Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008 -BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM ––––––––––––––––––––––––––––––– BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN PHÂN TÍCH HOOCMON CLENBUTEROL TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHỐI PHỔ (GC/MS” Chủ nhiệm Đề tài: PHẠM VĂN THÀNH 7313 23/4/2009 Hà Ni, 12-2008 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bé – 2008 Phần I: Tổng quan 1.1 Cơ sở pháp lý đề tài : Đề tài thực theo Hợp đồng nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ số 89.08.RD/HĐ-KHCN ký ngày 28 tháng 01 năm 2008 Bộ Công Thơng Viện Công nghiệp thực phẩm.(Phụ lục kèm theo) 1.2 Tính cấp thiết mục tiêu nghiên cứu đề tài.Clenbuterol thuộc nhóm - agonist, có công thức hóa học C12H18Cl2N2O đợc sử dụng rộng rÃi nh chất tăng trọng, đợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi (TĂCN) lợn, gà, bò nhằm kích thích sinh trởng, tăng tỷ lệ nạc, nhằm giảm chi phí thức ăn Tuy nhiên, lợng Clenbuterol tồn d vật nuôi có tác động xấu đến sức khoẻ ngời nh: làm rối loạn nhịp tim, run cơ, co thắt phế quản, phù nề, liệt cơ, tăng huyết áp Các nớc Châu âu từ 1988 đà cấm đa Clenbuterol vào thức ăn chăn nuôi, Mỹ cấm năm 1991 Việt nam, từ năm 2002 theo định số 54/QĐ-BNN Bộ trởng Bộ NN& PTNT ký ngày 20/06/2002 đà cấm sản xuất, nhập khẩu, lu thông sử dụng Clenbuterol sản xuất kinh doanh thức ăn chăn nuôi Mặc dù vậy, việc sử dụng Clenbuterol trộn vào thức ăn chăn nuôi cha phải đà hết mối lợi từ tác dụng Clenbutarol đem lại Những kết nghiên cứu Viện Khoa học Kỹ tht N«ng nghiƯp miỊn Nam cho thÊy, 83 mÉu thức ăn hỗn hợp đậm đặc 12 công ty cã mÉu d−¬ng tÝnh ( chiÐm 10,8%) KÕt thử nhanh 80 mẫu thịt có 05 mẫu dơng tính ( Chiếm 6,25%) Kết Chi cục Thó y thµnh HCM cịng cho thÊy, 334 mẫu khả nghi có tồn d Clenbuterol cao có 52 mẫu dơng tính (chiếm 15.57%) Gần nhất, cuối năm 2006, đầu năm 2007 Cục Chăn nuôi đà với Sở NN-PTNN 64 tỉnh, thành phố tổ chức lấy mẫu TĂCN đại Đề tài nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 -lý, trang trại chăn nuôi sở sản xuất TĂCN để kiểm tra; đà nhận đựơc kết 114 mẫu phân tích có 19 mẫu dơng tính ( chiếm 6,4%) Rõ ràng, kiểm soát hàm lợng Clenbuterol thức ăn chăn nuôi thực phẩm việc phải làm thờng xuyên Nhằm góp phần giải yêu cầu cấp thiết xà hội công tác kiểm soát VSAT thực phẩm , tiến hành đề tài : Nghiên cứu xây dựng phơng pháp chuẩn phân tích hocmon Clenbuterol thực phẩm phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) Mục tiêu đề tài : Xây dựng qui trình chuẩn để phân tích Clenbuterol mẫu thực phẩm có độ xác cao phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) 1.3 Đối tợng, phạm vi nội dung nghiên cứu Từ đặc tính mục đích sử dụng Clenbuterol, dễ dàng nhận thấy sản phẩm thực phẩm có khả chứa d lợng Clenbuterol khác thịt gia súc sản phẩm từ thịt Tuy nhiên nguồn cung tạo d lợng chất độc hại lại xuất phát từ thức ăn chăn nuôi, kiểm soát tận gốc để phòng ngừa tránh rủi ro cần thiết Vì lý đó, tiến hành xây dựng qui trình phân tích Clenbuterol sắc ký khí khối phổ cho hai đối tợng thức ăn chăn nuôi thịt động vật Những nội dung đề tài nghiên cứu bao gồm : a Nghiên cu lựa chọn điều kiện t¸ch, làm làm giàu mẫu Clenbuterol t¸ch chiết từ mẫu b X¸c định điều kn phân tích Clenbuterol máy GC/MS c Xác nh hiệu suất thu hồi mẫu, khả phát phơng pháp d áp dung phơng pháp đà xây dng khảo sát mt s mu tht v sn phm thc phm khác a bn H Ni; so sánh kết kiểm tra với số phòng thí nghiệm khác Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 -1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu nớc 1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) Sự kết hợp phơng pháp sắc ký phơng pháp khối phổ (GC/MS) tạo nên phơng pháp phân tích đặc biệt có hiệu lĩnh vực hoá phân tích Hai thiết bị có khả bổ sung hỗ trợ cho trình phân tích (GC: tách, MS: phát hiện), phơng pháp đợc sử dụng hữu hiệu cho trình khảo sát, định lợng chất [13] Hai kü tht trªn ghÐp nèi víi cã thĨ tách định lợng chất có nồng độ 10-8 gram nhỏ nữa, nồng độ khó phát phơng pháp phân tích công cụ Ngoài ra, với kết nối này, mẫu không bền thời gian bảo quản đợc phân tích cách thuận lợi, đặc biệt việc phân tích hỗn hợp phức tạp Nhờ đó, cã thĨ tiÕt kiƯm kh¸ nhiỊu thêi gian thùc nghiƯm phân lập mẫu theo nguyên tắc điều chế trớc đa vào khối phổ giảm nhẹ yêu cầu kỹ thuật kỹ thuật viên Sơ đồ hệ sắc ký khí khối phổ mô tả tóm tắt nh sau: Về bản, thiết bị sắc ký sử dụng cột nhồi cột mao quản ghép nối thiết bị khối phổ loại hội tụ chùm tia đơn kép [2], [17] Có nhiều giải pháp kỹ thuật khác để thực việc ghép nối hệ thống Với thiết bị đại ngày toàn dòng khí thoát (khí mang mẫu) từ cột Đề tài nghiên cứu khoa häc cÊp Bé – 2008 -nhồi cột mao quản đợc chuyển thẳng vào phận chiết khí mang trung gian, sau đợc đa trực tiếp vào nguồn ion hoá mẫu Thiết bị chiết khí mang trung gian có cấu trúc khác nhau, nhng làm việc chúng phải tuân theo nguyên lý chung khuếch tán qua hệ thống lỗ xốp khếch tán thiết bị tách khuếch tán phân tử Sắc ký đồ đợc ghi lại từ tín hiệu dòng ion tổng cộng Những sắc đồ thu đợc từ tín hiệu dòng ion hoá detector ion hoá lửa nói chung tơng tự Sắc ký khối phổ đà đợc sử dụng rộng rÃi, đặc biệt giúp phát cấu tử hỗn hợp phức tạp Nhiều cải tiến quan trọng đà đợc áp dụng, đặc biệt phân tích hợp chất sinh hoá Ngoài chơng trình xử lý số liệu ghép nối với máy tính khiến trình phân tích trở nên đơn giản cho phép thu đợc kết đáng tin cậy Phổ khối đợc sử dụng nh detector đặc biệt, có độ nhạy cao Trong trờng hợp này, thiết bị cho giá trị số khối khác dòng ion đáp ứng đợc tập hợp ghi lại dới dạng sắc đồ (phân mảnh khối) Quá trình cho phép xác định đợc mẫu có nồng độ nhỏ (tới 10-10g) Về nguyên tắc hoạt động detector khối phổ, cho chất trạng thái khí va chạm với dòng electron phân tử chất bị tách hai electron để trở thành ion dơng mang điện tích 2; trình va chạm làm phân tử chất tiếp nhận thêm electron để trở thành ion âm, gọi ion hoá phân tử Khi va chạm mạnh phân tử bị phá vỡ thành nhiều phần khác mang điện tích dơng hay âm Sự phá vỡ hoàn toàn phụ thuộc vào lợng va chạm, dẫn đến cách phá vỡ phân tử khác Các ion đợc tách đo khối lợng sau ghi sắc phổ đồ Về kỹ thuật phân tích khối phổ phải tuân thủ bớc gồm: Đề tài nghiên cứu khoa häc cÊp Bé – 2008 -Hoá khí chất mẫu: mẫu đợc dẫn vào bình chứa, áp suất giảm tới 10-6 mmHg, sau dòng khí đợc dẫn vào buồng ion hoá để sản ion, lợng mẫu ghi nhận đợc nhỏ 10-13 g/giây Ion hoá mẫu, sử dụng phơng pháp: - Ion hoá nhờ tia hay phần tử mang lợng (electron, photon, hạt nhân) - Ion hoá nhờ điện trờng mạnh - Ion hoá nhờ phòng điện - Ion hoá nhờ phòng điện - Ion hoá nhờ đốt nóng (nguồn nhiệt Lazer) - Ion hoá nhờ tơng tác ion (ion hoá học) Trên thực tế nay, ngời ta sử dụng phơng pháp ion hoá qua va chạm electron Phơng pháp va chạm electron dòng khí đợc dẫn qua dòng electron thẳng góc với nó, tuỳ thuộc lợng dòng electron lớn hay nhỏ mà ion đợc sản nhiều hay (nhìn chung lợng khoảng 70ev) Tách ion theo khối lợng, nguyên tắc việc tách dựa khác khối lợng ion khác điện tích Trớc tiên ngời ta tăng tốc độ cho ion, nhờ cho qua điện trờng mạnh, vận tốc ion đợc tính theo công thức : V = 2eU m Trong : Đề tài nghiên cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 e : §iƯn tÝch ion - U : Thế tăng tốc - m : Khối lợng - V : Vận tốc Tốc độ máy phân tích đạt 100km/s Sau tăng tốc, ion đợc bay qua từ trờng, đờng bay chúng bị lệch khác tác dụng từ trờng với bán kính lệch R đợc tÝnh theo c«ng thøc: m 2U R2 = - x -e H2 Trong ®ã: - R : Bán kính lệch - m: Khối lợng ion - e: §iƯn tÝch ion - H: C−êng ®é tõ tr−êng Mét u điểm kết hợp GC/MS đợc áp dụng cách hữu hiệu cho việc nghiên cứu phân tích chất đồng vị bền Nhờ u điểm mà kỹ thuật phân tích GC/MS ngày đợc ứng dụng rộng rÃi, kể mét sè øng dơng ph©n tÝch sau: - Ph©n tích hợp chất chứa nhóm sunfua: áp dụng việc kiểm soát ô nhiễm môi trờng đặc biệt ô nhiễm bẩn dầu nớc biển ô nhiễm nguồn cung cấp thức ăn cho ngời từ cá biển Các hợp chất chứa sunfua coi thớc đo đánh giá ô nhiễm cá cá hồi Trong nghiên cứu ngời ta nhận thấy C3H17 - naphtalen giá trị m/z 170 C3H7 - banzothiophen giá trị m/z 176, alkyl benothiophen C10H10S m/z Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 -162 alkyl naphtalen C12H12 m/z 160 Ngời ta phát đồng phân alkyl benzothiophen - Phân tích hợp chất hữu có nớc ngầm: nhiều thực nghiệm đẫ đợc tiến hành để phân tích lợng vết hợp chất hữu tồn nớc Khả ứng dụng phơng pháp sắc ký khí - khối phổ việc định tính định lợng hợp chất hữu độc hại mẫu nớc thải sinh hoạt, nớc thải công nghiệp ngày nhiều Tuy nhiên việc phân tích hợp chất hữu chứa nớc tơng đối khó khăn chúng thay đổi nhanh nồng độ nhỏ Vì lý ngời ta phải sử dụng khối phổ ký để cắt nhỏ cấu tử, sau từ sắc ký khối phổ đồ kết hợp với ion mảnh đợc thể pic, số liệu thời gian lu cột để xác định thành phần nồng độ chúng - Phân tích cấu tử polyclorua: phân tích naphtalen clorua sắc ký khí khối phổ, ngời ta sử dụng phơng pháp so sánh cờng độ pic (intensity matching method) Trong phơng pháp này, đồng phân tự nhiên thành phần chứa nguyên tử clo brom phân tử đợc xác định để khẳng định có mặt hợp chất polyclorua - Phân tích nitrosamin: nitrosamin chất gây ung th, tồn môi trờng nguy hiểm đời sống ngời Mức độ độc hại nitrosamin cao, thu hút đợc chó ý cđa rÊt nhiỊu nhµ khoa häc Cã thĨ sử dụng nhiều phơng pháp để xác định nitrosamin nh GC, LC Tuy nhiên chất GC/MS phơng pháp thiếu sử dụng GC/MS ta xác định đợc cấu trúc hoá thành phần N- nitroso, u điểm lớn phơng pháp Đề tài nghiên cứu khoa häc cÊp Bé – 2008 Ngoài nghiên cứu, ứng dụng trên, phơng pháp GC/MS đợc sử dụng nhiều phân tích d lợng chất bảo vƯ thùc vËt, c¸c chÊt kÝch thÝch, c¸c ho¸ chÊt ®éc dƠ bay h¬i ë n−íc, viƯc tiÕp cận với kỹ thuật phân tích mới, đặc biệt kỹ thuật sắc ký phổ biến từ khoảng năm 90, thời kỳ số phòng thí nghiệm trờng đại học, Viện nghiên cứu đợc trang bị hệ thống sắc ký đại Với sắc ký khí khối phổ (GC/MS) cha nhiều nhng bắt đầu có nghiên cứu ứng dụng trờng đại học nh Đại học Khoa học Tự nhiên với nghiên cứu: Phân tích hợp chất hữu dễ bay nớc phơng pháp sắc ký khí khối phổ, dùng kỹ thuật lấy mẫu bay hơi; Nghiên cứu xác định PANs khí thải nhà máy giấy BÃi Bằng, tác giả Phạm Hùng Việt cộng sự; Nghiên cứu xác định Chloramphenicol mẫu sinh học phơng pháp sắc ký khí khối phổ, tác giả Vũ Công Sáu nhiên cha có công bố nớc nghiên cứu ứng dụng GC/MS để xác định Clenbuterol thực phẩm 1.4.2 Nghiên cứu xác định Clenbuterol Clenbuterol, 4-amino – alpha- tert-butylaminomethyl – 3,5 – dichlorobenzyl alcohol, lµ beta- agonist có công thức hóa học C12H18Cl2N2O; phân tử lợng 277,18 C: 52,00%, H: 6,54%, Cl: 25,58%, N: 10,11%, O: 5,77% OH Cl H N H2N Cl Việt Nam, phơng pháp xác định Clenbuterol chủ yếu dựa vào phơng pháp Eliza, nhng phơng pháp cho độ tin cậy cha cao nên kết Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008 -qu¶ kiĨm nghiệm gây nhiều tranh cÃi Để xác định hàm lợng Clenbuterol mẫu TĂCN Bộ NN&PTNN đà phải gửi mẫu thử sang Singapore để kiểm tra Việc làm đà gây nhiều chi phí tiền thời gian Hiện nay, giới phơng pháp dùng phát Clenbuterol gồm: phơng pháp Eliza, Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), Sắc ký lỏng hiệu cao khối phổ (LC/MS), Sắc ký khí khối phổ (GC/MS ) phơng pháp nêu trên, phơng pháp Eliza có u điểm phát nhanh, mang tính sàng lọc mẫu thử nhng có độ tin cậy độ xác không cao Để định lợng xác hàm lợng Clebuterol, ngời ta thờng sử dụng phơng pháp HPLC/MS GC/MS Tuy nhiên phơng pháp HPLC/MS có độ nhậy thấp hơn, chi phí đắt so với phơng pháp GC/MS; xu hớng xác định d lợng Clenbuterol phơng pháp GC/MS ngày đợc quan tâm nhiều nớc Theo tạp chí phân tích chuyên ngành, phơng pháp phát hịên Clenbuterol beta- agonists khác mẫu sinh học đà đợc công bố giới thấy: phơng pháp phát nhiều mức độ khác nhau, từ phơng pháp miễn dịch enzyme (EIA- enzyme immunoassays), sắc ký mỏng (TLC- thin layer chromatography) tới sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC- high performance liquid chromatography) s¾c ký khÝ khèi phỉ (GC/MS – gas chromatography- mass spectrometry) [9] (Girault and Fourtillan, 1990; Blanchflower et al., 1993; Wilson et al., 1994; Kingston et al., 1995; Batjoens et al., 1996; Gigosos et al, 1996; Abou- Basha and AboulEnen, 1996; Sangiorgi and Curatolo, 1997) Do cã sù trïng hỵp phản ứng beta- agonists số steroit, phơng pháp EIA RIA (radio immunoassay) không xác định đầy đủ, xác diện betaagonists mẫu sinh học; cần thiết phải sử dụng phơng pháp có tính đặc hiệu cao HPLC GC đáp ứng đợc điều nhng lại không xác 10 Đề tài nghiên cứu khoa học cÊp Bé – 2008 -Thông thờng pic chất phân tích có chiều cao gấp lần nhiễu đờng coi đợc phát Để xác định LOD, sử dụng chất chuẩn với nồng độ khác nhau, sau tiến hành xác định máy, từ kết đạt đợc nồng độ khác tìm giới hạn phát phơng pháp Kết nghiên cứu đợc trình bầy bảng Bảng Xác định giới hạn phát LOD STT Nång ®é chn (ng/ml) Tû lƯ tÝn hiƯu/ nhiƠu ®−êng nÒn (S/N) 1,00 3,02 2,00 5,13 5,00 21,23 10,00 50,25 Từ bảng cho thấy ë nång ®é 1,00 ng/ml tû lƯ tÝn hiƯu/ nhiƠu 3,02 lớn đảm bảo cho khả phát ổn định chọn LOD= 1,00 ng/ml Giới hạn xác định LOQ (Limit of quantification) lợng nhỏ chất cần phân tích có mẫu thử định lợng đợc điều kiện tiến hành phép thử Thông thờng LOQ đợc lấy từ đến lần LOD Trong phơng pháp để đảm bảo chắn khả định lợng chọn LOQ = 5.LOD Dới sắc đồ xác định LOD 32 Đề tài nghiên cứu khoa học cÊp Bé – 2008 -Abundance Ion 86.00 (85.70 to 86.70): TN15(161108).D 13.95 600 500 400 300 200 100 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 Time > Abundance Ion 293.00 (292.70 to 293.70): TN15(161108).D 19.03 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 Time > Hình2 Sắc ký đồ xác định LOD (chuẩn 2ng/ml, nội chuẩn 100ng/ml) 2.3.5 Đánh giá độ xác phơng pháp Độ xác phơng pháp thể giá trị phân tích đợc giá trị thực mẫu Thông thờng độ xác đợc phản ánh qua độ kết trình thu hồi mẫu, thông thờng phải đạt từ 80120% độ chụm., độ chụm thể giống lần phân tích (độ lặp lại) thông qua hệ số biến thiên Hệ số không đợc > 20% Để xác định độ xác, tiến hành phân tích mẫu có bổ sung chuẩn với mức 5ng/ml; 10ng/ml; 20ng/ml; nồng độ tiến hành lặp lần Kết thể bảng Bảng Đánh giá độ xác phơng pháp STT Chuẩn bổ sung (ng/ml) Hiệu st thu håi TB (%) KÕt qu¶ kiĨm tra L1 L2 L3 L4 §é lƯch chn (SD) L5 HƯ sè biÕn thiªn Cv (%) 4,60 4,50 4,70 4,80 4,60 93,0 0,102 2,20 10 9,80 9,60 9,70 9,90 9,60 97,2 0,131 1,34 20 19,60 19,80 19,70 19,80 19,70 98,60 0,075 0,38 Ghi chó: L1- L5: sè lÇn thí nghiệm 33 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bé – 2008 -Từ kết cho thấy: hiệu suất thu hồi phơng pháp nằm khoảng 80-120%; hệ số biến thiên Cv < 20% Nh hoàn toàn tin cậy phơng pháp xác định đà xây dựng 2.3.6 Tổng hợp qui trình chuẩn để phân tích Clenbuterol - Chiết tách mẫu Lấy 2-5g mẫu đà đồng hóa cho vào ống ly tâm 50ml 50 àl IS ( 1000ng/ml) 10ml HCLO4 0.1M Rung siêu âm 30phút, ly tâm 6000v/phót 40C, 15 Líp trªn Líp d−íi 10 ml HCLO4 0.1M Lớp Chuyển vào ống ly tâm 50ml, chØnh pH =10 CỈn 15ml EA- IPA (9:1, V/V) x Lắc mạnh 10phút, ly tâm 3000v/phút 40C, 15 phút Lờy lớp cho vào bình cầu cô quay, cô quaychân không cạn, nhiệt độ 500C Hòa tan cặn 5ml đệm 0.02M CH3COONH4, pH = 5.2 - Làm mẫu phơng pháp SPE 5ml dịch chiết Cột SCX (đà hoạt hoá) Hút khô 34 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008 Rưa gi¶i ( 6ml hỗn hợp MeOH: NH4OH ( 95:5 V/V)) Thu vào ống thuỷ tinh 10 ml Chuyển tạo dẫn xuất TMS - Tạo dẫn xuất Clenbuterol - TMS Dịch rửa giải thổi khô khí Nitơ 500C Để nguội, bổ sung 50 àl hỗn hợp MSTFA:TMCS (99:1 V/V) Lắc máy Votex 10 giây Giữ 600C/ 30 phút Để ngi, bỉ sung 450 µl Toluen Chun vµo lä thủ tinh 1,5 ml Bơm vào GC/MS - Chế độ chạy: • Cét t¸ch BD- 5MS (AgilentTM Technologies C.Ltd), I.D 0,25 x30m ã Nhiệt độ buồng bơm 2600 C ã Kiểu bơm : không chia dòng ã Khí mang Helium (99,999%) 35 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008 -• Tèc độ dòng 1,2 ml/phút ã Thể tích mẫu àm ã Nhiệt độ nguồn bắn ion : 2300C ã Nhiệt độ interface : 2800C ã Chế độ chạy : Full scan/SIM ( m/z 50-500) ã Thời gian cắt pic dung môi: 4, phút ã Chơng trình nhiệt độ cột: 1000C/1,5 phút tăng100/ph > 2800C tăng 50C/ph ->3000C 2.3.7 ứng dụng qui trình đ xây dựng ®Ó kiÓm tra mét sè mÉu thùc tÕ Sau xây dựng đợc qui trình phân tích Clenbuterol, áp dụng để kiểm tra số mẫu thức ăn gia súc số mẫu thịt từ thị trờng Kết thu đợc bảng dới Bảng 10 Kết kiểm tra mẫu thực tế STT 10 11 12 13 Tên mẫu Kết (ng/g) Mẫu thịt lợn M1 Mẫu thịt lợn M2 Mẫu thịt lợn M3 Mẫu thịt lợn M4 Mẫu thịt lợn M5 Mẫu thận lợn M6 MÊu thËn lỵn M7 MÉu thËn lỵn M8 MÉu thËn lỵn M9 MÉu thËn lỵn M10 MÉu gan lỵn M11 MÉu gan lỵn M12 MÉu gan lỵn M13 KPH KPH 0,45 1,07 KPH KPH KPH 0,20 KPH KPH 0,19 KPH KPH 36 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 -14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 MÉu gan lỵn M14 MÉu gan lỵn M15 MÉu mì lỵn M16 MÉu mì lỵn M17 MÉu mì lỵn M18 MÉu mì lỵn M19 MÉu mì lỵn M20 MÉu NLT¡ gia sóc NLTA1 MÉu NLT¡ gia sóc NLTA2 MÉu NLT¡ gia sóc NLTA3 MÉu NLT¡ gia sóc NLTA4 MÉu NLT¡ gia sóc NLTA5 MÉu thức ăn gia súc TA1 Mẫu thức ăn gia súc TA2 Mẫu thức ăn gia súc TA3 Mẫu thức ăn gia súc TA4 Mẫu thức ăn gia súc TA5 KPH KPH 0,14 0,17 KPH KPH KPH KPH 1,34 KPH KPH KPH 0,10 0,51 KPH KPH KPH 2.3.8 So s¸nh kÕt phân tích với số phòng thí nghiệm khác Để so sánh kết phân tích phòng thí nghiệm, sử dụng mẫu thức ăn gia súc khách hàng gửi đến, mẫu đợc tách thành ba phần sau đà đồng nhất; phần phân tích phòng thí nghiệm, hai phần lại đem gửi hai phòng thí nghiệm Phòng phân tích thức ¨n ch¨n nu«i - ViƯn Ch¨n nu«i – Bé N«ng nghiệp phát triển nông thôn phòng thí nghiệm Trung tâm Dịch vụ phân tích thí nghiệm (ASE) Thành phố Hồ Chí Minh Hai phòng thí nghiệm sử dụng hai phơng pháp: Viện Chăn nuôi phơng pháp kiểm tra ELIZA; ASE sử dụng phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) phơng pháp nh xây dựng Kết cho thấy bảng sau: 37 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bé – 2008 -Bảng 11 So sánh kết phân tích STT Tên phòng Kết mẫu phân tích (ppb) Phơng thử nghiƯm TA2 M1(AA) M2 (AB) ph¸p thư NACEFA 0,51 KPH KPH GC/MS ASE KPH KPH GC/MS Dơng tính Âm tính Âm tính ELIZA Viện Chăn nuôi TA2; M1(AA); M2(AB): ký hiệu mẫu phân tích NACEFA: Trung tâm Phân tích Giám định thực phẩm Q.G Viện CNTP ASE: Trung tâm Dịch vụ phân tích thÝ nghiÖm- TP Hå ChÝ Minh Abundance TIC: TACN(161108).D 48000 46000 44000 18.08 42000 40000 38000 36000 34000 32000 14.27 30000 28000 26000 19.03 24000 22000 20000 18000 16000 14000 12000 16.18 10000 10.31 6000 8.95 4000 18.60 18.87 8.03 6.61 7.34 6.99 2000 7.29 17.54 14.40 8000 8.00 13.94 10.00 12.00 15.96 14.00 16.00 17.41 17.81 19.34 18.00 20.00 22.00 Time > Abundance Ion 86.00 (85.70 to 86.70): TACN(161108).D 13.94 600 500 400 300 200 100 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 Time > Abundance Ion 293.00 (292.70 to 293.70): TACN(161108).D 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 6.00 19.03 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 Time > Hình3 Sắc ký đồ mẫu TĂCN nhiễm Clenbuterol 38 20.00 22.00 Đề tài nghiên cứu khoa häc cÊp Bé – 2008 -NhËn xÐt: Víi mÉu gưi ®i kiĨm tra, hai mÉu M1 m· ho¸ AA, M2 m· hoá AB ba phòng thí nghiệm không phát có Clenbuterol Mẫu TA2 phòng thí nghiệm thức ăn chăn nuôi kiểm tra phơng pháp ELIZA phát dơng tính phù hợp với kiểm tra phòng thí nghiệm có kết 0,51 ng/g Phần III: Kết luận, kiến nghị Đề tài đà hoàn thành nội dung nghiên cứu đà ký kết Hợp đồng nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ số 89.08.RD/HĐ- KHCN gồm: Đà xây dựng đợc qui trình tách, làm làm giàu Clenbuterol từ mẫu Đà xác định đợc điều kiện phù hợp để xác định Clenbuterol máy sắc ký khí khối phổ (GC/MS) bao gồm cột tách, chế độ nhiệt cho buồng bơm mẫu, chơng trình nhiệt cho cột tách, tốc độ dòng khí mang Đà xác định đợc hiệu suất thu hồi mẫu ổn định khoảng qui định cho phép từ 80 đến 120%, giới hạn phát (LOD) 1ng/ml giới hạn xác định (LOQ= LOD) phơng pháp Đà xây dựng đợc qui trình chuẩn để phân tích Clenbuterol ; áp dụng qui trình để khảo sát số mẫu thịt, thức ăn gia súc địa bàn Hà Nội ; đà tiến hành so sánh kết kiểm tra với số phòng thí nghiệm khác Hà Nội Thành phố Hồ Chí Minh Kiến nghị Đề nghị phê duyệt ban hành thành Tiêu chuẩn sở để áp dụng 39 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008 -Tµi liƯu tham khảo Đỗ Quang Huy(2000), Sắc ký khí lý thuyết thực hành Hà nội 2000 Võ Công Sáu, Nghiên cứu xác định Chloraphenicol mẫu sinh học phơng pháp sắc ký- khối phổ, Hà Nội 2003 Anders Blomgren, Christine Berggren, Anna Holmberg, Fredrik Larsson, Brorje Sellergren, Kees Ensing Extraction of clenbuterol from calf urine using a molecularly imprinted polymer followed by quantitation by high – performance liquid chromatography with UV detection Journal of chromatography A 975, 157-164 Christine Berggren, Sami Bayoudh, David Sherrington, Kees Ensing Use of moleculary imprinted solid- phase extraction for the selective clean- up of clenbuterol from calf urine Journal of Chromatography A, 889 (2000) 105-110 E Ciranni Signoretti, C D Arpino and F la Torre Determination by hight – performance liquid chromatography of clenbuterol in commercial syrup formulations Journal of Chromatography, 473, 301304 FAO/WHO (1994), Residues of some veterinary drugs in animals and food, Rom, pp1-10 F Saltron, Y.Berthoz, R Rues, N Auguin, L Belhade, Jurnal Mass Spectrom 31 (1996) 810 G Van Vyncht, S Preece, P Gaspar, G maghuin- Rogister, E DePauw Gas and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the multiresidue analysis of beta- agonists in biological matrices Journal of Chromatography A, 750, 43-49 40 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bé – 2008 -9 Imad K Abukhalaf, Daniel A von Deutsch, Bryan A Parks, Larry Wineski Comparative analytical quantitation of clenbuterol in biological matrices using GC-MS and EIA 10 J.E Roybal (1998) Chloraphenycol and related drugs- Analytical procedures of drugs residues in food of animal origin Pp 227-260 11 JP Hanrahan, in JP Hanrahan(Ed.), beta- Agonists and Their Effects on Animal Growth and Carcass Quality, Elsevier, Amsterdam, 1987 12 J Girault, P Gobrn and JB Fourtillan, Bioned Environ Mass Spectrom, 19(1990) 80 13 Kijal D.L (1994) Confirmation of CAP residues in bovine milk by Gas Chromatography Mass Spectrometry AOAC pp34-40 14 Limin he, Yijuan Su, Zhenling Zeng, Yahong Liu, Xiahui Huang Determination of ractopamine and clenbuterol in feeds by gas chromatography – mass spectrometry Animal feed science and technology 132 (2007) 316-323 15 Luca Amendola, Cristiana Colamonici, Francesca Rossi, Francesco Botre Determination of clenbuterol in human urin by GC- MS-MS-MS: confirmation analysis in antidoping control Journal of Chromatography B, 773, 7-16 16 Milagro Reig, Natalia Batlle, Jose Luis navarro, Fidel Toldra Stability of Beta – agonist methyl boronic derivatives beforre gas chromatography – mass spectrometry analysis 17 Munm.R.K., Holland D.C., Roybal S.E., Gas Chromatographic determinatin of CAP residues in shrimp AOAC pp596-601 18 M.C Dumasia, E.Houghton Screening and confirmatory analysis of beta- agonists, beta- antagonists and their metabolites in horse urin by capillary gas chromatography – mass spectrometry Journal of Chromatography, 564, 503-513 41 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 -19 P Delahaut, M Dubois, I Pri-Bar, O Buchman, G Degand and F Ectors, Food Additives Contam 8(1991),43 20 R.J.Heitzman (Ed.), Residues in Food Producing Animals and their Products – Referen Materials and Methods, Commission of the Eropean Communities, Luxemborg, 1992, p,39 21 T.Nagata, H.Oka(1996), Detection of residues CAP, florfonicol and thiamphenicol in yellow tail fish musclee by Capyllary Gas Chromatography- Mass Spectromestry Agric.Food Chem, 44(5) Pp 1280-1284 22 T Visser, M J Verdenbregt and A P J M de Jong, L A van Ginkel, H J van Rossum and R W Stephany Cryotrapping gas chromatography – fourier trasform infrared spectrometry: anew technique to confirm the presence of beta- agonists in animal material Analytica Chumuca Acta, 275, 205-214 23 Weilin L Shelver and David J Smith Enzyme – Linked Immunosorbent Assay Development for the beta- Adrenergic Agonist Zilpaterol Agriculture and Food Chemistry 52, 2159-2166 24 Yantu Zhang, Zhujun Zhang, Yonghua Sun and Yue Wei Development of Analytical Beta-Agonist Residues in Animal Tissues by high- performance liquid chromatography with On- line Electrogenerated Chemiluminescence detection Agricultural and Food Chemistry 55 (2007), 4949-4956 25 http://tintuc timnhanh.com 07/6/2006 Chất Clenbiterol gây ngộ độc cấp ngời thịt heo 26 http://www.qđn.vn 18/01/2007 Xử lý nghiêm doanh nghiệp dùng hooc mon chăn nuôi 27 http://www.nld.com.vn 20/01/2007 ChÊt Clenbuterol cã phô gia 28 http://www.vista.gov.vn 04/4/2007 42 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bé – 2008 Danh mục chữ viết tắt Eliza Enzyme Linked Immunosorbent Assays EIA Enzyme Immunosorbent Assay GC/MS Gas Chromatography/ Mass Spectrophotomet HPLC High Performant Liqiud Chromatography LC Liquid Chromatography LOD Limit of Detection LOQ Limid of Quantitation LC/MS Liquid Chromatography/ Mass Spectrophotomet RIA Radio Immuno Assay PAN Polycyclic Aromatic Hydrocarbons SPE Solid Phase Extract TLC Think Layer Chromatography T¡CN Thức ăn chăn nuôi NN & PTNT Nông nghiệp phát triển nông thôn NACEFA National Center for Food Analysis and Assesment VSAT Vệ sinh an toàn KPH Không phát hiÖn MSTFA N- Methyl- N- (trimethylsilyl) trifluoro acetomide SCX Strong cation exchange 43 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bé – 2008 Mục lục Mục Tên đề mục Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng biểu I Phần I: Tổng quan 1.1 Cơ sở pháp lý đề tài 1.2 Tính cấp thiết mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Đối tợng phạm vi nội dung nghiên cứu 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu nớc 1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) 1.4.2 Nghiên cứu xác định Clenbuterol 1.5 Các phơng pháp xác định Clenbuterol 11 II Phần II: thực nghiệm 13 2.1 Phơng pháp nghiên cứu 13 2.1.1 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu phân tích 13 2.1.2 Xác định khả thu hồi mẫu; LOD LOQ 17 2.1.3 Tạo ổn định, phù hợp cho chất phân tích (dẫn 18 xuất hoá) 2.1.4 Phơng pháp ngoại chuẩn 18 2.1.5 Phơng pháp nội chuẩn 18 44 Đề tài nghiên cứu khoa học cÊp Bé – 2008 -2.1.6 Phơng pháp tự nội chuẩn 19 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 19 2.3 Kết nghiên cứu thảo luận 20 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách làm 20 2.3.1 làm giàu mẫu 2.3.2 Nghiên cứu tạo dẫn xuất Clenbuterol 25 2.3.3 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho 27 GC/MS để phát định lợng Clenbuterol 2.3.4 Nghiên cứu xác định LOD LOQ 29 2.3.5 Nghiên cứu đánh giá độ xác phơng 30 pháp 2.3.6 Tổng hợp qui trình chuẩn để phân tích Clenbuterol 32 2.3.7 ứng dụng qui trình đà xây dựng để kiÓm tra mét sè 33 mÉu thùc tÕ 2.3.8 So sánh kết phân tích với số phòng thí 34 nghiệm khác III Phần III: Kết luận, kiến nghị 35 Tài liệu tham khảo 37 Các phụ lục 45 Hợp đồng nghiên cứu khoa học Phiếu kết phòng thí nghiệm so sánh Sắc ký đồ kết nghiên cứu 45 Đề tài nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008 Danh mơc c¸c bảng biểu STT Tên bảng biểu Bảng Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết tách Bảng Nghiên cứu số lần chiết tách mẫu Bảng Nghiên lựa chọn dung môi làm Bảng Kiểm tra lựa chọn lợng dung môi thích hợp Bảng Nghiên cứu lựa chọn dung môi rửa giải Bảng Nghiên cứu lựa chọn tốc độ rửa giải Bảng Nghiên cứu lựa chọn điều kiện dẫn xuất hoá Bảng Nghiên cứu lựa chọn chế độ nhiệt Bảng Nghiên cứu lựa chọn chế độ dòng khí mang Bảng 10 Nghiên cứu xác định khả thu hồi mẫu Bảng 11 Xác định giới hạn phát Bảng 12 Kết kiĨm tra mét sè mÉu thùc tÕ B¶ng 13 So sánh kết phân tích với số phòng thí nghiƯm kh¸c 46 Trang