ViÖn Ch¨n nu«i B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi: X¸c ®Þnh sù sai kh¸c di truyÒn cña c¸c gièng gµ néi Cn®t: Lª ThÞ Thuý 8004 Hµ néi – 2010 1 MỤC LỤC MỤC LỤC 1  PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ 2  PHẦN II. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4  A. SƠ LƯỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 4 B. ĐẠI CƯƠNG VỀ PHÂN LOẠI HỌC PHÂN TỬ 6 PHẦN III. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17  A. CÁC CHỈ TIÊU THEO DÕI: 17 B. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN TRONG HỆ GEN 21 C. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN TRONG TY THỂ 26 PHẦN IV. NỘ I DUNG KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 30  PHẦN A . KHẢO SÁT TẠI THỰC ĐỊA, CẬP NHẬT VÀ XÂY DỰNG DỮ LIỆU VỀ SỰ PHÂN BỐ, ĐẶC ĐIỂM NGOẠI HÌNH, SINH TRƯỞNG PHÁT DỤC, KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CỦA 9 GIỐNG GÀ NỘI 31 1. Đặc điểm ngoại hình và các chiều đo cơ thể của các giống 32 2. Khối lượng 09 giống gà qua các tuần tuổi 39 3. Tiêu tốn thức ăn 43 4. Tỷ lệ nuôi sống 44 5. Khả năng sinh sản của các giống gà 46 6. Kết quả phân tích chất lượng thịt gà 49 PHẦN B. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TONG HỆ GEN VÀ XÂY D ỰNG CÂY KHOẢNG CÁCH DI TRUYỀN GIỮA CÁC GIỐNG GÀ NỘI. 52 1. Mục tiêu: 52 2. Nội dung công việc: 52 3. Kết quả và thảo luận 52 PHẦN C – PHÂN TÍCH ADN TRÊN TY THỂ GÀ 62 1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà 62 2. Xác định trình tự gen mã hoá cytocchrome B ở các mẫu gà 63 PHẦN D. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỪ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƯỢNG THỊT CỦA MỘT SỐ GIỐNG GÀ NỘI VÀ ĐĂNG KÝ TRÊN NGÂN HÀNG GEN QUỐC TẾ 86 1. Cơ sở xác định gen mã hóa IGF liên quan đến chất lượng thịt 86 2. Nhân, xác định trình tự đoạn gen mã hóa IGF1 liên quan đến chất lượng thịt gà 87 3. Xác định và phân tích trình tự gen mã hóa IGF-1 87 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 92  I. KẾT LUẬN 92 II. ĐỀ XUẤT 94 2 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95  PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo của FAO [56], khoảng 37 % tất cả các giống gia cầm của Asian (chiếm số lượng 18% toàn cầu) đang ở tình trạng nguy hiểm. FAO cũng lưu ý, con số trên là tiếng chuông cảnh báo về sự mất mát đa dạng di truyền các giống gia cầm và cần phải có những cố gắng nỗ lực kịp thời để ngăn chặn tình trạng đó. Một trong những nguyên nhân bị mất nguồn gen bản địa quý giá là do thiếu các thông tin về đặc điểm và các tính năng sản xuất, thiếu chương trình cải tạo giống hợp lý. Do nhận thấy vai trò của gia cầm bản địa hết sức quan trọng với dân sinh, Viện chăn nuôi Quốc tế -ILRI phối hợp với hệ thống nghiên cứu nông nghiệp Quốc gia-NARS đã triển khai chương trình nghiên cứu và phát triển gọi là HOPE-A và APHCA's thông qua việc bảo tồn và sử dụng b ền vững các giống gia cầm cần ưu tiên ở 12 nước Asian. Trong thập niên vừa qua, nghiên cứu gen động vật nói chung và gen gà nói riêng phát triển rất nhanh nhờ những thành tựu di truyền phân tử và chương trình giải mã gen người. Thập kỷ 90 bắt đầu bằng chương trình gen gà của EU, sau đó là các chương trình nghiên cứu gen gà của Nhật bản, Mỹ, Úc, Trung Quốc ra đời. Mục đích của chương trình nghiên cứu gen gà là để tìm ra chỉ thị di truyề n phân tử giúp chương trình khai thác và bảo tồn nguồn gen hiệu quả hơn, chính xác hơn. Theo David WB và đồng tác giả (2004) )[50] có khoảng từ 20.000-30.000 gen trên bộ nhiễm sắc thể của gà. Cho đến năm 2005 toàn bộ hệ gen của gà đã được giải trình tự, trong đó có 28/38 cặp nhiễm sắc thể thường (từ nhiễm sắc thế số 1 đến nhiếm sắc thể số 24, 26, 27, 28 , 32) và 2 nhiễm sắc thể giới tính W và Z đã được lập bản đồ gen và công bố trên ngân hàng gen Quốc tế NCBI (http://www.ebi.ac.uk/). Tổng số 12355 gen trong hệ gen gà kể cả gen trên nhiễm sắc thể giới tính cũng đã được phân tích. Bên cạnh đó 13 gen trên ty thể gồm: ND1, ND2, COX1, COX2, ATP8, ATP6, COX3, ND3, ND4L, ND4, ND 5 CYTB và ND6 cũng đã được xác định. Tuy diện tích lãnh thổ không lớn, nhưng Việt Nam là một trong số 15 quốc gia có đa dạng sinh học động vật cao vào bậc nhất trên thế giới. Mật độ gi ống vật nuôi địa phương của Việt Nam là 1,520 giống/km2, so với thế giới là 0,098 giống/km2. Đây là tiềm năng quan trọng trong việc giải quyết thực phẩm cho nhu cầu trong nước trước mắt cũng như trong tương lai. Tính đa dạng đặc biệt này đang phải đối mặt với nhiều đe doạ từ nền kinh tế thị trường và từ phía con người. Ngoài việc phá huỷ môi trường sinh sống, các hệ thống chăn nuôi thâm canh, nhập giống gà ngoại có năng suất cao, đầu tư lớn đã dẫn đến sự cạnh tranh khốc liệt với các giống gà bản địa địa tuy năng suất thấp nhưng thích nghi với điều kiện sinh thái khắc nghiệt, sức chống chịu bệnh tật và chất lượng thịt ngon, hợp khẩu vị của người Việt nam. Hi ện tại các giống gà bản địa địa mang các gen quý, đặc thù đang bị xói mòn và mất dần. 3 Việt Nam có nguồn gen gà bản địa rất phong phú với nhiều tên gọi theo đặc điểm ngoại hình, theo sự phân bố địa lý khác nhau: Gà Ri phân bố hầu hết trên cả nước, tập trung nhiều ở khu vực miền Bắc, gà Hồ tại vùng Bắc Ninh, gà Đông Tảo vùng Hưng Yên, gà Mía - Hà Tây, gà Ác ở Long An, gà H'mông ở vùng Hà Giang, Sơn La, gà Tre- Vùng ở miền Đông Nam bộ, gà Chọi phân bố trong cả nước, gà Tàu vàng chủ yếu khu vực phía Nam-Lê Viết Ly và cộng sự [16]. Trong quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo, thực chất các giống đã bị lai tạp, thoái hoá nhiều và được vận chuyển đi khắp các địa phương trong cả nước. Từ năm 1990 đã có nhiều công trình nghiên cứu về bảo tồn gen các giống gà bản địa thông qua phương pháp in-situ, nuôi giữ trong nông hộ với quần thể nhỏ, theo dõi các đặc điểm ngoại hình, tính năng sản xuất của một số giống gà bản địa. Đến năm 1997 đã có một số nghiên cứu của GS. Đặng Vũ Bình, Đại học NN I và GS.Amano, Đại học Nông nghiệp Tokyo về đa hình nhóm máu của một số giống gà bản địa Việt Nam: gà Ri, gà Hồ, gà Chọi. Tiếp theo sau là nghiên cứu của Lê Thị Thúy và cộng sự 1994 [30], Bùi Đức Lũng và cộng sự 2004 [15], Trần Thị Mai Phương, và đồng tác giả 2004 [23] về nuôi dưỡng, bảo tồn và phát triển giống gà Hmông, gà Hồ, nghiên cứu khả năng sinh sản, sinh trưởng và chất lượng thịt của giống gà Ác Việt Nam. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu một cách hệ thống để đánh giá chính xác sự sai khác, quan hệ di truyền giữa các giống, nguồn gốc các giống bằng công nghệ gen tại Việt Nam… Việc này sẽ làm giảm hiệu quả cho việc đầu tư vào công tác bảo tồn và sử dụng hợp lý nguồn gen gà bản địa. Từ năm 1999, Viện Chăn nuôi đã tiến hành nghiên cứu xác định đa hình ADN của một số động vật chăn nuôi thông qua đề tài cấp Bộ Nông nghiệp (1999-2000), đề tài cấp Nhà nước KC 04-03 (2001-2004). Đó là các công trình nghiên cứu về gen Halothan, nghiên cứu xác định giới tính, nghiên cứu các vùng gen điều khiển sự biểu hiện gen protein sữa bò, tỷ lệ nạc và số con sinh ra trên/lứa đẻ. Bước đầu đã xác định được các biến thể ADN liên quan khả năng tiết sữa cao, các gen liên quan đến tốc độ sinh trưởng, tỷ lệ nạc, số con đẻ ra/lứa của lợn. Đa số các nghiên cứu trong thời gian qua tại Việt Nam chủ yếu tập trung mô tả về đặc điểm ngoại hình, sinh trưởng phát dục và khả năng sinh sản của một số giống gà địa phương. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu thông qua kỹ thuật gen để xác định quan hệ di truyền giữa các giống cũng như nguồn gốc, phân loại các giống… Việc này làm giảm hiệu quả cho việc đầu tư vào công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng nguồn gen của các giống gà nội. Nghiên cứu: Xác định sự sai khác di truyền của các giống gà nội không những xác định được mối quan hệ di truyền giữa các giống, giúp cho khai thác và sử dụng hợp lý nguồn gen gà nội mà còn góp phần xác định nguồn gốc, sự thuần hóa và phân bố trong lịch sử phát triển so với các giống gà của các nước trong khu vực đông Nam á. MôC TI£U CñA §Ò TµI Xác định sự sai khác di truyền, góp phần khai thác và sử dụng hợp lý các giống gà bản địa 4 PHẦN II. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU A. SƠ LƯỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 1. Sơ lược về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà: Hiện nay, gà là một trong những vật nuôi phổ biến và được nuôi ở nhiều vùng trên toàn thế giới. Tuy nhiên nguồn gốc của gà nuôi hiện chưa được thống nhất và vẫn đang được tranh cãi giữa thuyết đơn nguyên và đa nguyên. Thuyết đơn nguyên được khởi xướng dựa trên các nghiên cứu của Darwin (1868), cho rằng gà nhà có chung một nguồn gốc và xuất phát từ giống Gallus. Trong giống này có 4 loài gà rừng khác nhau, phổ biến rộng rãi nhất là loài Gallus bankiva hay còn có tên là Gallus gallus, thường gặp ở rừng Đông Nam Á, Ấn Độ, Myanmar, Malaysia và vài nước khác. Loài Gallus lapayette lesson gặp ở vùng rừng Seilon và còn có tên gọi là gà rừng Seilon. Loài thứ ba là Gallus sonerati, còn gọi là gà rừng màu xám, thường gặp ở vùng rừng núi Ấn Độ. Một loài khác nữa là Gallus varius shaw, phổ biến ở Java nên còn gọi là gà rừng Java. Khi nghiên cứu nguồn gốc chung của gà nhà từ các loài này, Darwin đã khẳng định Gallus bankiva là tổ tiên chung nhất. Kết luận này càng được củng cố bởi nhiều đặc điểm tương đồng giữa giống Gallus và gà nhà về hình thái, cấu tạo giải phẫu các nội quan, về tiếng gáy cũng như tập tính hoạt động. Thuyết đa nguyên dựa trên những nghiên cứu gần đây về một số tính trạng của gà, cho rằng gà nhà ngày nay bắt nguồn từ các loại gà hoang khác nhau, một trong số đó là gà Gallus gallus. Tuy nhiên, thuyết này xuất phát từ những nguồn thông tin mới, do đó cần phải thẩm định rõ ràng. Theo nhiều tài liệu, gà rừng được thuần hoá và nuôi dưỡng tại Ấn Độ khoảng 3200 năm trước Công nguyên và tại Trung Quốc, Ai Cập khoảng 1400 năm trước Công nguyên. Ban đầu, gà được nuôi chủ yếu để chọi hơn là vì mục đích thực phẩm. Sau khi được đưa sang Châu Âu vào khoảng thế kỷ XVIII-XIX, nhờ tiến bộ của công tác chọn giố ng, các giống gà bản địa của Châu Á đã được lai tạo thành những giống cho năng suất cao hơn. Ở Việt Nam, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú , Hà Bắc, Hà Tây … Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của giống gà Ri hiện nay, nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà Đông Tảo … Theo Nguyễn Ân (1983)[3] và nhiều tác giả, trong hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại như sau: Giới Động vật (Animal) Ngành Động vật có xương sống (Chordata) Lớp Chim (Aves) Bộ Gà (Galliformes) 5 Họ Trĩ (Phasianidae) Giống Gallus Loài Gallus gallus Phân loài Gallus gallus domesticus 2. Sự phân bổ của 9 giống gà nghiên cứu: * Gà Ri: Gà Ri được nhân dân ta thuần dưỡng, nuôi phổ biến khắp các vùng miền và với phương thức chăn thả vì vậy màu sắc lông của chúng rất đa dạng, uy nhiên màu phổ biến ở gà mái là màu vàng sẫm hoặc vàng nhạt còn gà trống có màu đỏ tía * Gà Hồ: Gà Hồ có phân bố hẹp, chỉ còn ở thôn Lạc Thổ, huyện Thuận Thành, tỉnh Bắc Ninh. Gà Hồ được biết tới với tầm vóc cơ thể to lớn, gà tr ống dáng cao to. * Gà Đông Tảo: Gà Đông Tảo có phân bố hạn chế, chủ yếu được nuôi ở tại xã Đông Tảo, huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên. Gà Đông Tảo có tầm vóc cơ thể to lớn nhưng không cao như gà Hồ và gà Đông Tảo lại có vòng ống chân rất to và to hơn so với gà Hồ. * Gà Mía: Gà Mía có nguồn gốc từ xã Đường Lâm, thành phố Sơn Tây, Hà Nội. Giống gà này có sự đồng nhất về m ột số đặc điểm ngoại hình như con trống có thân hình to dài, lông chủ yếu có màu mận chín. * Gà Ác: Gà Ác có phân bố chủ yếu ở đồng bằng Nam Bộ, với vai trò như một loại dược liệu dùng làm thuốc bổ bồi dưỡng cho người ốm, phụ nữ mới sinh. Chân thường có lông và có 5 ngón chân. * Gà H’Mông: Gà H'Mông phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng núi phía Bắc (các tỉnh Tây Bắc). Chúng được người H’Mông thuần hóa và nuôi dưỡng từ lâu đời vì vậy có tên là gà H’Mông. Đặc điểm nổi bật ở gà H’Mông là da, thịt, xương có màu đen. * Gà Chọi: Gà Chọi có phân bố rộng ở khắp các vùng miền. Nhưng tập trung chủ yếu ở các khu đồng bằng và ven đô. Gà Chọi được nuôi phổ biến với mục đích giải trí là dùng để thi đấu nên gà có ngoại hình phù hợp với mục đích này là dáng thanh gọn nhưng kết cấu cơ thể chắc ch ắn. Chân gà Chọi có 4 ngón và cũng có màu rất đa dạng: vàng, chì, vàng tối, trắng. * Gà Tàu Vàng Gà Tàu Vàng cũng là một giống gà lâu đời của nước ta, giống gà này chủ yếu nuôi ở Miền Nam Gà Tàu Vàng phần lớn có lông màu vàng rơm, vàng sẫm, có đốm đen ở cổ, cánh và đuôi. Mào cờ, chân 4 ngón, mỏ vàng, chân vàng, da vàng và thịt trắng. * Gà Tre 6 Giống gà Tre cũng có nguồn gốc từ Nam Bộ, nhưng theo thời gian do đặc điểm ngoại hình đặc trưng nên hiện nay đã phân bổ rộng rãi trong cả nước. Gà Tre là một giống gà nhỏ con, con mái chân thấp, con trống chân cao hơn, ngoại hình luôn thể hiện được sự mạnh mẽ. B. ĐẠI CƯƠNG VỀ PHÂN LOẠI HỌC PHÂN TỬ 1. Định nghĩa phân loại phân tử: Phân loại phân tử (Molecular systematics) là sự phát hiện, mô tả và giải thích sự đa dạng sinh học ở cấp độ phân tử giữa các loài hoặc bên trong loài. Trong những thập kỷ sau của thế kỷ XX, nhờ sự phát triển nhanh chóng của sinh học phân tử, lĩnh vực phân loại học phân tử cũng đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Các công trình nghiên cứu, tiến hành trên các đối tượng động, thực vật và vi sinh vật, có ý nghĩa to lớn trong việc phân biệt, phát hiện những loài mới hay những loài được xác định là đã tuyệt chủng trong tự nhiên. 2. Các phương pháp nghiên cứu sử dụng trong phân loại phân tử: Phân loại phân tử quan tâm đến 3 vấn đề chính sau: - Nghiên cứu cấu trúc quần thể. - Nhận biết ranh giới giữa các loài. - Đánh giá mối liên quan tiến hoá và sự phát sinh chủng loại. Để giải quyết những vấn đề này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu gen hoặc nghiên cứu các sản phẩm của gen để đưa ra những kết luận cuối cùng. Thông thường, khi đối tượng là động vật, người ta sử dụng các gen ty thể hoặc gen nhân còn khi đối tượng là thực vật, người ta ưu tiên sử dụng các gen lục lạp và gen nhân. Hiện nay, các phương pháp trên đã được xây dựng khá hoàn chỉnh bao gồm các phương pháp chủ yếu sau đây: 2.1. Chỉ thị protein-enzyme: Phân tích isozyme Isozyme là những dạng khác nhau của một enzyme, có cùng hoạt tính đặc hiệu cơ chất nhưng khác biệt về cấu trúc bậc I của phân tử enzyme và do các locus gen khác nhau quy định. Sự khác biệt này được thể hiện khi điện di trên gel agarose, tinh bột hay polyacrylamide. Đa hình isozyme là mô hình thuận lợi cho việc nghiên cứu do bản chất di truyền đơn giản, không đòi hỏi phải biết kiểu gen của đối tượng nghiên cứu và tiết kiệm về mặt kinh tế. Song, vì các isozyme chỉ biểu hiện trong những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể, số lượng không nhiều và không phản ánh chính xác bản chất di truyền nên việc sử dụng chỉ thị isozyme trong phân loại phân tử gặp khá nhiều hạn chế. 2.2. Chỉ thị DNA: Các chỉ thị DNA dựa trên cơ sở tính đa hình DNA, tức là sự sai khác trong genome của các cá thể nghiên cứu. Người ta chia các chỉ thị DNA thành 3 loại chính: 7 - Chỉ thị dựa trên các trình tự nucleotide ngẫu nhiên: Đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD- Random Amplified Polymorphic DNAs). - Chỉ thị dựa trên các trình tự đơn lặp lại nhiều lần (vi vệ tinh): Các trình tự lặp lại đơn (SSR- Simple Sequence Repeats). - Chỉ thị dựa trên các trình tự nhận biết của các enzyme giới hạn, gồm có: Đa hình các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphism), Đa hình các đoạn cắt giới hạn được khuếch đại ngẫu nhiên (AFLP- Amplified Fragment Length Polymorphism). Các chỉ thị này đều có nền tảng là kỹ thuật nhân gen in vitro (PCR). Bên cạnh đó, người ta còn sử dụng các kỹ thuật lai DNA và phân tích trình tự DNA như là những chỉ thị cho phân loại phân tử.  PCR (Polymerase Chain Reaction) - kỹ thuật nền tảng: Kỹ thuật PCR (hay còn gọi là kỹ thuật nhân bản gen in vitro), do Kary Mullis và cs phát minh vào năm 1988, được xem là một phát minh có tính đột phá lớn, tạo ra một cuộc đại cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử. PCR được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu nhân dòng gen, các phân tích cận lâm sàng cũng như trong nghiên cứu phân loại học phân tử và có lẽ phải mất một thời gian dài nữa mới xuất hiện một phương pháp mới thay thế cho PCR. Nguyên tắc: Phản ứng PCR phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của enzyme DNA polymerase để nhân bản in vitro các đoạn gen lên hàng triệu lần qua một loạt các chu kỳ lặp lại. Tuy nhiên, do enzyme DNA polymerase hoạt động cần các mồi (primer) nên người ta phải biết được các trình tự nucleotide ở hai đầu DNA để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Trong điều kiện thích hợp và môi trường có chứa các nucleotide tự do, enzyme sẽ kéo dài đoạn mồi thành sợi bổ sung với sợi làm khuôn. Các giai đoạn: Phản ứng PCR g ồm một loạt chu kỳ lặp lại của ba giai đoạn cơ bản sau đây: Giai đoạn biến tính (denaturing): tách sợi DNA kép thành dạng sợi đơn.  Nhiệt độ: 94-95 o C  Thời gian: khoảng 1 phút Giai đoạn gắn mồi (annealing): cặp mồi gắn đặc hiệu với trình tự bổ sung trên DNA.  Nhiệt độ: tuỳ thuộc Tm của mồi  Thời gian: 20 giây đến 2 phút Giai đoạn kéo dài (extending): lắp các dNTP tự do để tạo thành chuỗi mới.  Nhiệt độ: 72 o C, sau khi bổ sung Taq polymerase 8  Thời gian: 30 giây đến vài phút, tuỳ thuộc chiều dài đoạn gen cần nhân lên. Hiện nay, kỹ thuật PCR đã được phát triển, cải tiến so với ban đầu. Người ta đưa vào thêm một số bước phụ như khởi động nóng (hot start) nhằm làm sợi DNA kép biến tính hoàn toàn, kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi ở chu kì cuối cùng và giữ mẫu ở 4 o C.  Kỹ thuật RAPD - PCR: Đây là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR, nguyên tắc là sử dụng những đoạn oligonucleotide ngẫu nhiên (dài khoảng 10 nucleotide) làm mồi cho phản ứng tổng hợp DNA. Nếu 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, khi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở cùng một điều kiện, sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích thước và số lượng như nhau. Khi xảy ra đột biến làm xuất hiện hoặc m ất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra các đoạn gen có kích thước, số lượng khác nhau giữa các cá thể. Sử dụng kỹ thuật RAPD có thể phát hiện được các đột biến, do đó kỹ thuật này có thể ứng dụng trong nhận dạng sinh vật, xác định các tính trạng khác nhau phục vụ công tác chọn giống vật nuôi và cây trồng.  Kỹ thuật SSR: Các trình tự lặp lại đơ n (SSR-Simple Sequence Repeats), hay còn gọi là DNA vi vệ tinh (microsatelite), là những đoạn trình tự ngắn, lặp lại nhiều lần tạo thành nhiều bản sao trong genome. Các đoạn trình tự này xuất hiện do sai sót trong quá trình tự sao DNA, sửa chữa hoặc tái tổ hợp gây ra bất thường trong cấu trúc không gian của phân tử DNA. Nếu các trình tự lặp xuất hiện trong vùng dịch mã thì sẽ tạo thành các amino acid lặp lại nhiều lần, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của protein. SSR cũng được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền và lần đầu tiên vào năm 1989 được Litt M. và Luty J. A. nghiên cứu trên đối tượng người. Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng: Ở người, trình tự lặp đơn giản là TG với tần số lặp khoảng 10-60 lần, tạo thành khoảng hơn 50000 bản sao phân bố khắp genome. Họ đã nhân trình tự SSR ở gen tổng hợp actin bằng PCR và xác đị nh được 12 alen trong 37 kiểu gen nghiên cứu.  Kỹ thuật RFLP: Kỹ thuật này lần đầu tiên được biết tới khi Botstein sử dụng để lập bản đồ các gen có liên quan đến bệnh ở người. Nguyên tắc: Các enzyme giới hạn loại 2 (Endonuclease) có khả năng nhận biết và phân cắt phân tử DNA tại những trình tự nucleotide nhất định, tạo thành các đoạn có chiều dài khác nhau. Số lượng các đoạn tuỳ thuộc vào số trình tự nhận biết trong genome. Khi nghiên cứu các đối tượng khác nhau, sự khác biệt về cấu trúc genome, điển hình là sự khác biệt về trình tự sắp xếp của các nucleotide dẫn đến việc thêm vào hoặc mất đi các điểm nhận biết của các enzyme giới hạn. Do đó, nếu sử dụng các enzyme giới hạn để phân cắt DNA của các đối tượng này, sau đó điện di ki ểm tra và lai Southern, ta sẽ thu được các phổ band riêng biệt, phản ánh sự sai khác về genome. Sự sai khác này gọi là sự đa hình. Các 9 phổ band được gọi là các “vân tay DNA” (DNA fingerprints) đặc trưng cho từng đối tượng. Hình 1. Mô hình các bước của kỹ thuật RFLP Kỹ thuật RFLP có thể phối hợp với kỹ thuật PCR để phát hiện những khác biệt trong genome. Thực tế trong nhiều trường hợp, sử dụng từng enzyme riêng lẻ không thể phát hiện sự khác nhau giữa các đối tượng, vì vậy phải phối hợp sử dụng nhiều enzyme mới cho kết quả. Kỹ thuật RFLP có thể ứng dụng trong nhiề u lĩnh vực khác nhau, có thể kể đến là trong nghiên cứu đa hình di truyền, nhận biết, chẩn đoán sớm các bệnh di truyền…  Kỹ thuật AFLP: Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, được Zebeau và Vos phát minh vào năm 1993, sau đó tiếp tục được Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) hoàn thiện. Đây là một bước phát triển cao hơn của kỹ thuật RFLP, cũng dựa trên nền tảng PCR, sử dụng các mồi đặc biệt được thiết kế sẵn để nhân bản có chọn lọc các đoạn DNA được cắt giới hạn từ genome của đối tượng nghiên cứu. Các đoạn DNA được nhân bản có độ dài khoảng 60-500 bp. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá độ đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao.  Kỹ thuật Microsatellite [...]... s sai khỏc rừ rt, c bit khi so sỏnh trỡnh t genome ty th cỏc taxon bc b tr lờn Bờn cnh ú, phõn t mtDNA cũn cú c c im n bi, khụng tỏi t hp ,di truyn theo dũng m v tc tin hoỏ nhanh hn 5 ln so vi cỏc gen nhõn, do ú mtDNA cú th c s dng nh mt du hiu nhn bit cỏc sai khỏc di truyn Nm 1990, trỡnh t genome mtDNA ln u tiờn c cụng b trờn i tng g Leghorn trng bi cỏc tỏc gi Desjardins v Morais MtDNA cú chiu di. .. quan sỏt trc tip v chp nh - Tin hnh o kớch thc cỏc chiu c th khi xỏc nh chớnh xỏc tui g o Di lng: o t t xng sng c cui cựng n t sng uụi u tiờn o Di ln: t u xng li hỏi n ht xng li hỏi o Vũng ngc: o mt vũng quanh ngc, sỏt nỏch g o Di cỏnh: t mm xng b vai n u mỳt xng cỏnh o Di ựi: t khp khuu n khp ựi gn vi xng chu o Di chõn: t khp khuu n sỏt bn chõn o Vũng ng chõn: o mt vũng quanh ng chõn, sỏt ni cỏc ngún... trựng in di DNA trờn gel agarose - Chun b gel agarose: Cõn 0,8 g agarose trong 100 ml dung dch m TAE 1X, un sụi agarose tan, ngui ri vo khuụn in di ó ci sn rng lc Sau khi gel ó ụng, t bn gel vo b in di - Trn mt lng mu thớch hp vi 3 àl hn hp mu (glycerol 20%; Tris-HCl 0,1% pH 8,0; EDTA 0,01M pH 8,0), sau ú tra vo cỏc ging trờn bn gel Tin hnh in di vi dũng in mt chiu cú hiu in th 110V - Sau khi in di, ... y ca cỏc nhúm ngi Australia, New Guinea, Chõu Phi, n , Chõu u, Chõu , Melanesia v Polynesia S a dng di truyn trong trỡnh t nucleotide ngi Australia rt cao v khỏ tng ng vi ngi Chõu Kt qu ny ch ra, dõn bn 15 a Australia c hỡnh thnh khong 40-70 nghỡn nm trc, do s di c ca cỏc nhúm ngi nh qua thi gian di Nm 2003, S Moulin v cng s ó s dng 800 bp ca on D-loop v 400 bp ca gen cyt b nghiờn cu s phỏt sinh... ca cỏc cỏ th ỏnh giỏ c trờn gel polyacryamide T kt qu chy trờn gel in di chỳng ta cú th ỏnh giỏ c hai ch th di truyn ca cỏc cỏ th Mi cỏ th u nhn mt on nucleotide lp li t b v mt on t m ( cỏc cỏ th ch thy mt bng trờn gel in di thỡ õy l bng chung ca c b v m) Microsatellite c s dng so sỏnh bn di truyn v h gen ngay t thi im nú c s dng nghiờn cu Th nht, cỏc trỡnh t microsatellite c bit n l cỏc on gen... Ethanol 100% v 70% Nc kh ion vụ trựng Agarose Dung dch m TAE dựng chy in di Ethidium bromide Hoỏ cht dựng cho phn ng PCR (Buffer, MgCl2, dNTPs, enzyme ) Cp mi: + H1255: 5- CAT CTT GGC ATC TTC AGT GCC -3 5- AGG ACT ACG GCT TGA AAG C -3 + L16725: - Kit Wizard SV gel and PCR Clean up System ca hóng Promega: + Dung dch MBS (Membrane Binding Solution) + Dung dch MWS (Membrane Wash Solution) cú b sung ethanol... bp v tng di khụng quỏ 100 bp vớ d nh (CA)n, (GAA)m (Diethard Tautz, Manfred Renz, 1984) Microsatellite cú th tỡm thy tt c mi ni trong h genome, bao gm c vựng mó hoỏ v khụng mó hoỏ (Toth v cng s, 2000) [115] S dng k thut PCR phỏt hin s ln lp li trong h gen ng vt v s a alen trong t nhiờn S lng n v lp li trờn mi locus ca cỏc cỏ th ỏnh giỏ c trờn gel polyacryamide T kt qu chy trờn gel in di chỳng ta... Bng 8 Chu trỡnh nhit ca phn ng PCR Cỏc bc Khi ng núng o Bin tớnh o Gn mi o Kộo di n nh Gi mu Nhit 95 95 50 72 72 4o Thi gian 4 1 110 120 10 S chu k 1 35 o o 1 Tinh sch sn phm DNA in di ton b sn phm PCR trờn gel agarose 0,8%, sau ú tin hnh ct gel trờn mỏy soi DNA, thu ly cỏc vch DNA c hiu Thờm 10 àl dung dch MBS (Membrane Binding Solution) i vi 10 mg gel v hn hp 60-650C gel tan hon ton Hỳt dch gel... 10000 rpm, 10 phỳt ra ta Lm khụ ta DNA v thờm 10 àl Hi_DiTM Formamide lm tan ta v bin tớnh trong 5 phỳt 95oC Sau ú cỏc mu c xỏc nh trỡnh t bng mỏy xỏc nh trỡnh t t ng ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer Cỏc mu c in di trong cỏc vi mao qun 80 cm x 50 àm S dng cỏc phn mm ABI PRISMTM 3100 Data collection v2.0, DNA Sequencing Analysis, SeqScape v BioEdit x lý s liu 3 Phng phỏp phõn tớch thng kờ Thụng s... d hp t quan sỏt c l cao nht (75.91%), tip theo l phng 10 phỏp RAPD (26.32%), cui cựng l phng phỏp phõn tớch allozyme (22.09%) Qua cụng b ny cho thy vic s dng microsatellite ỏnh giỏ s a dng di truyn, mi quan h di truyn ca qun th cng nh gia cỏc qun th l phự hp nht Nhỡn chung, mi phng phỏp u cú nhng u, nhc im, khụng ging nhau nhng cú th b sung cho nhau Do ú trong nghiờn cu, nờn phi hp cỏc phng phỏp . thác và sử dụng nguồn gen của các giống gà nội. Nghiên cứu: Xác định sự sai khác di truyền của các giống gà nội không những xác định được mối quan hệ di truyền giữa các giống, giúp cho khai thác. tích 23 dòng gà cao sản của các giống gà Leghorn, gà rừng, gà Fayoumi và gà Tây Ban Nha. Từ đó tính được được khoảng cách di truyền giữa gà rừng với các dòng gà khác. Wimmers và cộng sự (2000). gà nội mà còn góp phần xác định nguồn gốc, sự thuần hóa và phân bố trong lịch sử phát triển so với các giống gà của các nước trong khu vực đông Nam á. MôC TI£U CñA §Ò TµI Xác định sự sai khác