th í í ch ch h h ợ ợ p cho qu p cho qu á á tr tr ì ì nh lên men đ nh lên men đ ặ ặ c trưng c c trưng c ó ó th th ể ể như như sau: sau: 7 7 Lên men E. coli t Lên men E. coli t á á i t i t ổ ổ h h ợ ợ p p V V ậ ậ t ch t ch ủ ủ E. coli E. coli mang (1) plasmid vector c mang (1) plasmid vector c ó ó gen gen mã h mã h ó ó a cho enzyme c a cho enzyme c ầ ầ n thi n thi ế ế t, (2) c t, (2) c ù ù ng v ng v ớ ớ i i gen ch gen ch ỉ ỉ th th ị ị kh kh á á ng kh ng kh á á ng sinh th ng sinh th í í ch h ch h ợ ợ p p như ampicillin ho như ampicillin ho ặ ặ c neomycin, v c neomycin, v à à (3) m (3) m ộ ộ t nhân t nhân t t ố ố c c ả ả m m ứ ứ ng như l ng như l à à TAC (b TAC (b ộ ộ ba đ ba đ ặ ặ c trưng c c trưng c ả ả m m ứ ứ ng lactose ho ng lactose ho ặ ặ c isopropylthiogalactose). c isopropylthiogalactose). 8 8 Lên men E. coli t Lên men E. coli t á á i t i t ổ ổ h h ợ ợ p p Hi Hi ệ ệ u qu u qu ả ả s s ả ả n xu n xu ấ ấ t cao như mong mu t cao như mong mu ố ố n c n c ó ó th th ể ể đ đ ạ ạ t t đư đư ợ ợ c b c b ằ ằ ng c ng c á á ch lên men m ch lên men m ẻ ẻ c c ó ó cung c cung c ấ ấ p dinh dư p dinh dư ỡ ỡ ng, ng, trong đ trong đ ó ó môi trư môi trư ờ ờ ng nuôi c ng nuôi c ấ ấ y m y m ẻ ẻ ch ch ứ ứ a c a c á á c th c th à à nh ph nh ph ầ ầ n n cho s cho s ự ự sinh trư sinh trư ở ở ng ban đ ng ban đ ầ ầ u c u c ủ ủ a vi khu a vi khu ẩ ẩ n, v n, v í í d d ụ ụ : : glucose 2%, d glucose 2%, d ị ị ch chi ch chi ế ế t n t n ấ ấ m men (yeast extract) 1%, m men (yeast extract) 1%, phosphate 1% v phosphate 1% v à à c c á á c lo c lo ạ ạ i mu i mu ố ố i kh i kh á á c c c c ù ù ng v ng v ớ ớ i kh i kh á á ng ng sinh đư sinh đư ợ ợ c ch c ch ọ ọ n. Sau khi s n. Sau khi s ự ự sinh trư sinh trư ở ở ng ban đ ng ban đ ầ ầ u đư u đư ợ ợ c c thi thi ế ế t l t l ậ ậ p, c p, c á á c ch c ch ấ ấ t dinh dư t dinh dư ỡ ỡ ng b ng b ổ ổ sung đư sung đư ợ ợ c cung c c cung c ấ ấ p p ở ở c c á á c t c t ỷ ỷ l l ệ ệ th th í í ch h ch h ợ ợ p đ p đ ả ả m b m b ả ả o đ o đ ủ ủ ngu ngu ồ ồ n carbon v n carbon v à à nitrogen. nitrogen. 9 9 Lên men E. coli t Lên men E. coli t á á i t i t ổ ổ h h ợ ợ p p   Ngu Ngu ồ ồ n carbon thu n carbon thu ậ ậ n l n l ợ ợ i l i l à à glucose, v glucose, v à à nitrogen c nitrogen c ó ó th th ể ể l l à à m m ộ ộ t ph t ph ứ ứ c h c h ợ ợ p t p t ự ự nhiên (ch nhiên (ch ẳ ẳ ng h ng h ạ ạ n như d n như d ị ị ch chi ch chi ế ế t t n n ấ ấ m men, d m men, d ị ị ch th ch th ủ ủ y phân casein), sirô ngô (corn y phân casein), sirô ngô (corn sirup), m sirup), m ộ ộ t lo t lo ạ ạ i mu i mu ố ố i ammonium đơn ho i ammonium đơn ho ặ ặ c urea. c urea.   Nuôi c Nuôi c ấ ấ y y E. coli E. coli trong môi trư trong môi trư ờ ờ ng c ng c ó ó b b ổ ổ sung c sung c á á c h c h ỗ ỗ n n h h ợ ợ p amino acid cho kh p amino acid cho kh ả ả năng sinh trư năng sinh trư ở ở ng v ng v à à s s ả ả n xu n xu ấ ấ t t protein nhanh hơn protein nhanh hơn , tuy nhiên vi , tuy nhiên vi ệ ệ c s c s ử ử d d ụ ụ ng c ng c á á c ngu c ngu ồ ồ n n dinh dư dinh dư ỡ ỡ ng đơn gi ng đơn gi ả ả n hơn n hơn (ch (ch ẳ ẳ ng h ng h ạ ạ n ngu n ngu ồ ồ n nitrogen), n nitrogen), m m ặ ặ c d c d ù ù c c ó ó th th ể ể đòi h đòi h ỏ ỏ i th i th ờ ờ i gian lên men lâu hơn i gian lên men lâu hơn , v , v ẫ ẫ n n c c ó ó th th ể ể t t ạ ạ o ra s o ra s ự ự sinh trư sinh trư ở ở ng c ng c ủ ủ a t a t ế ế b b à à o v o v à à hi hi ệ ệ u su u su ấ ấ t t protein cao tương t protein cao tương t ự ự . . 10 10 Lên men E. coli t Lên men E. coli t á á i t i t ổ ổ h h ợ ợ p p S S ả ả n xu n xu ấ ấ t enzyme đư t enzyme đư ợ ợ c c c c ả ả m m ứ ứ ng thu ng thu ậ ậ n l n l ợ ợ i b i b ằ ằ ng ng c c á á ch b ch b ổ ổ sung isopropylthiogalactoside t sung isopropylthiogalactoside t ừ ừ 30 30 - - 300 300 mg/L, ho mg/L, ho ặ ặ c lactose t c lactose t ừ ừ 1 1 - - 10 g/L. Vi 10 g/L. Vi ệ ệ c quy c quy ế ế t đ t đ ị ị nh th nh th ờ ờ i i gian v gian v à à t t ầ ầ n s n s ố ố b b ổ ổ sung ch sung ch ấ ấ t c t c ả ả m m ứ ứ ng l ng l à à r r ấ ấ t quan tr t quan tr ọ ọ ng ng đ đ ể ể thu đư thu đư ợ ợ c hi c hi ệ ệ u su u su ấ ấ t enzyme c t enzyme c ự ự c đ c đ ạ ạ i. i. M M ậ ậ t đ t đ ộ ộ t t ố ố i ưu trên i ưu trên 200 c 200 c ủ ủ a OD a OD 600nm 600nm (50 g kh (50 g kh ố ố i lư i lư ợ ợ ng ng khô c khô c ủ ủ a t a t ế ế b b à à o/L) v o/L) v à à s s ự ự bi bi ể ể u hi u hi ệ ệ n protein kho n protein kho ả ả ng 10 ng 10 g/L (30% c g/L (30% c ủ ủ a protein t a protein t ổ ổ ng s ng s ố ố ) l ) l à à m m ộ ộ t k t k ế ế t qu t qu ả ả lên men lên men mong mu mong mu ố ố n. Qu n. Qu á á tr tr ì ì nh lên men thư nh lên men thư ờ ờ ng th ng th ự ự c hi c hi ệ ệ n trong n trong hai ng hai ng à à y y ở ở nhi nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ th th ấ ấ p hơn nhi p hơn nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ sinh trư sinh trư ở ở ng t ng t ố ố i i ưu c ưu c ủ ủ a cơ th a cơ th ể ể , ngh , ngh ĩ ĩ a l a l à à t t ừ ừ 24 24 - - 28 28 o o C. C. [...]... có thể được sản xuất nhờ lên men vi sinh vật là hoàn toàn an toàn 15 Các enzyme vi sinh vật thay thế các enzyme động-thực vật Một cách khác, bằng phương thức tách chiết enzyme truyền thống từ các nguồn vi sinh vật và việc sử dụng kỹ thuật sàng lọc thích hợp, nhiều enzyme mới giống như enzyme động-thực vật hiện nay đã được sản xuất 16 Các enzyme vi sinh vật thay thế các enzyme động-thực vật Enzyme protease... môi trường đã được xác định đầy đủ có bổ sung xen kẽ thêm một vài chất dinh dưỡng khác Lên men đặc trưng kéo dài từ 4-8 ngày Sự biểu hiện protein vượt quá 10 g/L đã thu được ở quy mô công nghiệp 14 Các enzyme vi sinh vật thay thế các enzyme động-thực vật Một số enzyme công nghiệp vẫn được tách chiết từ các nguồn động vật như bò tiềm ẩn nguy cơ của sự nhiễm bẩn bệnh não dạng xốp của bò (bovine spongiorm... thế các enzyme dùng trong thuộc da - Rất nhiều loại amylase vi sinh vật được phát triển để thay thế hoặc bổ sung cho các amylase thực vật trong tạo malt của lúa mạch hoặc lúa mỳ 17 Các enzyme vi sinh vật thay thế các enzyme động-thực vật Hơn nữa, một số enzyme có nguồn gốc động vật (như hoạt tố plasminogen của mô) cũng được sản xuất trong các vi sinh vật tái tổ hợp và có thể cung cấp chuỗi protein. .. xoắn Các enzyme glycosyl hóa của động vật có vú có thể được biểu hiện trong các cơ thể eukaryote như Saccharomyces và Aspergillus Ở đây, vật chủ sẽ glycosyl hóa enzyme để cung cấp hoạt tính đầy đủ cho dù các đường glycosyl hóa ở đây có thể khác ở động vật có vú 18 Các enzyme vi sinh vật thay thế các enzyme động-thực vật Hơn nữa, một số enzyme có nguồn gốc động vật (như hoạt tố plasminogen của mô) cũng...Lên men nấm Các loài nấm vật chủ như Aspergillus và Fusarium, và nấm men hướng methyl (Pichia) thích hợp cho sản xuất các protein glycosyl hóa từ các nguồn động vật hoặc nấm DNA của protein được hợp nhất trực tiếp trong DNA nhiễm sắc thể cùng với hệ thống promoter điều hòa biểu hiện gen 11 Lên men nấm Các vật chủ tái tổ hợp có thể được lên men trong một kiểu tương tự như các nuôi cấy không tái tổ... số enzyme có nguồn gốc động vật (như hoạt tố plasminogen của mô) cũng được sản xuất trong các vi sinh vật tái tổ hợp và có thể cung cấp chuỗi protein được tái cuộn xoắn Các enzyme glycosyl hóa của động vật có vú có thể được biểu hiện trong các cơ thể eukaryote như Saccharomyces và Aspergillus Ở đây, vật chủ sẽ glycosyl hóa enzyme để cung cấp hoạt tính đầy đủ cho dù các đường glycosyl hóa ở đây có thể... Aspergillus hoặc Fusarium có thể được sinh trưởng trên các nguyên liệu thô rẻ tiền như bột đậu tương có bổ sung thêm chất dinh dưỡng là sirô ngô Nấm men, như Saccharomyces và Pichia, có thể sinh trưởng trên dịch chiết nấm men hoặc các dịch thủy phân protein và sirô ngô 13 Lên men nấm Quá trình nuôi cấy có thể cho sinh khối tế bào cao bằng cách sử dụng các môi trường đã được xác định đầy đủ có bổ sung xen . 1 1 S S ả ả n xu n xu ấ ấ t protein t protein trên quy mô l trên quy mô l ớ ớ n n 2 2 Nuôi c Nuôi c ấ ấ y c y c á á c vi sinh v c vi sinh v ậ ậ t trên quy mô l t trên quy mô l ớ ớ n l n l à à . hi ệ ệ n protein vư n protein vư ợ ợ t t qu qu á á 10 10 g/L g/L đã thu đư đã thu đư ợ ợ c c ở ở quy mô công nghi quy mô công nghi ệ ệ p p 15 15 C C á á c enzyme vi sinh v c enzyme. s s ử ử d d ụ ụ ng thêm công ngh ng thêm công ngh ệ ệ DNA t DNA t á á i t i t ổ ổ h h ợ ợ p. p. 4 4 Nuôi c Nuôi c ấ ấ y c y c á á c vi sinh v c vi sinh v ậ ậ t trên quy mô l t trên quy mô l ớ ớ n l n