Bé y tÕ ViƯn kiĨm nghiƯm thc B¸o c¸o tỉng kết đề tài cấp Nghiên cứu đánh giá tơng đơng sinh học viên nang helinzole (omeprazol 20g) theo mô hình đơn liều kết hợp đa liều Chủ nhiệm đề tài: ts phùng thị vinh 6724 28/01/2008 hà nội - 2007 BỘ Y TẾ =====O===== BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NANG HELINZOLE (Omeprazol 20mg) THEO MƠ HÌNH ĐƠN LIỀU KẾT HỢP ĐA LIỀU Chủ nhiệm đề tài: TS Phùng Thị Vinh Đồng chủ nhiệm: PGS.TS Trịnh Văn Lẩu Cơ quan chủ trì: Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế Mã số đề tài: VKN 05 TC 01 HÀ NỘI - 2007 06 trang Bản báo cáo gồm BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NANG HELINZOLE (Omeprazol 20mg) THEO MƠ HÌNH ĐƠN LIỀU KẾT HỢP ĐA LIỀU Chủ nhiệm đề tài: TS Phùng Thị Vinh Đồng chủ nhiệm: PGS.TS Trịnh Văn Lẩu Cơ quan chủ trì: Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế Cấp quản lý: Bộ Y tế Mã số: VKN 05 TC 01 Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/ 2005 đến tháng 12/ 2007 Tổng kinh phí thực đề tài: 400 triệu đồng Trong đó: Kinh phí nghiệp: 350 triệu đồng Nguồn khác: 50 triệu đồng HÀ NỘI - 2007 Bản báo cáo gồ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học viên nang Helinzole (omeprazol 20mg) theo mơ hình đơn liều kết hợp đa liều Chủ nhiệm đề tài: TS Phùng Thị Vinh Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế Địa chỉ: 48 - Hai Bà Trưng, Hà Nội Điện thoại: (84 – 4) 363 114 Fax: (84 – 4) 356 911 Cơ quan quản lý: Bộ Y tế Thư ký đề tài: DS Lê Thị Thu Huyền Đồng chủ nhiệm: PGS.TS Trịnh Văn Lẩu Danh sách người thực Ths Tạ Mạnh Hùng DS Lê Thị Thu Huyền DS Trần Hoàng DS Hà Thị Minh Châu DS Hà Minh Hiền TS BS Phạm Duệ Công ty TNHN SPM Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/ 2005 đến tháng 12/ 2007 MỤC LỤC STT Nội dung PHẦN A: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ TÓM TẮT CỦA ĐỀ TÀI Số trang Kết bật đề tài a Đóng góp đề tài b, Hiệu cụ thể c, Hiệu đào tạo d, Hiệu kinh tế e, Hiệu xã hội f, Các hiệu khác Áp dụng vào thực tiễn sản xuất đời sống xã hội 3 Đánh giá thực đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu phê duyệt a, Tiến độ b, Thực mục tiêu nghiên cứu c, Các sản phẩm tạo so với dự kiến đề cương d, Đánh giá việc sử dụng kinh phí 4 Các ý kiến đề xuất PHẦN B: NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Giả thiết nghiên cứu đề tài 1.3 Mục tiêu nghiên cứu TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước liên quan đến đề tài 2.1.1 Tổng quan omeprazol 2.1.2 Phương pháp phân tích 2.1.3 Nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học 11 2.2 Tình hình nghiên cứu nước liên quan đến đề tài 13 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Thiết kế nghiên cứu 16 3.1.1 Nghiên cứu in vitro 15 3.1.2 Nghiên cứu in vivo 16 3.2 Đối tượng điều kiện nghiên cứu 16 3.2.1 Thuốc nghiên cứu 16 3.2.2 Thiết bị, dung mơi, hố chất 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Khảo sát độ hoà tan in vitro 17 3.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích omeprazol huyết tương 18 3.3.3 Đánh giá tương đương sinh học in vivo 19 3.3.3.1 Tuân thủ qui định đạo đức 19 3.3.3.2 Người tình nguyện 19 3.3.3.3 Liều dùng cách dùng 20 3.3.3.4 Cách lấy mấu 20 3.3.3.5 Phân tích mẫu huyết tương NTN sau uống thuốc 21 3.3.3.6 Xác định thông số dược động học 21 3.4 Xây dựng qui trình 22 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 4.1 Khảo sát độ hồ tan invitro 23 4.1.1 Thử độ hịa tan môi trường ph 4,5 1,2 23 4.1.2 Thử độ hịa tan mơi trường pH 6,8 25 4.2 Xây dựng phương pháp phân tích omeprazol huyết tương 26 4.2.1 Xây dựng phương pháp 26 4.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 28 4.3 Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học in vivo 35 4.3.1 Kết tuyển chọn người tình nguyện 35 4.3.2 Kết nghiên cứu thăm dị 37 4.3.3 Mã hóa phân nhóm người tình nguyện 37 4.3.4 Q trình lấy mẫu đánh giá độ an toàn 38 4.3.5 Xác định nồng độ thuốc huyết tương 38 4.3.6 Phân tích dược động học đánh giá tương đương sinh học 44 4.4 Xây dựng qui trình 50 4.4.1 Lựa chọn cỡ mẫu thử 50 4.4.2 Xây dựng qui trình thử 51 BÀN LUẬN 52 5.1 Thử nghiệm in vitro 52 5.2 Phương pháp phân tích 52 5.3 Thẩm định phương pháp phân tích 53 5.4 Thử nghiệm in vivo 53 KẾT LUẬN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 62 DANH MỤC CÁC BẢNG KẾT QUẢ Bảng 2.1 Tóm tắt số phương pháp kiểm nghiệm omeprazol chế phẩm Bảng 2.2: Tóm tắt số phương pháp phân tích omeprazol dịch sinh học Bảng 2.3 Một số chế phẩm omeprazol lưu hành Việt nam Bảng 3.1: Kế hoạch uống thuốc lấy mẫu Bảng 4.1 Kết thử độ hoà tan viên nang Helinzole Lomac môi trường pH 1,2 pH 4,5 sau Bảng 4.2 Kết thử độ hồ tan viên nang Helinzole mơi trường pH 6,8 Bảng 4.3 Kết thử độ hoà tan viên nang Lomac môi trường pH 6,8 Bảng 4.4 Sự phụ thuộc tỷ lệ diện tích pic chuẩn/ chuẩn nội nồng độ Omeprazol chuẩn pha huyết tương Bảng 4.5 Kết xác định giới hạn định lượng Bảng 4.6 Kết khảo sát độ lặp lại ngày Bảng Kết khảo sát độ lặp lại ngày Bảng 4.8 Kết đánh giá hiệu suất chiết omeprazol khỏi huyết tương Bảng 4.9 Kết đánh giá hiệu suất chiết Albendazol khỏi huyết tương Bảng 4.10 Kết nghiên cứu độ ổn định sau chu kỳ đông – rã Bảng 4.11 Kết nghiên cứu độ ổn định dài ngày Bảng 4.12: Kết độ ổn định chuẩn chuẩn nội gốc nhiệt độ phòng Bảng 4.13: Kết nghiên cứu ổn định chuẩn chuẩn nội gốc thời gian dài bảo quản - 8oC Bảng 4.14: Kết xét nghiệm huyết học sinh hố người tình nguyện Bảng 4.15.: Kết khám lâm sàng người tình nguyện Bảng 4.16: Kết thăm dị thơng số dược động học NTN Bảng 4.17: Bố trí uống thuốc lấy mẫu máu Bảng 4.18: Nồng độ omeprazol huyết tương NTN sau uống liều đơn thuốc thử Helinzole Bảng 4.19: Nồng độ omeprazol huyết tương NTN sau uống liều thuốc thử Helinzole Bảng 4.20: Nồng độ omeprazol huyết tương NTN sau uống liều đơn thuốc chứng Lomac Bảng 4.21: Nồng độ omeprazol huyết tương NTN sau uống liều thuốc chứng Lomac Bảng 4.22 Thơng số dược động học Cmax người tình nguyện sau uống liều đơn uống liên tục ngày (n = 18) Bảng 4.23: Phân tích phương sai giá trị logarit Cmax dùng liều đơn Bảng 4.24: Phân tích phương sai giá trị logarit Cmax sau dùng liều Bảng 4.25 Thông số dược động học AUC0-∞ trung bình người tình nguyện sau dùng liều đơn ngày liên tục (n = 18) Bảng 4.26: Phân tích phương sai giá trị logarit AUC0-∞ dùng liều đơn Bảng 4.27: Phân tích phương sai giá trị logarit AUC0-∞ sau dùng liều Bảng 4.28: So sánh giá trị Tmax sau dùng liều đơn Bảng 4.29: So sánh giá trị Tmax sau dùng thuốc liên tục liều Bảng 4.30 Phân tích phương sai Cmax uống liều Bảng 4.31: Phân tích phương sai Cmax uống liều Bảng 4.32: Phân tích phương sai AUC uống liều Bảng 4.33: Phân tích phương sai AUC uống liều Bảng 5.1: Thơng số dược động học trung bình sau dùng liều liều Bảng 6.1: Thơng số dược động học trung bình sau dùng viên nang omeprazol Bảng 6.2: Kết đánh giá tương đương sinh học Helinzole so với Lomac DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 4.1: Phổ UV chuẩn omeprazol mơi trường acid sau 30 phút Hình 4.2 : Qui trình xử lý mẫu huyết tương Hình 4.3 Sắc ký đồ huyết tương trắng (a) huyết tương trắng có pha chuẩn chuẩn nội (b) Hình 4.4: Đường biểu diễn phụ thuộc tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội theo nồng độ Omeprazol chuẩn pha huyết tương Hình 4.5: Đường cong nồng độ thuốc trung bình huyết tương - thời gian 18 NTN sau uống liều đơn Helinzole Lomac Hình 4.6: Đường cong nồng độ thuốc trung bình huyết tương - thời gian 18 NTN sau uống thuốc liên tục liều Helinzole Lomac DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC: - Phụ lục 1: Đề cương nghiên cứu, mẫu cam kết; Bản chấp thuận Hội đồng đạo đức - Phụ lục 2: Qui trình phân tích omeprazol huyết tương - Phụ lục 3: Qui trình đánh giá tương đương sinh học viên nang omeprazol bao tan ruột - Phụ lục 4: Bản kiến nghị gửi bên liên quan CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung AUC Diện tích đường cong Cmax Nồng độ thuốc tối đa CV Hệ số biến thiên ĐHT Độ hoà tan GCP Thực hành lâm sàng tốt GLP Thực hành phịng thí nghiệm tốt MeCN Acetonitril MeOH Methanol NTN Người tình nguyện SD Độ lệch chuẩn SKD Sinh khả dụng T1/2 Thời gian bán thải TB Trung bình TĐSH Tương đương sinh học Tmax Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa TW Trung ương US - FDA Cơ quan Quản lý thuốc - thực phẩm Mỹ USP Dược điển Mỹ VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương WHO Tổ chức y tế giới KẾT LUẬN Tất nội dung nghiên cứu đề cập đề cương phê duyệt đề tài thực đầy đủ theo phương pháp nghiên cứu dự kiến Kết nghiên cứu đề tài đáp ứng mục tiêu đề Tóm tắt kết chủ yếu đề tài sau: - Đã khảo sát độ hoà tan viên nang Helinzole so với viên đối chứng Lomac môi trường pH Kết cho thấy chế phẩm có độ hồ tan khơng tương đương pH 6,8 (với F2 = 47,6), độ hoà tan sau mơi trường pH 1,2 4,5 khác có ý nghĩa thống kê - Đánh giá tương đương sinh học in vivo viên nang Helinzole so với viên Lomac (cùng dạng viên bao tan ruột có chứa 20mg omeprazol) 18 người tình nguyện có kết sau: sau uống liều, hai chế phẩm không tương đương sinh học Sau uống liều, hai chế phẩm tương đương sinh học với giá trị khoảng tin cậy 90% Cmax nằm khoảng 96,9 % – 115,9 % AUC nằm khoảng 97,1% – 124,6% - Đã xây dựng qui trình: + Qui trình phân tích Omeprazole huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao Chiết tách omeprazol khỏi huyết tương hỗn hợp dung môi: dicloromethan: iosopropanol: n- hexan Xác định nồng độ omeprazole hệ thống HPLC với điều kiện sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP18, 250 mm x 4,6 mm, 5µm; Pha động: Acetonitril : Methanol : Đệm phosphat pH 7,2 (20 :50 :30), điều chỉnh tỷ lệ thích hợp, cần ; Tốc độ dịng: gradient dung mơi điều chỉnh tốc độ – ml/ phút khoảng 10 phút cho omeprazol tách khỏi pic tạp thời gian phân tích phù hợp; Detector: UV 302nm; Thể tích tiêm mẫu: 100µl Phương pháp thẩm định đạt yêu cầu qui định Qui trình khả thi phù hợp với điều kiện số phịng thí nghiệm Việt Nam + Qui trình đánh giá tương đương sinh học cho chế phẩm viên nang có chứa omeprazol dạng hạt bao tan ruột Có thể tham khảo qui trình để xây dựng cho số loại chế phẩm khác có chứa omeprazol Các ý kiến đề xuất - Cơ quan quản lý (Cục Quản lý Dược Việt Nam) cần sớm ban hành qui chế yêu cầu thử tương đương sinh học cho số chế phẩm thuốc Danh mục chế phẩm cần thử nên có viên nang omeprazol Để thống nghiên cứu, quan quản lý sớm ban hành hướng dẫn thực đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học 58 - thuốc; đồng thời xem xét phê duyệt thuốc đối chứng cho trường hợp cụ thể Để phản ánh xác hiệu điều trị, số chế phẩm có sinh khả dụng biến thiên, nồng độ thuốc máu thấp sử dụng dài ngày điều trị (như omeprazol), cần đánh giá tương đương sinh học, nên xem xét thiết kế thử nghiệm nghiên cứu sau dùng vài liều, xử lý kết dùng đơn liều Hà nội, ngày tháng 12 năm 2007 Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài KT Viện trưởng PHÓ VIỆN TRƯỞNG Phùng Thị Vinh TS Nguyễn Văn Tựu 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2002), Dược thư quốc gia Việt Nam, tr.747 - 748 Bộ Y tế, Quy chế tổ chức hoạt động Hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học” (số 5129/ 2002 QĐ-BYT) Công ty TNHH SPM, Tiêu chuẩn chất lượng phương pháp kiểm nghiệm viên nang Helinzole, Nhà xuất Y học Hà nội (2002), Bộ môn Dược Lâm sàng, Dược lâm sàng đại cương, tr - 23 Tạ Mạnh Hùng, Phùng Thị Vinh cs, Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích norfloxacin dịch sinh học, Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học 2001 – 2006, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Trung tâm Tiêu chuẩn chất lượng, tuyển tập tiêu chuẩn Việt Nam độ xác phương pháp đo kết đo, Hà Nội, 2004 Trường Đại học Dược Hà nội (2004), Bộ môn Bào chế, Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc, tập 1, Tr 13 - 26 Trường Đại học Dược Hà nội (2003), Bộ môn Bào chế, Sinh dược học bào chế, tài liệu sau đại học, tr - 33 Trường Đại học Dược Hà Nội (2003), Bộ mơn Hố dược, Hóa dược tập 2, tr 30 - 31 Phùng Thị Vinh (2005), Hệ thống phân loại sinh dược ứng dụng đánh giá chất lượng TĐSH, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc - số 2.2005, tập 3, Tr - Tài liệu nước 10 Abdou H.M - Disolution, Bioavailability & Bioequivalence, 1989 11 ASEAN guidelines for the conduct of bioavailability and bioequivalent studies, final draft, 7/2003 12 Bolton S., Pharmaceutical Statistics Third edition, Marcel Dekker INC, 1997 13 Cairns A.M., Chiou R.H.-Y…, Enantioselective high performance liquid chromatographic determination of omeprazole in human plasma J Chromatogr B 1995, 666, 323-328 14 Chines Pharmacopoeia Commission, The Pharmacopoiea of the People's Republic of China Guidances in vivo bioavailability and bioequivalence studies for drug preparation, 2005 60 15 Cipla Ltd., Dossier for drug registration into Vietnam, Finished product specification and test method 16 Duvauchelle T., Millerioux L., Comparative bioavailability study of two oral omeprazole formulations after single and repeated administrations in healthy volunteers Clinical Drug investigation, August 1998, Vol 16, No 2, p 141 – 149 17 Elkoshi Z., Behr D…, Multi-dose study can be a more sensitive assesment for bioequivalence than single – dose studies: the case with omeprazole – Clinical drug investigation 2002, vol 22, No 9, p 585 – 592 18 FDA – United State, Guidance for industry, Bioanalytical method validation, May 2001 19 FDA - United State, Guidance for industry - Waive of in vivo biovailability and bioequivalence studies for Immediate- Release solid oral dosage forms based on a Biopharmaceutics classification system August 2000 20 FDA – United State, Guidance for industry, Bioavailability and Bioequivalence studies for oral administered drug products – General considerations, Guidance for industry, May 2003 21 ICH Harmonised Tripartite, Guidelines for Good Clinical Practice, 1996 22 Indian Pharmacopoiea 1996 Omeprazole capsules 23 Katashima M., Yamamoto K., Comparative pharmacokinetic / pharmacodynamic study of proton pum inhibitors, omeprazole and lansoprazole in rats Drug metab Dispos., 1995, 23, 718 – 723 24 Lagerstrom P.O.; Persson B.A.; Determination of omeprazole and metabolites in plasma and urine by liquid chromatography J Chromatogr 1984, 309, 347 -356 25 Lunn G and Schumuff N.R, HPLC Methods for Pharmaceutical analysis, John Wiley & Sons, Inc 1997 26 Ministry of Health of Malaysia, Malaysian guidelines for the conduct of bioavailability and bioequivalence studies, 7/2000 27 Mostafavi S.A., Tavakoli N., Iran (2004), Relative Boiavailability of Omeprazole capsules after oral dosing Daru Volume 12, No 4, 2004, p.146 Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran 28 Mostafavi S.A (Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Science, Isfahan University of Medical, Iran) - Relative bioavailability of omeprazole capsules after oral dosing Daru, volume 12, No 4, 2004 29 Riley C.M, Development and Validation of Analytical Methods, Elsevier Science Ltd, 1996 61 30 The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products - Evaluation of Medicines for Human Use (2001): Note for Guidance on the Investigation of Bioavailability and Bioequivalence 31 The Merck index, thirteenth edition, 2001, P 6913 32 The United States of Pharmacopoeia XXX: In vitro and in vivo evaluation of dosage forms; In vivo bioequivalence guidelines (p 2334 – 2379) 33 The United States of Pharmacopoeia XXX: Omeprazole extend release 34 Watanabe, K Furuno, K First pass metabolism of omeprazole in rats J Pharm Sci 1994, 83, 1131 – 1134 35 Welling P.G., Tse F.L.S., Dighe S.V., Pharmaceutical bioequivalence, Marcel Dekker, Inc page - 34, 235 – 267, 347 – 381, 1991 36 World Health organization, Multisource (generic) pharmaceutical products guidelines on registration requirements to establish interchangeability, draf for revision 2004 37 World Health Organization (2000): Operational Guidelines for the Ethics Committees that Review Biomedical Research 38 World Health organization, Proposal to waive in vivo bioequivalence requirements for WHO model list of essential medicines immediate release, solid oral dosage forms October 2004 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đề cương thử in vivo hội đồng đạo đức phê duyệt Phụ lục 2: Qui trình phân tích omeprazol huyết tương Phụ lục 3: Qui trình đánh giá TĐSH viên nang có chứa omeprazol dạng hạt bao tan ruột Phụ lục 4: Bản kiến nghị gửi quan liên quan 62 Bé y tế Viện kiểm nghiệm thuốc Phụ lục đề tài Nghiên cứu đánh giá tơng đơng sinh học viên nang helinzole (omeprazol 20g) theo mô hình đơn liều kết hợp đa liều Chủ nhiệm đề tài: ts phùng thị vinh hà néi - 2007 QUI TRÌNH PHÂN TÍCH OMEPRAZOL TRONG DỊCH SINH HỌC PHẠM VI ÁP DỤNG - Qui trình áp dụng phân tích omeprazol nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị , nghiên cứu lâm sàng chế phẩm có chứa omeprazol - Áp dụng cho mẫu thử huyết tương - Thực kỹ thuật viên, nghiên cứu viên đào tạo phân tích mẫu dịch sinh học - Thực sở có trang bị đủ thiết bị xử lý phân tích mẫu, hoạt động tuân thủ theo GLP NỘI DUNG 2.1 Hoá chất thiết bị Chất chuẩn: - Omeprazol chất đối chiếu chuẩn làm việc - Albendazol, chất đối chiếu chuẩn làm việc (chuẩn nội) Dung mơi, hố chất: - Acetonitril, methanol, dicloromethan loại dùng cho HPLC - Merck - Isopropanol, n - hexan hố chất, dung mơi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) dùng chiết tách chạy sắc ký Huyết tương: dùng huyết tương trắng người tình nguyện khoẻ mạnh Thiết bị: hiệu chuẩn theo qui định, đáp ứng yêu cầu ISO IEC 17025 GLP - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Merck - Hitachi, L-7455, D-7000, DAD tương đương - Máy ly tâm lạnh, máy lắc - Thiết bị bốc dung mơi có gắn phận cấp khí - Tủ bảo quản mẫu sinh học âm sâu (- 20oC đến – 80oC) Các loại dụng cụ phân tích: - Micropipet, pipet, bình định mức có độ xác thích hợp - Ống ly tâm chịu dung mơi tốc độ cao, có nắp đậy - Các loại dụng cụ dùng chiết tách khác: cốc có mỏ, pipet, buret 2.2 Mẫu thử Mẫu thử huyết tương người sau dùng chế phẩm có chứa omeprazol Lấy mẫu máu bệnh nhân hay người tình nguyện vào ống nghiệm có chứa sẵn chất chống đông (heparin EDTA) Lắc nhẹ – lần để chống đông Ly tâm 3000 – 4000 vòng/ phút để tách lấy huyết tương sau lấy máu, sớm tốt Đuyết tương vào ống PE có nắp kín, ghi nhãn bảo quản tủ - 40oC phân tích Mẫu ổn định vòng 45 ngày Nếu bảo quản nhiệt độ thấp hơn, mẫu ổn định thời gian dài 2.3 Chuẩn bị mẫu chuẩn mẫu thử Dung dịch chuẩn gốc: Hoà tan Omeprazole methanol để thu dung dịch có nồng độ xác khoảng 500µg/ml Mẫu chuẩn (WS): Pha dãy chuẩn có nồng độ khoảng từ 25 – 1000ng/ml Lấy thể tích xác dung dịch chuẩn gốc, bốc dung mơi thu cắn (ở 40oC, luồng khí N2) Hoà tan cắn huyết tương trắng cách lắc xốy 2000vịng/phút Dịch thu mẫu chuẩn có nồng độ xác định Chuẩn nội (IS): Pha dung dịch chuẩn nội gốc albendazol methanol có nồng độ khoảng 500µg/ml Pha lỗng tiếp để có dung dịch khoảng 8µg/ml Mẫu trắng (B): Huyết tương trắng bệnh nhân/ người tình nguyện trước dùng thuốc có chứa omeprazole Mẫu thử (T): Huyết tương bệnh nhân/ người tình nguyện sau uống Omeprazole Huyết tương 1ml + IS + đệm borat pH9,0 Lắc xoáy 30 giây Hỗn hợp + dung môi chiết Lắc tốc độ 60 lần/phút/`10phút Hỗn dịch Ly tâm tốc độ 4000 vịng/phút × 10 hút Dịch (5ml) Bốc dịch 40oC có khí N2 Cắn Hoà tan pha động Dịch Lọc qua màng lọc 0,45µm Chạy sắc ký Sơ đồ 1: Qui trình chiết tách omeprazol dịch sinh học 2.4 Tiến hành: Xử lý mẫu: Mẫu huyết tương để tan chảy nhiệt độ phịng trước phân tích Lấy 1ml mẫu huyết tương (chuẩn/ thử), thêm thể tích dung dịch chuẩn nội thích hợp (khoảng 50µl), 2ml dung dịch đệm* Borat pH 9,0, lắc Chiết hỗn hợp dung môi dicloromethan: isopropanol: n-hexan (15:2,5:2,5), Lắc trộn kỹ, tách lấy lớp dung môi, bốc thu cắn Hoà tan cắn pha động, lọc tiêm vào máy sắc ký (Xem sơ đồ 1) Định lượng omeprazol : Xác định lượng omeprazol chiết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với điều kiện sau: - Cột: Cột RP18, 5µm, 250mm x 4,6 mm - Pha động: methanol: acetonitril: đệm* phosphat pH 7,2 (20 :50 :30), điều chỉnh tỷ lệ thích hợp cần - Tốc độ dòng: gradient dung môi, điều chỉnh tốc độ từ – ml/ phút 10 phút để tách omeprazol khỏi pic tạp thời gian phân tích phù hợp - Detector: 302nm - Chuẩn nội: Albendazol * Dung dịch đệm pha theo dược điển Mỹ Điều chỉnh điều kiện phân tích cần để có đáp ứng tốt Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu trắng, mẫu thử theo điều kiện Ghi đáp ứng tính kết dựa nồng độ pha thực tế, thể tích dung mơi chiết đáp ứng thu Sắc ký đồ có giá trị để xem xét mẫu trắng khơng có pic có thời gian lưu quanh khu vực thời gian lưu mẫu chuẩn omeprazol chuẩn nội albendazol 2.5 Hồ sơ, báo cáo - Ghi chép chi tiết điều kiện thử nghiệm, giá trị chuẩn bị dung dịch chuẩn, kết quả, sắc ký đồ đo Lưu vào hồ sơ gốc - Báo cáo kết cần ghi rõ điều kiện phân tích, thơng tin chất chuẩn, thiết bị số liệu tính tốn Sắc đồ phân tích mẫu chuẩn, trắng mẫu thử đưa vào báo cáo cần QUI TRÌNH ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NANG OMEPRAZOL PHẠM VI ÁP DỤNG - Qui trình áp dụng cần thực nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị, nghiên cứu lâm sàng chế phẩm có chứa omeprazol dạng hạt bao tan ruột dùng đường uống - Thực kỹ thuật viên, nghiên cứu viên đào tạo phân tích mẫu dịch sinh học - Thực sở có đủ sở lâm sàng đáp ứng yêu cầu GCP sở phân tích trang bị đủ thiết bị xử lý phân tích mẫu, hoạt động tuân thủ theo GLP NỘI DUNG 2.1 Yêu cầu sở nghiên cứu 2.1.1 Cơ sở lấy mẫu: Cơ sở lấy mẫu phải có đủ diện tích, phân chia thành khu vực riêng để thực việc cho uống thuốc lấy mẫu thích hợp đáp ứng yêu cầu Phải có khu vực cho người tình nguyện nghỉ ngơi qua đêm ngày lấy mẫu, khu vực để sinh hoạt, giải trí cần, khu ăn uống vệ sinh - Khu vực lấy mẫu: đủ diện tích để tập kết dụng cụ lấy mẫu, nghiên cứu viên người tình nguyện tập trung lấy mẫu - Phải có trang bị tủ thuốc dụng cụ cấp cứu kịp thời trường hợp xảy cố thuốc phản ứng khác nguy hại cho NTN Đồng thời có giường bác sĩ xử trí cấp cứu cần thiết 2.1.2 Cơ sở phân tích: - Trang bị đủ thiết bị, hoá chất dụng cụ cho phân tích Hố chất thiết bị Chất chuẩn: - Omeprazol chất đối chiếu chuẩn làm việc - Albendazol, chất đối chiếu chuẩn làm việc (chuẩn nội) Dung môi, hoá chất: - Acetonitril, methanol, dicloromethan loại dùng cho HPLC - Merck - Isopropanol, n - hexan hoá chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) dùng chiết tách chạy sắc ký Huyết tương: dùng huyết tương trắng người tình nguyện khoẻ mạnh Thiết bị: hiệu chuẩn theo qui định, đáp ứng yêu cầu ISO IEC 17025 GLP - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Merck - Hitachi, L-7455, D-7000, DAD tương đương - Máy ly tâm lạnh, máy lắc - Thiết bị bốc dung mơi có gắn phận cấp khí - Tủ bảo quản mẫu sinh học âm sâu (- 20oC đến – 80oC) Các loại dụng cụ phân tích: - Micropipet, pipet, bình định mức có độ xác thích hợp - Ống ly tâm chịu dung môi tốc độ cao, có nắp đậy - Các loại dụng cụ dùng chiết tách khác: cốc có mỏ, pipet, buret 2.2 Khảo sát độ hoà tan in vitro Có thể tiến hành khảo sát độ hịa tan chế phẩm thử so với chế phẩm đối chứng điều kiện Tuy nhiên, kết độ hòa tan mang tính chất tham khảo để biết mức độ hòa tan Thiết bị : + Thiết bị thử độ hoà tan loại (giỏ quay) + Tốc độ : 100vịng/ phút - Mơi trường: 900ml, mơi trường có pH khác nhau: + Môi trường pH 1,2 : Lấy 8,5 ml dung dịch HCl đậm đặc pha loãng vừa đủ 1000 ml nước điều chỉnh đến pH 1,2 với NaOH 0,1N + Mơi trường đệm acetat pH 4,5: Hồ tan 2,99 gam Natri acetat trihydrat, thêm 14,0ml acid acetic 2N, điều chỉnh đến pH 4,5 acid acetic 0,5N + Mơi trường đệm phosphat pH 6,8: Hồ tan 27,22 gam KH2PO4 vừa đủ 1000 ml nước Điều chỉnh đến pH 6,8 NaOH 0,5N - Nhiệt độ môi trường hoà tan : 37o C ± 0,5 - Tiến hành: Mẫu thử mẫu đối chứng thử độ hòa tan song song, thời điểm thiết bị, với điều kiện nêu trên, thử môi trường pH khác Với mẫu thử , thử 12 viên / môi trường + Với môi trường pH 6,8: Lấy dịch hoà tan để định lượng Omeprazol thời điểm : 5; 10; 15; 30 phút sau bắt đầu + Với môi trường pH 1,2 4,5: Sau giờ, lấy hạt cịn lại giỏ, hồ tan dung dịch NaOH 0,1N MeOH để tính lượng Omeprazol Tính lượng Omeprazol hồ tan cách trừ lượng lại Định lượng Omeprazol Định lượng Omeprazol mơi trường hồ tan phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại bước sóng 302nm Dung dịch đối chiếu: Cân xác khoảng 50 mg Omeprazol chuẩn làm việc cho vào bình định mức 100 ml Hồ tan thêm tới vạch dung dịch NaOH 0,1N MeOH (dung dịch A, chuẩn gốc) + Với môi trường pH 1,2 4,5: Lấy ml dung dịch A pha thành 100 ml với NaOH 0,1N MeOH Dùng dung dịch NaOH 0,1N MeOH làm mẫu trắng Xác định % lượng hoà tan sau + Với môi trường pH 6,8: Lấy ml dung dịch A pha thành 50 ml với môi trường pH 6,8 Dùng môi trường pH 6,8 làm mẫu trắng Với mẫu , tính lượng Omeprazol giải phóng thời điểm Xác định % hồ tan trung bình thời điểm so với hàm lượng ghi nhãn độ lệch chuẩn tương đối Đánh giá kết - Môi trường pH 6,8: Lập bảng kết độ hòa tan theo thời gian loại thuố Tính giá trị F2 theo cơng thức: F2 = 50 x log{[1+(1/n)Σnt=1(Rt – Tt)2]-0.5 x100} Trong : Rt % hoà tan thuốc chứng thời điểm t Tt % hoà tan thuốc thử thời điểm t Nếu F2 ≥ 50 hai chế phẩm coi có độ hồ tan tương đương mơi trường - Môi trường pH 1,2 4,5: Lập bảng tính % lượng hồ tan trung bình sau chế phẩm thử chế phẩm đối chứng Kết độ hịa tan có tính chất tham khảo, không dùng để xem xét miễn thử TĐSH in vivo cho dạng bào chế 2.3 Thử tương đương sinh học in vivo 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu Thiết kế chéo, thuốc, giai đoạn, sau dùng - liều liên tục - Thử nghiệm 18 người, cho uống thuốc liên tục ngày, lấy mẫu máu vào ngày thứ Người tình nguyện bốc thăm ngẫu nhiên để xác định thứ tự phân nhóm Mỗi người tình nguyện uống loại thuốc Người uống thuốc A giai đoạn uống thuốc B giai đoạn ngược lại Thời gian nghỉ giai đoạn tuần Bảng : Kế hoạch uống thuốc lấy mẫu Giai đoan I Ngày thứ Thuốc A/B x x x x Lấy mẫu Thời gian nghỉ Từ ngày thứ – 13 Giai đoan II 14 15 16 17 Thuốc B/A x x x x Lấy mẫu x x x 18 x 19 x x 2.3.2 Người tình nguyện Tiêu chuẩn chấp nhận: - Tiêu chuẩn chung: nam giới khoẻ mạnh, tuổi 18 – 55 Chỉ số BMI cân nặng chiều cao phải khoảng từ 18 – 25kg/m2, theo cách tính chiều cao, cân nặng Metropolitan Index 1983 cho người lớn; - Đánh giá chung tình hình sức khoẻ, khám tổng quát tim mạch, tiêu hoá, thần kinh, chiều cao, cân nặng, huyết áp, nhịp thở, tất phải giới hạn bình thường; - Các số xét nghiệm máu phải giới hạn bình thường Xét nghiệm bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, hematocrit; Sinh hoá lâm sàng: AST(GOT), ALT(GPT), creatinine, glucose; - Xét nghiệm kháng thể HIV kháng nguyên viêm gan B phải âm tính Tiêu chuẩn loại trừ: - NTN nghiện ma tuý, rượu thuốc lá; - Người có rối loạn tim mạch, hơ hấp, thận, tiêu hóa, miễn dịch, huyết học, nội tiết, hệ thần kinh bệnh tâm thần ; - Người có giá trị xét nghiệm nằm ngồi khoảng bình thường ; - Người nghi ngờ có nhiễm HIV HbsAg (dương tính với phép thử nhanh) - Người có tiền sử dị ứng với omeprazol thuốc nhóm; - Người bị ốm vòng tuần trước uống thuốc giai đoạn I; - Người dùng loại thuốc gây cảm ứng ức chế chuyển hố thuốc gan vịng 28 ngày trước uống thuốc giai đoạn I; Qui trình kiểm tra NTN tuyển chọn: Tuyển chọn kiểm tra NTN theo tiêu vòng tuần trước bắt đầu uống thuốc giai đoạn Loại bỏ NTN phân tích, đánh giá: Khơng dùng mẫu NTN vào phân tích nếu: - NTN rút lui q trình nghiên cứu, khơng tham gia uống thuốc đủ ngày giai đoạn - Trong sau nghiên cứu, phát thấy NTN không tuân thủ qui định nghiên cứu - NTN bị nôn ỉa chảy vòng sau uống thuốc có phản ứng bất lợi nghiêm trọng uống thuốc lấy mẫu - Số mẫu máu lấy bị ≥ điểm Không dùng số liệu NTN vào tính thống kê nếu: Mất ≥ điểm lấy mẫu liên tiếp pha hấp thu xung quanh Tmax; 2.3.4 Uống thuốc lấy mẫu Quá trình lấy mẫu tuân thủ theo Hướng dẫn thực hành lâm sàng tốt (GCP) Liều dùng, cách dùng: giai đoạn, NTN uống viên 20mg thuốc thử thuốc đối chứng vào buổi sáng với 200ml nước tinh khiết, uống liên tục ngày vào cố định buổi sáng Hàng ngày, NTN tập trung uống thuốc vào đầu buổi sáng sở nghiên cứumẫu Nghiên cứu viên trực tiếp cho uống thuốc ghi chép phản ứng bất lợi (nếu có) Vào ngày lấy mẫu (ngày thứ 6), NTN tập trung khu vực lấy mẫu từ tối hôm trước Bữa tối trước ngày lấy mẫu máu, NTN ăn nhẹ ăn trước 10 đêm, nước uống theo nhu cầu Trước uống thuốc, NTN khám lâm sàng, kiểm tra huyết áp, tim mạch, nhịp thở để đảm bảo họ tình trạng khỏe mạnh Trong vịng trước sau uống thuốc, NTN không uống nước Bữa ăn thực sau uống thuốc Khẩu phần ăn qui định nhóm nghiên cứu đồng NTN Trong suốt thời gian tiến hành lấy máu, NTN uống nước tinh khiết, không uống sữa, nước chè, cà phê, coca loại nước tăng lực Lấy mẫu máu: Dùng kim vô khuẩn luồn vào tĩnh mạch cẳng tay NTN cố định cho khơng cản trở hoạt động bình thường cẳng tay Lấy máu bơm tiêm cho vào ống nghiệm có sẵn chất chống đông (EDTA, 10mg/ ống) Thời điểm lấy mẫu: 0h (ngay trước lúc uống thuốc) thời điểm 10’, 20’, 30’; 45’, 60’; 90’, 2h, 2h30; 3h; 3h30’; 4h; 5h; 6h; sau uống thuốc Mỗi lần lấy khoảng ml máu Lắc nhẹ – lần để chống đơng Ly tâm 3000 – 4000 vịng/ phút để tách lấy huyết tương sau lấy máu, sớm tốt Huyết tương bảo quản - 40°C tiến hành phân tích Có thể bảo quản mẫu chờ phân tích vịng 45 ngày Quá trình cho uống thuốc lấy mẫu máu thực phịng lấy mẫu có bác sĩ, y tá theo dõi chăm sóc y tế cho NTN 2.3.5 Phân tích xác định nồng độ thuốc huyết tương Qui trình phân tích: Áp dụng qui trình phân tích thẩm định với điều kiện sau Xử lý mẫu: Mẫu huyết tương để tan chảy nhiệt độ phòng trước phân tích Lấy 1ml mẫu huyết tương (chuẩn/ thử), thêm thể tích dung dịch chuẩn nội thích hợp (khoảng 50µl), 2ml dung dịch đệm* Borat pH 9,0, lắc Chiết hỗn hợp dung môi dicloromethan: isopropanol: n-hexan (15:2,5:2,5) Lắc trộn kỹ, tách lấy lớp dung môi, bốc thu cắn Hoà tan cắn pha động, lọc tiêm vào máy sắc ký Định lượng omeprazol: Xác định lượng omeprazol chiết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với điều kiện sau: - Cột: Cột RP18, 5µm, 250mm x 4,6 mm - Pha động: methanol: acetonitril: đệm* phosphat pH 7,2 (20 :50 :30), điều chỉnh tỷ lệ thích hợp cần - Tốc độ dòng: điều chỉnh tốc độ từ – ml/ phút theo thời gian để tách omeprazol khỏi pic tạp thời gian phân tích phù hợp - Detector: 302nm - Chuẩn nội: Albendazol * Dung dịch đệm pha theo dược điển Mỹ Điều chỉnh điều kiện phân tích cần để có đáp ứng tốt Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu trắng, mẫu thử theo điều kiện Ghi đáp ứng tính kết dựa nồng độ pha thực tế, thể tích dung mơi chiết đáp ứng thu Sắc ký đồ có giá trị để xem xét mẫu trắng khơng có pic có thời gian lưu quanh khu vực thời gian lưu mẫu chuẩn omeprazol chuẩn nội albendazol 2.3.6 Tính thống kê thơng số dược động học tương đương sinh học Tính thống kê xử lý số liệu thử nghiệm đơn liều Xác định thông số dược động học NTN theo nồng độ thuốc xác định thời điểm, bao gồm: - Nồng độ thuốc tối đa (Cmax): xác định trực tiếp giá trị đo - Diện tích đường cong (AUC0 – t; AUC0 – ∞): xác định phương pháp hình thang, = n −1 (C i + C i +1 ) × (t i +1 − t i ) i =0 [AUC ] t ∑ Với Ci nồng độ thuốc thời điểm lấy mẫu ti AUC0-∞ = AUC0-t + Cn/λz Với Cn nồng độ thuốc thời điểm lấy mẫu cuối λZ số tốc độ thải trừ - Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa (Tmax): xác định trực tiếp giá trị đo Tính thống kê đánh giá tương đương sinh học theo hướng dẫn qui định US - FDA: - Phân tích phương sai, xác định khoảng tin cậy 90% (CI) giá trị tỷ lệ LnCmax LnAUC0 – ∞ trung bình thuốc thử thuốc đối chứng: CI = ln( T MSE ) ± t ( ,1; N ' ) × R N Trong đó: T: Giá trị Cmax AUC0-∞ thuốc thử R: Giá trị Cmax AUC0-∞ thuốc chứng N’: Bậc tự sai số xác định ANOVA MSE: Trung bình bình phương sai số xác định ANOVA N: Tổng số NTN tham gia đánh giá TĐSH - So sánh giá trị Tmax tính theo phương pháp phân tích khơng tham số Wilcoxon (Wilcoxon signed – rank test) Giá trị Tmax thuốc thử thuốc chứng khác khơng có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) tổng thứ tự xếp hạng dương âm (sum of possitive/negative rank) lớn giá trị tra bảng với cỡ mẫu n (số lượng cặp Tmax thuốc thử thuốc chứng có sai khác) tương ứng Kết đánh giá Tmax mang tính chất thơng tin khơng để so sánh đánh giá TĐSH Hai chế phẩm tương đương sinh học khoảng tin cậy 90% tỷ lệ Cmax AUC0–∞ trung bình, tính thống kê cho giá trị chuyển đổi logarit thuốc thử so với thuốc đối chứng nằm khoảng 80 – 125 % 2.5 Hồ sơ, báo cáo - Ghi chép chi tiết điều kiện thử nghiệm, giá trị chuẩn bị dung dịch chuẩn, kết quả, sắc ký đồ đo Lưu vào hồ sơ gốc - Báo cáo kết cần ghi rõ điều kiện phân tích, thơng tin chất chuẩn, thiết bị số liệu tính tốn Sắc đồ phân tích mẫu chuẩn, trắng mẫu thử đưa vào báo cáo cần ... =====O===== BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NANG HELINZOLE (Omeprazol 20mg) THEO MƠ HÌNH ĐƠN LIỀU KẾT HỢP ĐA LIỀU Chủ nhiệm đề... gồm BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NANG HELINZOLE (Omeprazol 20mg) THEO MƠ HÌNH ĐƠN LIỀU KẾT HỢP ĐA LIỀU Chủ nhiệm đề... báo cáo gồ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học viên nang Helinzole (omeprazol 20mg) theo mơ hình đơn liều kết hợp đa liều Chủ nhiệm đề