Đang tải... (xem toàn văn)
thu nhận enzyme papain từ đu đủ tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả các lĩnh...
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ THU NHẬN ENZYM PAPAIN THU NHẬN ENZYM PAPAIN TỪ ĐU ĐỦ TỪ ĐU ĐỦ Nhóm HTV: Nhóm HTV: Phan Huy Huy Phan Huy Huy Phạm Quốc Trung Phạm Quốc Trung Lư Quốc Việt Lư Quốc Việt Nhóm: HTV 1 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ I. I. TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN [2]: TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN [2]: Hình Hình I.1: Nguồn nguyên liệu thu nhựa I.1: Nguồn nguyên liệu thu nhựa Hình I.2: Hoa đu đủ Hình I.2: Hoa đu đủ để sản xuất papain để sản xuất papain I.1 Đặc điểm chung: I.1 Đặc điểm chung: Enzym papain được tách ra từ nhựa trái đu đủ xanh, thuộc nhóm enzym thuỷ phân Enzym papain được tách ra từ nhựa trái đu đủ xanh, thuộc nhóm enzym thuỷ phân có nguốn gốc thực vật được ngun cứu nhiều nhất về tính chất và cơ chế hoạt động. có nguốn gốc thực vật được ngun cứu nhiều nhất về tính chất và cơ chế hoạt động. Papain là một sulfhydryl protease, lần đầu tiên được tách ra bởi Bals và cộng sự của ơng, Papain là một sulfhydryl protease, lần đầu tiên được tách ra bởi Bals và cộng sự của ơng, sau đó bởi Kimmel và Smith từ nhựa khơ sau đó bởi Kimmel và Smith từ nhựa khơ Theo danh pháp quốc tế, papain mang mã số 3.4.22.2, có hoạt tính xúc tác tương tự Theo danh pháp quốc tế, papain mang mã số 3.4.22.2, có hoạt tính xúc tác tương tự như bromelin (trong dứa) và ficin (trong cây sung). như bromelin (trong dứa) và ficin (trong cây sung). G.C.Roy là người đầu tiên phát hiện ra nhựa cây đu đủ là một nguồn enzym. Ơng G.C.Roy là người đầu tiên phát hiện ra nhựa cây đu đủ là một nguồn enzym. Ơng cơng bố báo cáo của mình trong tạp chí “Calaitta Medical Journal’’. Đến năm 1879, Wrutz cơng bố báo cáo của mình trong tạp chí “Calaitta Medical Journal’’. Đến năm 1879, Wrutz và Bouchet là những người đầu tiên sử dụng thuật ngữ “papain” để diễn tả tính chất phân và Bouchet là những người đầu tiên sử dụng thuật ngữ “papain” để diễn tả tính chất phân huỷ protein của enzym trong nhựa đu đủ. Ngày nay, thuật ngữ “papain” tiếp tục được sử huỷ protein của enzym trong nhựa đu đủ. Ngày nay, thuật ngữ “papain” tiếp tục được sử dụng để miêu tả mủ đu đủ khơ được dùng rộng rãi trong cơng nghiệp và cả trong chế phẩm dụng để miêu tả mủ đu đủ khơ được dùng rộng rãi trong cơng nghiệp và cả trong chế phẩm enzym thuỷ phân dạng kết tinh từ mủ. enzym thuỷ phân dạng kết tinh từ mủ. Nhóm: HTV 2 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trãi rộng khắp tồn bộ cây, ngoại trừ rễ. Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trãi rộng khắp tồn bộ cây, ngoại trừ rễ. Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất. Nhựa là hỗn hợp enzyme chứa Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất. Nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc aa cuối là glutamic acid), chymopapain B các protease sau: papain, chymopapain A (gốc aa cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc aa cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease. Các tính chất vật lý (gốc aa cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease. Các tính chất vật lý của papain gần giống với chymopapain nhưng papain có hoạt tính mạnh hơn gấp nhiều lần của papain gần giống với chymopapain nhưng papain có hoạt tính mạnh hơn gấp nhiều lần chymopapain. chymopapain. I.2 Tính chất vật lý: I.2 Tính chất vật lý: Bảng I.2.1: Tinh chất vật lý của papain: Bảng I.2.1: Tinh chất vật lý của papain: Tính chất vật lý Giá trò Điểm đẳng điện Điểm đẳng điện pI = 8,75 pI = 8,75 Hằng số lắng S Hằng số lắng S 20 20 2,42 ± 0,04 2,42 ± 0,04 Hằng số phân tán D Hằng số phân tán D 20 20 (10 (10 -7 -7 giây.cm giây.cm 2 2 ) ) 10,27 ± 0,13 10,27 ± 0,13 Phân tử lượng Phân tử lượng 20700 20700 Độ triền quang [ Độ triền quang [ α α ]D ]D -66,7 -66,7 o o Độ xoắn Độ xoắn 17% 17% Vòng hiệu ứng coton Vòng hiệu ứng coton 290nm 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) Thể tích riêng phần V(mL/g) 0,724 0,724 Trò số ma sát f/f Trò số ma sát f/f o o 1,16 1,16 Bột màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu Bột màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong nước hay glycerine. cơ nhưng tan một phần trong nước hay glycerine. Bền nhiệt. Bền nhiệt. I.3 Tính chất hóa học I.3 Tính chất hóa học : : Cấu tạo hóa học Cấu tạo hóa học : : - - Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S. Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S. - - Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212 Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212 amino acid không chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, amino acid không chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vò trí 22-63, 56-95, 153-200 có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vò trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vò trí cysteine 25. một nhóm –SH tự do ở vò trí cysteine 25. - - Papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine. Papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine. Nhóm: HTV 3 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ Cấu trúc không gian: Cấu trúc không gian: Phân tử papain có dạng cầu, mạch chính bò gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Phân tử papain có dạng cầu, mạch chính bò gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt khe này, nhóm –SH của cysteine 25 ở bên trái khe và Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt khe này, nhóm –SH của cysteine 25 ở bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn α α chiếm 20% toàn bộ các amino acid có chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử. trong phân tử. Phân tử papain có hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain và cả hai Phân tử papain có hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain và cả hai nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn α α . Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội . Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội phân tử. phân tử. Cấu trúc tâm hoạt động của papain: Cấu trúc tâm hoạt động của papain: Tâm hoạt động của papain gồm nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của Tâm hoạt động của papain gồm nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys. Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys. Hình I.3.1: Tâm hoạt động của papain Hình I.3.1: Tâm hoạt động của papain Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng: Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng: Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase. như endopeptidase vừa như exopeptidase. Các endopeptidase thuỷ phân protein chủ yếu thành peptid: Các endopeptidase thuỷ phân protein chủ yếu thành peptid: Nhóm: HTV 4 (-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-) (-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-) n n + HOH (-NH-CH(R)-COOH) + HOH (-NH-CH(R)-COOH) i i + (H + (H 2 2 N-CH(R)-CO-) N-CH(R)-CO-) k k i + k = n i + k = n Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự do. Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ do. Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X- ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X- Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vò trí giữaY và Z, nhưng nếu Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vò trí giữaY và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vò trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì không được thủy peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vò trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain. phân bởi papain. Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase. Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase. Hoạt hoá papain: Hoạt hoá papain: Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có động. Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, hydrocyanic… Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. Khi có mặt các tính khử như cysteine, hydrocyanic… Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ. kim loại nặng có trong nhựa đu đủ. Bất hoạt: Bất hoạt: Papain bò kìm hãm (ức chế bất thuận nghòch) bởi các chất oxi hoá như: O Papain bò kìm hãm (ức chế bất thuận nghòch) bởi các chất oxi hoá như: O 2 2 , O , O 3 3 , H , H 2 2 O O 2 2 , , iodur acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở iodur acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. Papain bò bất hoạt thuận nghòch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. Papain tác Papain bò bất hoạt thuận nghòch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. Papain tác dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên papain dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ (độ quay cực của papain hầu như lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ (độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M). không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M). Nhóm: HTV 5 (H (H 2 2 N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-) N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-) n n + HOH (H + HOH (H 2 2 N-CH(R)-COOH) N-CH(R)-COOH) n’ n’ + (H + (H 2 2 N-CH(R)-CO-) N-CH(R)-CO-) k’ k’ n’ + k’ = n n’ + k’ = n Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain: • • Nhiệt độ: Nhiệt độ: Papain là enzym chòu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bò Papain là enzym chòu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bò biến tính trong 3 giờ ở 100 biến tính trong 3 giờ ở 100 o o C. Ở dạng dung dòch, papain bò mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5 C. Ở dạng dung dòch, papain bò mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5 o o C C và nếu tăng nhiệt độ trên 100 và nếu tăng nhiệt độ trên 100 o o C thì sẽ mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất C thì sẽ mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dòch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bò phá hủy hoàn toàn. hoạt hóa vào dung dòch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bò phá hủy hoàn toàn. Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó. Papain trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó. Papain trong dung dòch NaCl giữ ở 4 trong dung dòch NaCl giữ ở 4 o o C bền trong nhiều tháng. Trong dung dòch dẫn xuất thủy ngân, C bền trong nhiều tháng. Trong dung dòch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá. Papain dạng ổn đònh (có cấu trúc không gian ổn đònh) ở 1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá. Papain dạng ổn đònh (có cấu trúc không gian ổn đònh) ở trạng thái khô có thể chòu được nhiệt độ sấy ở 115 trạng thái khô có thể chòu được nhiệt độ sấy ở 115 o o C trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được C trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%. 90%. • • pH: pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lại dễ biến tính Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12. Tuỳ thuộc trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12. Tuỳ thuộc bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain khác nhau. Papain dạng ổn đònh có thể chòu bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain khác nhau. Papain dạng ổn đònh có thể chòu được pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút. được pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút. • • Dung môi: Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, không bò giảm hoạt tính Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, không bò giảm hoạt tính trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dòch TCA trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dòch TCA 10% papain bò biến đổi bất thuận nghòch. 10% papain bò biến đổi bất thuận nghòch. Nhóm: HTV 6 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ II. II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN [2], [4], [7]: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN [2], [4], [7]: Quy trình công nghệ: Quy trình công nghệ: Nguyên liệu Nghiền Trích ly bã cát sạch celite Lọc Chỉnh pH Lọc Kết tủa bã tủa xám NaOH (NH 4 ) 2 SO 4 phân đoạn 1 Ly tâm 1 Ly tâm 2 Kết tinh dòch lỏng dòch lỏng NaCL rắn Kết tủa phân đoạn 2 Papain Tái kết tinh Sấy chân không dd NaCl bão hòa Nhóm: HTV 7 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ 1. 1. Thu nhận nhựa đu đủ: Thu nhận nhựa đu đủ: Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease, trong đó papain chiếm tới 95%. IV, thiolprotease, trong đó papain chiếm tới 95%. Điều kiện lấy nhựa: Điều kiện lấy nhựa: - - Cây đang sinh trưởng tốt, không bò sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa Cây đang sinh trưởng tốt, không bò sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa nhiều. nhiều. - - Quả: lấy ở những quả còn xanh, vỏ mòn, từ 0,3 – 1kg, độ 10 tuần tuổi là tốt Quả: lấy ở những quả còn xanh, vỏ mòn, từ 0,3 – 1kg, độ 10 tuần tuổi là tốt nhất. nhất. - - Thời gian lấy nhựa: sáng sớm. Thời gian lấy nhựa: sáng sớm. Hình II.1.1: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa. Hình II.1.1: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa. Cách tiến hành: Cách tiến hành: - - Lấy nhựa ở quả xanh còn ở trên cây, dùng dao inox đầu nhọn rạch vài đường Lấy nhựa ở quả xanh còn ở trên cây, dùng dao inox đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu quá 2cm để dòch nước và tinh bột từ quả không bò trộn lẫn vào (không rạch sâu quá 2cm để dòch nước và tinh bột từ quả không bò trộn lẫn vào nhựa làm giảm chất lượng nhựa). nhựa làm giảm chất lượng nhựa). - - Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, lấy Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, lấy nhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ nhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ các công đoạn xử lý tiếp theo. Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho các công đoạn xử lý tiếp theo. Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa. Khi nhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa. Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào. lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào. Nhóm: HTV 8 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ Hình II.1.2: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ Hình II.1.2: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ • • Lưu ý: Lưu ý: - - Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì sẽ làm giảm chất lượng nhựa. Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì sẽ làm giảm chất lượng nhựa. - - Quả có thể được rút nhựa trong suốt 4 - 7 ngày, lần đầu có thể chỉ cần một rạch Quả có thể được rút nhựa trong suốt 4 - 7 ngày, lần đầu có thể chỉ cần một rạch là đủ, những lần thu nhựa sau rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạch trước đó. là đủ, những lần thu nhựa sau rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạch trước đó. - - Cần tránh không cho nhựa tươi tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng, không nên Cần tránh không cho nhựa tươi tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng, không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng… vì sẽ để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng… vì sẽ làm biến màu và giảm hoạt tính enzym. Lọ, dao, muỗng… phải được làm bằng làm biến màu và giảm hoạt tính enzym. Lọ, dao, muỗng… phải được làm bằng nhựa hoặc thép không rỉ. nhựa hoặc thép không rỉ. - - Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% ẩm. Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% ẩm. 2. 2. Thu nhận papain : Thu nhận papain : 2.1. 2.1. Chuẩn bò: Chuẩn bò: Do trong nhựa đu đủ tươi ngoài papain, chymopapain còn có một số loại enzym, Do trong nhựa đu đủ tươi ngoài papain, chymopapain còn có một số loại enzym, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác nên để có được quy trình tách protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác nên để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ các tạp chất trên. Cách làm như sau: loại bỏ các tạp chất trên. Cách làm như sau: - - Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kó trong cối ở Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kó trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dòch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dòch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein Nhóm: HTV 9 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ hydrochloride trong 1000mL dung dòch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa hydrochloride trong 1000mL dung dòch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa pH dòch chiết tới 5,7). pH dòch chiết tới 5,7). - - Khi dòch nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền Khi dòch nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300mL dung dòch cysteine. Rửa cối với dung dòch cysteine và trích được lặp lại với 300mL dung dòch cysteine. Rửa cối với dung dòch cysteine để điều chỉnh thể tích dòch chiết lên 1l. để điều chỉnh thể tích dòch chiết lên 1l. - - Dòch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số Dòch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1, thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 1, thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5,7. 5,7. - - Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzym được tiến hành trong điều kiện Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzym được tiến hành trong điều kiện lạnh. lạnh. 2.2. 2.2. Loại bỏ các chất không tan ở pH 9: Loại bỏ các chất không tan ở pH 9: Thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110mL dung dòch NaOH 1M để điều Thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110mL dung dòch NaOH 1M để điều chỉnh pH của dòch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1 chỉnh pH của dòch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dòch trích trong. giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dòch trích trong. 2.3. 2.3. Quá trình phân đoạn bằng (NH Quá trình phân đoạn bằng (NH 4 4 ) ) 2 2 SO SO 4 4 : : Cho (NH4) Cho (NH4) 2 2 SO4 vào dòch enzym đến 40% độ bão hòa, sau 1 - 2 giờ, ly tâm ở 2500 SO4 vào dòch enzym đến 40% độ bão hòa, sau 1 - 2 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút. Thu nhận tủa, bỏ dòch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa vòng/phút. Thu nhận tủa, bỏ dòch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa lại một lần nữa với 400 - 500mL dung dòch (NH lại một lần nữa với 400 - 500mL dung dòch (NH 4 4 ) ) 2 2 SO SO 4 4 40% độ bão hòa. 40% độ bão hòa. 2.4. 2.4. Quá trình phân đoạn bằng NaCl: Quá trình phân đoạn bằng NaCl: Hòa tan tủa trong 600mL dung dòch cysteine 0,02M, dung dòch thu được có pH 7-7,5, Hòa tan tủa trong 600mL dung dòch cysteine 0,02M, dung dòch thu được có pH 7-7,5, sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dòch lỏng. bỏ dòch lỏng. 2.5. 2.5. Kết tinh: Kết tinh: Hoà tan tủa với 400mL dung dòch cysteine 0,002M ở nhiệt độ phòng thu được một Hoà tan tủa với 400mL dung dòch cysteine 0,002M ở nhiệt độ phòng thu được một dung dòch huyền phù có pH = 6,5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, dung dòch huyền phù có pH = 6,5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, duy trì ở 4 duy trì ở 4 o o C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể. thể. Nhóm: HTV 10 [...]... hợp, chất màu, mùi và chất bảo quản Nhóm: HTV 14 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ Hình III.8: Chế phẩm hỗn hợp enzym bromelin , papain và một số chất khác Hình III.9 Chế phẩm super enzym bromelain - papain Nhóm: HTV 15 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lê Ngọc Tú, “Hóa sinh công nghiệp”, NXB Khoa học và Kó thu t, 2002 [2] Nguyễn Đức Lượng, “Công nghệ enzym”,... http://www.lef.org [9] http://www.lichtwer.co.uk [10] http://www .papain. cn/ [11] http://www.tintucvietnam.com [12] http://www.vitadegest Mục lục: I.TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN I.1 Đặc điểm chung I.2 Tính chất vật ly ù I.3 Tính chất hoá học II PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN II.1 Thu nhận nhựa đu đủ II.2 Thu nhận papain III ỨNG DỤNG Nhóm: HTV tr 2 tr2... khát khác Hình III.1: Một loại mặt nạ dưỡng da có chứa enzym papain và những dưỡng chất của đu đủ [8] Nhóm: HTV 12 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ • Trong y học: Chữa bệnh giun kim, giun đũa Là thành phần chính của các loại thu c trò bệnh biếng ăn, ăn không tiêu Dùng tiêu huỷ các dò vật thừa, các protein chết trong cơ thể Hỗn hợp papain- bromelincelluloza được sử dụng hiệu quả để phá sỏi... nghệ sản xuất dầu cá, nếu cho papain tác dụng trước lên gan thì việc tách dầu sẽ dễ dàng hơn và chất lượng dầu cũng tăng lên Papain có thể sử dụng kết hợp với một số chất khác để điều chế ra mỹ phẩm chăm sóc da, giúp làm da mềm mại, tẩy các tế bào chết trên da Hình III.2: Xà bông có chứa enzyme papain Nhóm: HTV 13 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ Một vài chế phẩm papain thương mại [7], [9],...Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ 2.6 Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất ở nhiệt độ phòng tạo dung dòch có nồng độ protein khoảng 1% Sau đó cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dòch NaCl bão hòa (10mL/300mL dung dòch protein) Khi 75% thể tích dung dòch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng Dòch huyền... phẩm có tính chất tốt hơn Nhóm: HTV 11 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ Trong quy trình sản xuất bột cá cổ điển, người ta lợi dụng hệ enzym VSV thu phân protease có sẵn trong trong cá để phân giải các protein trong thời gian dài và ở nhiệt độ thích hợp Ngày nay, việc bổ sung chế phẩm enzym, đặc biệt là papain không những rúùt ngắn thời gian thu phân mà còn ngăn ngừa được các vi khuẩn gây... Staphylococus rất nhạy cảm với papain Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin: 18mg papain trong dung dòch trung tính được 10mg rixin là chất độc có trong hạt thầu dầu, 2mg papain trung tính được 4 liều độc của toxin uốn ván Dung dòch papain cysteine salicilate c ó công dụng chữa bỏng • Trong các ngành công nghệ khác : Papain làm mềm da trong công nghệ thu c da Len đã qua xử lý papain sẽ tăng độ... giờ để thu nhận tinh thể Hoạt độ riêng của enzym có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên Để tăng hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong dung dòch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A o và đem kết tinh dòch lỏng thu được sau siêu lọc 2.7 Sấy chân không: Sấy chân không ở nhiệt độ 40oC thu nhận papain. .. vài chế phẩm papain thương mại [7], [9], [10], [12]: Hình III.3: nhựa đu đủ, hoạt tính 50000u/g Hình III.4: Chế phẩm papain lỏng, hoạt tính 80000u/g Hình III.5: Chế phẩm enzym thô, hoạt tính 800000u/g Hình III.6: Chế phẩm papain tinh khiết, Hoạt tính 2000000 – 2300000u/g Hình III.7: Bột enzym papain, trong đó thành phần chứa 362,5mg papain và không chứa nấm men, bột mì, đậu nành, bắp, đường, chất tạo... thu được sau siêu lọc 2.7 Sấy chân không: Sấy chân không ở nhiệt độ 40oC thu nhận papain tinh chế Hình II.2.1: Trái và nhựa Đu đủ ỨNG DỤNG III Papain là loại protease được ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác nhau • Trong công nghệ thực phẩm: Protease, trong đó có papain được sử dụng rất rộng rãi trong chế biến thòt, cá và đã mang lại hiệu quả kinh tế cao Với phương pháp này, người ta . tr3 II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN tr7 II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN tr7 II.1 Thu nhận nhựa đu đủ tr8 II.1 Thu nhận nhựa đu đủ tr8 II.2 Thu nhận papain tr9 II.2 Thu nhận papain tr9 III. ỨNG. papain gần giống với chymopapain nhưng papain có hoạt tính mạnh hơn gấp nhiều lần của papain gần giống với chymopapain nhưng papain có hoạt tính mạnh hơn gấp nhiều lần chymopapain. chymopapain. I.2. chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dòch TCA 10% papain bò biến đổi bất thu n nghòch. 10% papain bò biến đổi bất thu n nghòch. Nhóm: HTV 6 Đề tài: Thu nhận enzym papain từ