Đang tải... (xem toàn văn)
Bài giảng Kỹ thuật thu hồi hoàn thiện sản phẩm: Chương 4.2 - Phương pháp kết tinh được biên soạn nhằm giúp các em sinh viên nắm được mục đích của tinh thể protein; Tính chất tạo tinh thể protein; Các giai đoạn của quá trình tinh thể hóa; Các phương pháp tinh thể hóa. Mời quý thầy cô và các em cùng tham khảo!
4.2 Phương pháp kết tinh Crystallization Methods and Protein Crystal Properties Tinh thể hóa protein Mục đích tạo tinh thể protein Tính chất của tinh thể protein Các giai đoạn của trình tinh thể hóa Các phương pháp tinh thể hóa Khái niệm • Kết tinh ( tinh thể hóa) dạng đặc biệt của trình kết tủa, mà chất rắn không tan thu dạng tinh thể Sự hình thành tinh thể diễn rất chậm • Kết tủa trình phân tách chọn lọc thành phần chất tan hỗn hợp chất tạo thành dạng không tan phương pháp vật lý hóa lý tương ứng Mục đích • xác định cấu trúc protein • hiểu được sự liên kết của protein với các cấu tử/ chất / thuốc • hiểu được chế xúc tác enzym của protein • xác định vị trí đúng của nguyên tử phân tử proteinTinh thể học tia X ( vì 80% cấu trúc phân tử protein là được xác định bằng tia X • Khơng giới hạn về kích thước: tất cả virus và riboxơm đều được phân tích • Tinh thể dùng để khuếch đại tín hiệu (1 tinh thể chứa 109 – 1013 phân tử) Một tinh thể tổ hợp ba chiều của phân tử riêng biệt tự xếp một trật tự nhắc lại của phần tử giống Điều đúng cho phân tử nhỏ phân tử muối và đại phân tử protein Tinh thể học khoa học thực nghiệm xác định sự xếp nguyên tử chất rắn Tính chất tinh thể protein Khác với các phân tử muối (sắp xếp chặt) các phân tử protein có đặc tính: -Lớn (>1000 nguyên tử- so với 2-10 nguyên tử) -Hình dạng không đều -Có bề mặt dị thường Vì vậy các tinh thể protein có diện tích tiếp xúc giữa các phân tử riêng biệt ít - Mềm và dề vỡ -Một loại protein có thể phát triển thành các tinh thể có hình dạng khác nhau, sử dụng các vùng tiếp xúc giữa các phân tử khác - Cần có điều kiện pH, nồng độ muối, nhiệt độ để giữ trạng thái ban đầu -Chứa khoảng 50% nước hình thành các kênh - Khó tạo tinh thể muối nhiều Lịch sử phát triển • Tinh thể protein phycoerythrine-chất màu có chất protein tảo cyanobacteria) mơ tả chi tiêt từ 1894 • Vào năm 1912, -bốn năm sau phát tia X, Lần Max Von Laue P Knipping W Friedrich sử dụng tinh thể để tách tia X Sau phát minh này, P.Ewald W.H Bragg W.L.Bragg khởi đầu ngành tinh thể học X-ray • Perutz Kendrew vào năm cuối 1950 xác định cấu trúc phân tử protein myoglobine • Ngày nay, có 40 000 cấu trúc protein mô tả làm nguồn sở liệu ( bao gồm riboxơm virut) • 1962, Max Perutz đoạt giải Nobel hóa học về công trình nghiên cứu protein X-ray Các giai đoạn trình tinh thể hóa Thu nhận lượng lớn protein tinh khiết Chọn dung dịch đệm protein mà protein có thể tan tốt và bền vững Làm bão hòa dung dịch protein để có thể xảy quá trình tạo nhân tinh thể một cách tự phát Các tinh thể lớn dần Tính tan Tính tan của protein tăng lên bổ sung muối vào dung dịch và sau đó giảm dần nồng độ đạt đến một giá trị làm kết tủa HbCO (carboxyhemoglobin) solubility as a function of ionic strength in the presence of several different types of salts Mầm tinh thể • Hiện tượng mà một nhân, chẳng hạn hạt bụi, một hạt tinh thể nhỏ hay thường là dạng tinh thể protein, một khối kết tụ các hạt protein, và quá trình tinh thể hóa bắt đầu Những khó khăn thường gặp phải Nếu độ bão hòa quá cao, quá nhiều dạng nhân vì vậy, quá thừa các tinh thể nhỏ Trong dung dịch quá bão hòa sẽ không có sự tạo nhân tự phát và sự lớn dần của tinh thể chỉ xảy có mặt của mầm tinh thể 10 Các yếu tố ảnh hưởng 1) Độ tinh khiết của protein 2) Nồng độ Protein 3) Điều kiện ban đầu (chuẩn bị dung dịch protein) 4) Tác nhân gây kết tủa 5) Nhiệt độ 6) pH 7)Các chất bổ sung: Chất tẩy rửa, chất khử, chất, đồng nhân tố 13 14 Các yếu tố ảnh hưởng 1.Độ tinh khiết protein Nồng độ protein Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến • Tính đồng khả tái lập • Thường xác định Bradford Assay (BSA is used as a standard) 15 4) Tác nhân kết tủa Precipitating agent (precipitant) Salts Ammonium sulfate Sodium chloride Potassium phosphate Organic reagents MPD Isopropanol Polyethylene glycol PEG 4000 PEG 6000 PEG 8000 16 LOẠI MUỐI NÀO ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ TINH THỂ HÓA PROTEIN ? 17 DUNG MÔI NÀO ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ TINH THỂ HÓA PROTEIN ? 18 19 5) Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến tính tan protein động học trình mà dung dịch đạt đến trạng thái bão hịa Lý tưởng: • Một tinh thể riêng biệt cần trì nhiệt độ khơng đổi •Dễ kết tinh 4 C nhiệt độ 12 hay 15 C 20 6) pH Điện tích bề mặt ảnh hưởng đến xếp không gian của phân tử tinh thể, đặc biệt liên quan tinh thể với Tương tác kỵ nước ít quan trọng so với tương tác tĩnh điện tạo cấu trúc tinh thể 21 7) Additives: Sometimes you can increase the stability of your protein, and/or the homogeneity of its conformation by having relevant additives present in the crystal screen: • • • • • Detergents Reducing agents Substrates Co-factors etc 22 CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH THỂ HÓA 4.1 Phương pháp khuếch tán 4.2 PP bốc chậm 4.3 PP thẩm tích Vapor Diffusion Slow Evaporation Dialysis 23 Hanging Drop Vapor Diffusion Most popular method among protein crystallographers Crystal screen buffer is the well solution (0.5 - mL) Drop (on siliconized glass cover slip) is 1/2 protein solution, 1/2 crystal screen buffer (6-10 L) So, the concentration of precipitant in the drop is 1/2 the concentration in the well Cover slip is inverted over the top of the well and sealed with vacuum grease (airtight) The precipitant concentration in the drop will equilibrate with the precipitant concentration in the well via vapor diffusion 24 Sitting Drop Vapor Diffusion Same basic principles as in hanging drop method, except the drop containing your sample sits on a bridge within the well This allows for a larger sample size (20 40 L), however protein is frequently precious to the crystallographer, so there isn’t that much demand for a larger sample size 25 Oil Immersion Micro Batch This method is rising rapidly in popularity- typical sample size 1-6 L Figure 1- Paraffin oil allows for little to no diffusion of water through the oil This is a true batch experiment because all the reagents are present at a specific and relatively unchanging concentration Figure 2- Al’s oil is a 1:1 mixture of silicon oil and paraffin oil which allows for evaporation through slow diffusion through the oil This is an evaporation Method, and the concentration of the protein and reagents in the drop does increase over time 26 Microdialysis Dialysis buttons can be purchased for a wide range ofsample sizes (~ - 350 L) In the dialysis experiment, the sample is often introduced to high salt concentrations within the button that are allowed to equilibrate with lower salt concentrations in the buffer over time This is known as a “salting-in” method It exploits the fact that not only does protein solubility tend to decrease with very high ionic strengths, it also has a minimum at very low ionic strength 27