Đang tải... (xem toàn văn)
Bài trình bày về "Các phương pháp phân tích acid amin trong thực phẩm"
1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC TIỂU LUẬN MÔN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ Đề Tài: “Các phương pháp phân tích acid amin trong thực phẩm” HVTH: Mang Tấn Phong GVHD: TS. Huỳnh Khánh Duy TP. HỒ CHÍ MINH – 12/201 2 Mục lục 1. Giới thiệu về acid amin 3 1.1. Thành phần và cấu tạo của amino acid 3 1.2. Màu sắc và mùi vị của amino acid 6 1.3. Tính tan của amino acid 6 1.4. Tính quang học của amino acid 6 1.5. Tính lưỡng cực của amino acid 7 2. Thu nhận amino acid 8 2.1. Tinh sạch protein trước khi thu nhận acid amin 8 2.2. Thu nhận acid amin bằng thủy phân protein 9 3. Các phương pháp phân tích amino acid trong thực phẩm 10 3.1. Sắc ký giấy 10 3.2. Sắc ký bản mỏng 12 3.3. Sắc ký khí 12 3.4. Phương pháp điện di 13 3.5. Phương pháp quang phổ khối 13 3.6. Phương pháp đồng vị 14 3.7. Phương pháp enzyme 14 3.8. Phương pháp vi sinh vật 14 4. Một vài phương pháp cụ thể 14 4.1. Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey) 14 4.2. Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong phân tích sắc kí với chất dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl 19 3 1. Giới thiệu về acid amin 1.1.Thành phần và cấu tạo của amino acid Amino acid là đơn vị cấu tạo protein. Amino acid là chất hữu cơ, phân tử có chứa nhóm: carboxyl (-COOH) và nhóm amino (-NH 2 ) gắn với carbon ở vị trí . Hầu hết amino acid thu nhận được khi thủy phân protein đều ở dạng L--amino acid. Như vậy các protein chỉ khác nhau ở mạch nhánh, hay còn gọi là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R). Dựa vào tính chất của gốc R các amino acid được chia làm 5 nhóm: Nhóm 1: gồm 7 amino acid có R không phân cực, kỵ nước: glycine, alanine, proline, valine, leucine, isoleucine và methionine. Nhóm 2: gồm 3 amino acid có gốc R chứa nhân thơm: phenylalanine, tyrosine tryptophan. 4 Nhóm 3: gồm 5 amino acid có gốc R phân cực, không tích điện: serine, threonine, cystein, aspargine và glutamine. Nhóm 4: gồm 3 amino acid có R tích điện dương: lysine, histidine và arginine. Nhóm 5: gồm 2 amino acid có gốc R tích điện âm: aspartate và glutamate Các amino acid thường gặp là những amino acid thường có mặt trong thành phần của các loại protein. Chúng có khoảng 20 loại và được thu nhận khi thủy phân protein. 5 Bảng 1.1: Các amino acid thường gặp Tên amino acid Tên amino acid theo danh pháp hóa học Tên viết tắt Ký hiệu Khối lượng (Mr – Dalton) Glycine -aminoacetic Gly G 75 Alanine -aminopropionic Ala A 89 Proline -pỉolidincarboxylic Pro P 115 Valine -aminoisovaleric Val V 117 Leucine -aminoisocaproic Leu L 131 Isoleucine -amino--metylvaleric Ile I 131 Methionine -amino--metyltiobutiric Met M 149 Phenylalanine -amino--phenylpropionic Phe F 165 Tyrosine -amino--hydrogengenxyphenylpropionic Tyr Y 181 Tryptophan -amino--indolylpropionic Trp W 204 Serine -amino--hydroxypropionic Ser S 105 Threonine -amino--hydrogengenxybutiric Thr T 119 Cysteine -amino--tiopropionic Cys C 121 Aspargine Amid của aspartate Asn B 132 Glutamine Amid của glutamate Gln Q 146 Lysine ,-diaminocaproic Lys K 146 Hystidine -amino--imidazolpropionic His H 155 Arginine -amino-guanidinvaleric Ảg R 174 Aspartate -aminosucinic Asp D 133 Glutamate -aminoglutarate Glu E 147 Trong phân tử protein có khoảng 20 loại amino acid, tuy nhiên trong cơ thể người và động vật không tổng hợp được tất cả các loại đó mà phải đưa từ ngoài vào qua thức ăn. Những amino acid phải đưa từ ngoài vào đó gọi là các amino acid không thay thế. Ngày nay người ta biết được có khoảng 8-10 loại amino acid không thay thế bao gồm: methionine, valine, leucine, isoleucine, theonine, phenylalanine, tryptophan, lysine, arginine và histidine. Ngoài các amino acid thường gặp ở trên, trong phân tử protein đôi khi còn có một số amino acid khác, đó là những loại ít gặp. Các amino acid này là dẫn xuất của những amino acid thường gặp như: trong phân tử colagen có chứa 4-hydrogenxyproline là dẫn xuất của proline, 5- hydrogenxylysine là dẫn xuất của lysine… Mặt khác, mặc dù không có trong cấu trúc protein, nhưng có hành trăm loại amino acid khác, chúng có thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết với hợp chất khác trong các mô và tế bào, chúng có thể là chất tiền thân hay là các sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa trong cơ thể. 6 1.2.Màu sắc và mùi vị của amino acid Các amino acid thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như glyxine, alanine, valine, serine histidine, triptophan; một số loại có vị đắng như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine. Bột ngọt hay còn gọi là mì chính là muối của natri với acid glutamic (monosodium glutamte). 1.3.Tính tan của amino acid Các amino acid thường dễ tan trong nước và khó tan trong alcohol, ether (trừ proline và hydrogenxyproline), chúng cũng dễ hòa tan trong acid và kiềm loãng (trừ tyrosine). 1.4.Tính quang học của amino acid Các amino acid trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ glycine) vì thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang trái. Quay phải được k. hiệu bằng dấu (+), quay trái được k. hiệu bằng dấu (-). Góc quay đặc hiệu của amino acid phụ thuộc vào pH của môi trường. Tuỳ theo sự sắp xếp trong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối mà các amino acid có cấu trúc dạng D hay L, gọi là đồng phân lập thể. Số đồng phân lập thể được tính theo 2 n (n là số carbon bất đối). Hình 1.1: Đồng phân lập thể của alanine Hầu hết các amino acid khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng (λ) khoảng từ 220 - 280 nm. Đặc biệt cùng nồng độ 10 -3 M, trong bước sóng khoảng 280 nm tryptophan hấp thụ ánh sáng cực tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ của tyrosine và phenylalanine là yếu nhất. Phần lớn các protein đều chứa tyrosine nên người ta sử dụng tính chất này để định lượng protein. 7 Hình 2: Phổ hấp thụ ánh sáng cực tím của tryptophan và tyrosine 1.5.Tính lưỡng cực của amino acid Trong phân tử amino acid có nhóm carboxyl -COOH nên có khả năng nhường proton (H + ) thể hiện tính acid, mặt khác có nhóm amin -NH2 nên có khả năng nhận proton nên thể hiện tính base. Vì vậy amino acid có tính chất lưỡng tính. Trong môi trường acid, amino acid ở dạng cation (tích điện dương), nếu tăng dần pH amino acid lần lượt nhường proton thứ nhất chuyển qua dạng lưỡng cực (trung hoà về điện), và tiếp tục tăng pH amino acid sẽ nhường proton thứ hai chuyển thành dạng anion (tích điện âm). V. vậy đôi khi người ta coi nó như một di-acid. Tương ứng với độ phân ly H + của các nhóm COOH và NH3 + có các trị số pK 1 và pK 2 . Từ đó người ta xác định được pI = (pK 1 + pK 2 )/2. Ví dụ: khi hoà tan glycine vào môi trường acid mạnh thì hầu như glycine đều ở dạng cation. Nếu tăng dần lượng kiềm, thu được đường cong chuẩn độ. Trên đường cong chuẩn độ thấy rằng: glycine lần lượt nhường 2 proton trước tiên chuyển sang dang lưỡng tính và sau cùng chuyển thành dạng anion. 8 2. Thu nhận amino acid 2.1.Tinh sạch protein trước khi thu nhận acid amin Phân tích acid amin của protein là một trong những phương pháp tốt nhất và chính xác nhất để định lượng protein. Sự cần thiết của việc thu nhận mẫu ở nồng độ cao và không bị nhiễm là một vấn đề cần giải quyết để xác định cấu tạo protein. Nhiều phương pháp hiện đại có thể loại bỏ chất đệm, muối ra khỏi protein như phương pháp kết tủa hoặc sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP- HPLC) gây thất thoát protein nhiều, làm việc đánh giá nồng độ thực trở nên khó khăn. Sau đây là ba phương pháp thường dùng để thu hổi protein từ chất đệm: phương pháp lọc gel, cột vi xoáy tốc độ cao và sự hấp thu vào màng poly vinylidene difluoride (PVDF) trong hộp chuẩn bị mẫu Prosorb. 2.1.1. Chuẩn bị cột macrospin (mẫu 50-150 µL) Cột macrospin cần được chuẩn bị cơ bản theo đề nghị của nhà sản xuất. Lắp cột nhẹ nhàng để thu hồi gel ở đáy cột. Hydrate hóa gel với 500 µL nước HPLC trong 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm cột trong 4 phút ở 2000 g để làm cân bằng cột. Rửa cột 3 lần với 500 µL nước để đảm bảo sự cân bằng. Thấm khô phần ngoài cột để loại ẩm và đặt nó vào một ống mới. Đối với cột macrospin, them 50-150 µL mẫu vào đỉnh, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột. Ly tâm ống 4 phút ở 2000 g, rửa cột với ít nhất 200 µL nước. Lấy mẫu đã tinh sạch và rút chân không ở tốc độ cao đến khô trước khi thủy phân. 2.1.2. Cột vi xoáy (mẫu 5-25 µL) Giống như đối với cột macro, rút gel khô đến đáy thùng. Làm ướt với 50 µL nước và ly tâm 3 phút ở 1000 g để cân bằng cột. Để có kết quả tốt nhất, rửa cột 3 lần với 200 µL nước. Để ly tâm những cột này, đặt chúng trực tiếp vào một máy ly tâm vi mô hoặc dùng một ống ly tâm rỗng 1.7 mL. Sau khi cột đã cân bằng, thám khô để loại bỏ ẩm bám bên ngoài cột. Thêm 5-25 µL mẫu vào đỉnh cột, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột. Đặt cột vào một ống mới, xoáy ống 3 phút ở 1000 g. Sau khi ly tâm, mẫu đã tinh sạch ở trong ống và sẵn sang để sử dụng. 2.1.3. Chuẩn bị hộp mẫu ProSorb Đảm bảo rằng mẫu đựng trong dung dịch 0.1 % trifluoroacetic acid (TFA) để đạt kết quả tốt nhất. Acetonitrile (CAN) với nồng độ hơn 15 % cản trở mẫu dính vào PFVD, vì vậy những phần của HPLC nên pha loãng với nước cất hoặc 0.1 % TFA để giảm nồng độ của ACN xuống nhỏ hơn 15 %). Nếu thể tích ít hơn 100 µL, pha loãng mẫu thành 100 µL với 0.1 % TFA. Nếu mẫu có chất tẩy, pha loãng để nồng độ chất tẩy thấp hơn giá trị trong bảng 1 vì chất tẩy có thể ảnh hưởng sâu sắc đến sự kết dính protein vào màng PVFD. Bảng 1 tóm tắt nồng độ của chất tẩy có thể chứa trong mẫu trước khi kết dính vào màng. Ngoài ra, nếu mẫu 9 chứa lượng chất tẩy lớn hơn lương tối đa trong bảng 2.1, có thể them một lượng nhỏ methanol vào mẫu trước khi cho mẫu vào hộp mẫu ProSorb). Bảng 2.1: Hàm lượng chất tẩy tối đa Chất tẩy Nồng độ tối đa (V/V hoặc W/V) Triton X-100 0.01 Tween-20 0.01 SDS 0.02 Octyl glucoside 0.25 Brij 35 0.02 Đặt thiết bị ProSorb vào một giá ống nghiệm thích hợp. Làm ướt màng PVDF trong hồ nhỏ với 10 µL methanol (hộp mẫu ProSorb nên được chuẩn bị kỹ như chỉ dẫn của nhà sản xuất, dùng nước MiliQ cho mọi bước làm sạch để giảm lượng acid amin còn sót lại). Cho mẫu vào hồ nhỏ (100 đến 400 µL thể tích), để cho mẫu chảy qua màng. Thao tác với mẫu nên cẩn thận vì protein và peptide có thể dính vào ống thủy tinh hoặc nhựa. Nếu mẫu nhỏ, có thể giảm thiểu tổn thất ở cartridge bằng cách cho 100 µL dung dịch đệm vào màng ướt trước khi cho mẫu vào. Mẫu có thể them trực tiếp vào dung dịch đệm. Đảm bảo rằng mẫu hồ nhỏ tiếp xúc hoàn toàn với chất hấp thụ và sự chuyển chất lỏng bắt đầu. Thêm những mẫu thửu thể tích nhỏ, nếu cần đổi chất hấp thụ sau mỗi 750 µL. Rửa màng với 100 µL 0.1 % TFA lần 2. Lấy mẫu và làm khô màng PVDF. 2.2.Thu nhận acid amin bằng thủy phân protein 2.2.1. Thủy phân bằng acid Để thu nhận acid amin, phương pháp thường được dùng nhất là thủy phân bằng dung dịch HCL 6N dư ở nhiệt độ 100-120 o C trong 24 giờ. Sản phẩm thu được chủ yếu là các acid amin dưới dạng tự do hydrogenclorate. Một số acid amin như serine và threonine bị phá hủy mọt phần, tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagines bị phân hủy thành acis glutamic, acid aspartic và NH 4 + . 2.2.2. Thủy phân bằng kiềm Người ta còn có thể thu nhận acid amin bằng phương pháp thủy phân với dung dịch NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ. Sản phẩm thu được hầu hết là các acid amin nhưng đều bị racemic hóa, các acid amin cysteine, serine, threonine bị phá hủy nhưng tryptophan không bị phá hủy. Vì vậy phương pháp thủy phân bằng kiềm thường chỉ dùng để xác định tryptophan. Thủy phân bằng enzyme 10 Để thu nhận chế phẩm acid amin, ngày nay việc thủy phân bằng enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau do việc sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm. Các enzyme thủy phân protein thành các acid amin hay các peptide có phân tử lượng thấp được gọi chung là peptidhydrogenlase. Có nhiều loại peptidhydrogenlase, chúng được phân biệt nhờ đặc hiệu khác nhau với liên kết peptide. Một số loại cắt đứt liên kết peptide ở đầu tận cùng của chuỗi polypeptide được gọi là exopeptidase như carboxypeptidase phân giải liên kết peptide đầu C tận cùng, aminopeptidase phân giải liên kết peptide đầu N tận cùng. Một số khác chỉ cắt đứt ở giữa chuỗi polypeptide được gọi là các endopeptidase như pepsin, tripsin… 3. Các phương pháp phân tích amino acid trong thực phẩm Đã từ lâu việc phân tích định tính và định lượng amino acid thường là sự kết hợp của nhiều phương pháp hoá lí và sắc ký. Có thể dựa vào phổ hấp phụ các amino acid không giống nhau để phân tích. Hoặc dựa vào cấu trúc của amino acid tự do sau khi chuỗi polypeptide đã bị thuỷ phân, có thể định lượng amino acid đầu N tận cùng bằng phản ứng Sanger hoặc Edman. Cũng như vậy, có thể xác định amino acid đầu C tận cùng nhờ phản ứng khử nhóm carboxyl với tác nhân khử NaBH, hoặc sử dụng enzyme carboxypepitdase… 3.1.Sắc ký giấy Trong đó: - a là khoảng cách chuyển dịch của chất phân tích - b là khoảng cách chuyển dịch của dung môi [...]... Phân tích acid amin với phương pháp phân tích sắc ký lỏng đảo pha và chiếu UV thường được sử dụng đối với những dụng cụ có độ nhạy cao và nhanh hơn nhiều so với phương pháp phân tích acid amin bằng phương pháp trao đổi ion chuyên dụng Dẫn xuất acid amin phenylthiocarbanyl (PTC) được sử dụng trong phân tích acid amin bằng phương pháp RP HPLC Đây là phương pháp tốt nhất cho phân tích những dẫn xuất acid. .. tích điện của các amino acid trong môi trường có pH nhất định Dưới tác dụng của điện trường các amino acid tích điện dương (+) sẽ chạy về phía cực (-), các amino acid tích điện âm (-) sẽ chạy về cực (+) Do khả năng tích điện không giống nhau trong điện trường giữa các amino acid vì vậy tốc độ di chuyển của các amino acid không giống nhau trong điện trường Kết quả các mino acid phân bố trải ra trên giá... acid cần được xác định trong nhiều mẫu của một loại thí nghiệm 3.7 .Phương pháp enzyme Có thể các định amino acid bằng phương pháp enzyme dựa trên nguyên tắc mỗi một loại enzyme có khả năng phân giải đặc hiệu một loại L-amino acid nhất định Xác định sản phẩm tạo thành sau phản ứng với enzyme tương ứng có thể biết được amino acid trong hỗn hợp 3.8 .Phương pháp vi sinh vật Một số vi khuẩn sinh trưởng trong. .. ổn định, có khả năng vay hơi cho phương pháp phân tích acid amin với RP HPLC và đầu dò UV Dẫn xuất sử dụng trong phương pháp phân tích này rất đa dạng, ngoài phương pháp PTC còn có OPA (dansyl, dabsyl, 4- nitro phenyl thiocarbonyl (NPTC)) Với những dẫn xuất OPA, những sản phẩm acid amin bậc 2 proline, hydro proline không thể phát hiện bởi vì OPA không phản ứng với acid amin bậc 2 khi có mặt những tác... đầu Phương pháp sắc ký giấy một chiều (có thể thuận hoặc nghịch) là phương pháp đơn giản nhất, chỉ dùng một hệ dung môi nào đó, khả năng phân tích kém hơn sắc ký hai chiều 11 Trong sắc ký thuận, hệ số vận tốc chuyển dịch Rf lớn, nhưng các vết màu thu được không gọn, còn trong sắc ký nghịch đại lượng Rf nhỏ hơn, nhưng vết màu lại gọn hơn Để định lượng các acid amin người ta thường sử dụng các phương pháp. .. được chỉ trong quá trình chạy sắc phổ riêng lẻ trong thuốc thử riêng 4.1.4 Chú ý Để phân tích acid amin khi acid này đóng vai trò là cơ chất hay sản phẩm trong phản ứng enzyme, việc tách protein từ acid nucleic là cần thiết Thêm dung dịch acid perchloric 4M vào dịch cô đặc cuối cùng nồng độ 1M và ủ trên đá trong ít nhất 15 phút Khi thêm cùng một thể tích dung dịch KOH 2M ở trạng thái lạnh, acid perchloric... độ phân giải cao là máy có khả năng tách được hai mảnh ion có khối lượng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối lượng 3.6 .Phương pháp đồng vị Nguyên tắc: dựa vào hoạt tính phóng xạ của amino acid cùng một loại đã đánh dấu để xác định vị trí và số lượng của amino acid đó trong chuỗi polypeptide Ứng dụng: xác định một hoặc một vài amino acid trong hỗn hợp có nhiều loại amino acid khác nhau, hay một amino... 4- aminobutanoate (-aminobutyrate) + CO2 Ở pH 5.5 tạo ra L-tyrosine carboxylyase (EC 4.1.1.25), EC 4.1.1.25 xúc tác chuyển hóa L-tyrosine →Tyramine + CO2 4 Một vài phương pháp cụ thể 4.1 .Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey) 4.1.1 Giới thiệu Việc tạo dẫn xuất của acid amin kèm theo việc phân. .. chất dẫn xuất acid amin BTC và PTC khi thủy phân toàn bộ quả trứng được chỉ ra trong hình 10 Do không may mắn, chúng tôi không phát hiện được chất dẫn xuất BZTC trong quả trứng thủy phân Thật đáng tiếc vì chúng tôi không thể so sánh 2 chất dẫn xuất BTC và PTC Các dạng giống nhau của 17 acid amin trong chất dẫn xuất BTC và PTC đều được phát hiện Như sắc phổ được chỉ ra trong các mẫu thực phẩm (hình 9... mốt vài lại chất nhiễm chứa trong đó đã gây ra các bóng mờ chồng lên các đỉnh Hiện tượng này đã chỉ ra rằng BITC, BZITC và PITC là những chất phản ứng rất tốt có sự chọn lọc cao hơn với acid amin 26 Hình 4.5: Sắc phổ của acid amin trong thủy phân đậu nành A: chất dẫn xuất BTC B: chất dẫn xuất BZTC C: chất dẫn xuất PTC 27 Hình 4.6: Phổ sắc ký của acid amin trong sản phẩm thủy phân trứng (A) dẫn xuất BTC . của amino acid 7 2. Thu nhận amino acid 8 2.1. Tinh sạch protein trước khi thu nhận acid amin 8 2.2. Thu nhận acid amin bằng thủy phân protein 9 3. Các phương pháp phân tích amino acid trong. lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong phân tích sắc kí với chất dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl 4.2.1. Giới thiệu Phân tích acid amin với phương pháp. KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC TIỂU LUẬN MÔN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ Đề Tài: Các phương pháp phân tích acid amin trong thực phẩm HVTH: Mang Tấn Phong GVHD: TS. Huỳnh