Viện Công nghệ sinh học BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NHÁNH KC10-10/06-10/02 NGHIÊN CỨU GIÁM ĐỊNH PHÂN TỬ VÀ CHẨN ĐOÁN LOÀI MẠT D. PTERONYSSINUS TẠI VIỆT NAM VÀ ĐỊNH KỲ KIỂM NGHIỆM GIỐNG ĐỂ NUÔI CẤY TẠO NGUỒN DỊ NGUYÊN THUẦN KHIẾT Chủ nhiệm đề tài nhánh: PGS.TS Lê Thanh Hòa Thời gian thực hiện: 01/01/2007 - 28/02/2009 7598-2 20/01/2010 HÀ NỘI-2009 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, vấn đề dị ứng (hen phế quản, viêm mũi dị ứng…) là bệnh có tính chất phổ biến trong xã hội, gây ra bởi môi trường bị ô nhiễm và/hoặc do vi sinh vật. Đặc biệt, dị ứng do các loài mạt Dermatophagoides pteronyssinus (D. pteronyssinus) và Dermatophagoides farinae (D. farinae) là vấn đề bệnh mang tính chất toàn cầu. Dị nguyên (kháng nguyên gây dị ứng) của D. pteronyssinus và D. farinae thường có mặt trong bụi nhà, do hai loài mạt này sống và sản sinh ra trong đó, gây nên các triệu chứng bệnh lý dị ứng: hen phế quản, viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc và nhiều biểu hiện bệnh lý khác. Việc sử dụng miễn dịch học liệu pháp đặc hiệu (immunotherapy) bằng dị nguyên D. pteronyssinus và D. farinae trong điều trị, nhằm mục đích làm giảm thiểu số lượng bệnh nhân mắc các bệnh dị ứng, ngăn ngừa sự gây m ẫn cảm ở những bệnh nhân mới, tiến tới ngăn ngừa sự tiến triển xấu đi của các bệnh dị ứng đang được ứng dụng rộng rãi. Điều kiện mang tính quyết định trong miễn dịch học liệu pháp đặc hiệu bằng dị nguyên là dị nguyên phải được chiết xuất từ chính các loài mạt gây dị ứng cho bệnh nhân đã được giám định loài. Vấn đề này hiện nay chưa được nghiên cứu giám định một cách chính xác giữa các loài mạt có trong bụi nhà ở các vùng địa lý khác nhau, trong đó có Việt Nam. Cho đến nay, việc phân biệt và giám định các loài mạt có trong bụi nhà và giống nuôi cấy sản xuất dị nguyên, chủ yếu dựa trên phương pháp hình thái học. Tuy nhiên, phương pháp này không cho phép xác định chính xác sự đa dạng tiến hoá của các loài mạt và loài chủ yếu gây dị ứng có trong quần thể. Mặt khác, giám định phân loại các loài mạt bằng kĩ thuật sinh học phân tử vẫn còn rất hạn chế, mặc dù đã được ứng dụng chẩn đoán, giám định đối với nhiều loài sinh vật như: ký sinh trùng gây bệnh, vi khuẩn, virus với độ chính xác cao. Việc giám định loài D. pteronyssinus và D. farinae bằng phương pháp giám định gen (hay còn gọi là giám định phân tử) là những nội dung mới, quan trọng trong nghiên cứu tạo ra sản phẩm đơn loài hay đa loài, giúp cho việ c điều trị các bệnh di ứng bằng miễn dịch học liệu pháp nhằm hạn chế các bệnh này một cách có hiệu quả. Trong hơn một thập kỷ qua, phương pháp giám định loài sinh vật dựa trên đặc điểm phân tử ADN đã phát triển và đang được sử dụng rộng rãi. Thực chất của phương pháp phân loại này là dựa vào các đặc điểm kiểu gen (genotype) thay vì sử dụng ki ểu hình (phenotype) trong phương pháp phân loại hình thái học, với ưu điểm là cần ít mẫu vật, không phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển cá thể của sinh vật, có độ chính xác cao rất phù hợp cho việc phát hiện và định loại các loài sinh vật. Hiện nay, có nhiều chỉ thị phân tử (của các gen hay tổ hợp gen) đang được sử dụng trong việc giám định loài, đây là các gen hay tổ hợp gen có tính bảo tồn cao và chỉ thị được chọn là đặc trưng cho loài sinh vật. Đối với hệ gen ty thể (mitochondrial genome), các chỉ thị chọn lọc là các gen: cox1 (cytochrome oxidase c subunit 1), gen ARN 2 ribosome 12S (12S rARN), gen ARN ribosome 16S (16S rARN); đối với hệ gen nhân (nuclear genome), các chỉ thị chọn lọc là các tổ hợp vùng giao gen là ITS-1 và ITS-2 (internal transcribed spacer 1 and 2). Việc sử dụng đơn phương mỗi loại hoặc kết hợp các chỉ thị hệ gen ty thể với nhau hoặc/và với chỉ thị hệ gen nhân tế bào để tăng thêm mức độ chính xác trong việc giám định đã được ứng dụng trong chẩn đoán, giám định và phân tích phả hệ các loài sinh vật. Trong giai đ oạn 2007-2009, để góp phần cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền học và xây dựng mô hình phân loại chính xác các loài mạt gây dị ứng, chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu và sử dụng các chỉ thị di truyền ADN hệ gen ty thể (12S, cox1) và ITS-2 để giám định loài mạt sản xuất dị nguyên tại Việt Nam và xây dựng qui trình giám định và qui trình chẩn đoán. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài nhánh cấp Nhà nướ c KC10-10/06- 10/02: “Nghiên cứu giám định phân tử và chẩn đoán loài mạt D. pteronyssinus tại Việt Nam và định kỳ kiểm nghiệm giống để nuôi cấy tạo nguồn dị nguyên thuần khiết” do PGS.TS Lê Thanh Hoà chủ nhiệm (2007-2009) (Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học), thuộc khuôn khổ đề tài Nhà nước KC10-10/06-10: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin chống dị ứng từ mạt bụi nhà acarien Dematophagoides pteronyssinus để ứng dụng trong ch ẩn đoán, điều trị một số bệnh dị ứng: Hen phế quản, Viêm mũi dị ứng, Viêm kết mạc” do GS.TSKH Vũ Thị Minh Thục chủ nhiệm (Viện Tai-Mũi-Họng) và Viện Vacxin cơ sở II Đà Lạt chủ trì. Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài với mục tiêu: Giải mã và so sánh biến đổi thành phần gen 12S và cox1 của mạt gây dị ứng thuộc giố ng Dermatophagoides (Dermatophagoides pteronyssinus và Dermatophagoides farinae, mẫu của Mỹ) và chẩn đoán giám định loài mạt gây dị ứng tại Việt Nam, từ đó xây dựng qui trình giám định và qui trình chẩn đoán mạt bụi nhà D. pteronyssinus tại Việt Nam. Các nội dung đặt ra để thực hiện, như sau: 1 – Giải trình trình tự một đoạn gen 12S, cox1 của mẫu chuẩn D. pteronyssinus và D. farinae có nguồn gốc từ Mỹ. 2 – Giải trình tự một đoạn gen 12S, cox1 của các mẫu mạt thu tại Việt Nam để định loại và xây dựng phương pháp chẩn đoán giám định phân tử. 3 - Phân tích trình tự nucleotide của các gen thu nhận từ các mẫu mạt Dermatophagoides spp nghiên cứu, so sánh với trình tự tương ứng của các loài mạt khác nhau trên thế giới. 4 – Khảo sát giá trị ứng dụng chỉ thị phân tử của gen 12S và cox1 trong phân tích và giám định các loài mạt. 5- Xây dựng qui trình giám đị nh gen mạt bụi nhà D. pteronyssinus của Việt Nam có được qui trình và kit xét nghiệm phân tử D. pteronyssinus và D. farinae. 3 6- Xây dựng qui trình chẩn đoán phân tử mạt bụi nhà D. pteronyssinus của Việt Nam, có được qui trình chi tiết các bước tiến hành thực hiện chẩn đoán phân tử D. pteronyssinus và D. farinae thực hiện được tại Việt Nam. 7- Trên cơ sở qui trình chẩn đoán, giám định, định kỳ thực hiện kiểm nghiệm giống mạt theo lô để nuôi cấy tạo nguồn dị nguyên thuần khiết. 8- Góp phần đào tạo nghiên cứ u viên và sau đại học. Sau khi hoàn thành nghiên cứu, sản phẩm đề tài nhánh được đặt ra là xây dựng qui trình giám định và chẩn đoán phân tử loài mạt bụi nhà nuôi cấy của Việt Nam, như sau: 1. QUI TRÌNH GIÁM ĐỊNH GEN MẠT BỤI NHÀ DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS 2. QUI TRÌNH CHẨN ĐOÁN SINH HỌC PHÂN TỬ MẠT BỤI NHÀ DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS Đề tài được thực hiện chủ yếu tại Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KC10-10/06-10/02 Họ và tên Chức danh/Cơ quan Trách nhiệm trong trong đề tài Nhiệm vụ chính Lê Thanh Hòa PGS, TS, NCVC Phòng Miễn dịch học Chủ nhiệm đề tài nhánh Chỉ đạo công việc, thiết kế mồi, phân tích chuỗi gen, xây dựng qui trình Nguyễn Thị Bích Nga ThS, NCV Phòng Miễn dịch học Tham gia Thực hiện PCR, giải trình tự, định kỳ kiểm tra giống Nguyễn Thị Tuyết Nhung ThS, NCV Phòng Miễn dịch học Tham gia Tách ADN tổng số; thực hiện PCR, giải trình tự Hoàng Thị Minh Châu ThS, NCV Phòng Miễn dịch học Tham gia Thực hiện một số công đoạn đề tài, quản lý kinh phí, viết báo cáo Vũ Thị Tiến CN, NCV Phòng Miễn dịch học Tham gia Thực hiện PCR, giải trình tự, xây dựng kit sinh học phân tử Vũ Đức Anh* CN (Trường ĐH KH Tự nhiên Hà Nội, cao học năm 2008) Tham gia Các công đoạn của đề tài và viết luận văn Hoàng Văn Mạnh* CN (Trường ĐH KH Tự nhiên Thái Nguyên, cao học năm 2008-2009) Tham gia Các công đoạn của đề tài và viết luận văn *Hợp đồng tạm thời 4 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về bệnh dị ứng Dị ứng (hay còn gọi là quá mẫn) là những tổn thương hoặc những hiện tượng bệnh lý xảy ra trong quá trình tương tác giữa các thành phần của đáp ứng miễn dịch và các kháng nguyên đặc hiệu. Dựa vào đặc điểm biểu hiện của hiện tượng quá mẫn và bản chất của các thành phần đáp ứng miễn dịch, người ta chia quá mẫn thành 4 týp chính: i) Týp 1: Quá mẫn tức thì; ii) Týp 2: Quá mẫn làm tan tế bào bởi kháng thể và bổ thể; iii) Týp 3: Quá mẫn do phức hợp miễn dịch hay bệnh phức hợp miễn dịch; iv) Týp 4: Quá mẫn muộn. Một trong những nguyên nhân phổ biến gây ra bệnh dị ứng được xác định là dị nguyên của sinh vật có trong bụi nhà (kháng nguyên gây dị ứng có mặt trong bụi nhà), trong đó dị nguyên của mạ t có trong thành phần bụi nhà, đặc biệt là loài D. pteronyssinus và D. farinae đã và đang được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu (Tilak và Jogdand, 1989; Fleming, 1999; Teplitsky và cs, 2008). Hàng loạt công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng sự có mặt của các loài mạt đặc biệt là D. pteronyssinus và D. farinae trong thành phần của bụi nhà có tính chất quyết định hoạt tính kháng nguyên gây ra dị ứng (Chew và cs, 1995; Malainual và cs, 1995; Suarez- Martinez và cs, 2005; Cevit và cs, 2007; Teplitsky và cs, 2008). Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nắng, nóng và có độ ẩm cao. Đây là đi ều kiện thuận lợi cho mạt phát triển, đặc biệt đối với loài D. pteronyssinus và D. farinae, nguyên nhân chủ yếu gây ra bệnh lý miễn dịch dị ứng trên thế giới và có thể chúng cũng là (các) loài gây bệnh dị ứng ở nước ta (Đoàn Thị Thanh Hà, 2002; Phạm Quang Chinh, 2004). Do đó, việc nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử để ứng dụng cho giám định chính xác loài mạt D. pteronyssinus, D. farinae, nuôi cấy, tách chiết và nghiên cứu các đặc tính sinh h ọc của dị nguyên mạt D. pteronyssinus và D. farinae, giúp cho việc chẩn đoán và điều trị hiệu quả các bệnh dị ứng là một yêu cầu cấp thiết và có ý nghĩa khoa học (Vũ Thị Minh Thục, 1995; Phạm Quang Chinh và cs, 2003). 1.2. Đặc điểm sinh học các loài mạt Dermatophagoides spp 1.2.1. Đặc điểm hình thái học Mạt D. pteronyssinus và D. farinae có dạng hình oval. Mạt D. pteronyssinus không phân chia thành các phần đầu, ngực, bụng rõ ràng nh ư các côn trùng khác mà đầu - ngực và bụng hợp thành một khối duy nhất gồm: thể hàm, phần thân và các cấu tạo khác (vỏ, chân, hậu môn và cơ quan sinh sản) (Lyon, 1991) (Hình 1.1). Mạt gây dị ứng (hen phế quản, viêm mũi dị ứng) có trong bụi nhà và đồ dùng gia đình là một loại động vật vi chân đốt (microathropods), có kích thước khoảng 250-300 µm, hiện 5 nay được phân loại thuộc ngành Chân khớp (Arthropoda), bộ Acariformes, lớp Nhện (Arachnida) (Suarez-Martinez và cs, 2005). Mạt thuộc bốn họ (Pyroglyphidae, Glycyphagoidea, Acaridae, và Echimyopodidae) là thành phần thường xuyên trong bụi nhà, chăn chiếu, dụng cụ gia đình, có sản phẩm trao đổi chất là dị nguyên gây dị ứng phổ biến trong xã hội. Mạt nhà, trong đó đặc biệt là hai loài Dermatophagoides pteronyssinus Trouessart 1897 (Dp) và Dermatophagoides farinae Hughes (Df), thuộc họ Pyroglyphidae, có vai trò chính gây dị ứng đối với cộng đồ ng trên toàn thế giới (Fleming, 1999; Suarez-Martinez và cs, 2005). Hình 1.1. Mạt D. pteronyssinus (A) và D. farinae (B). (Nguồn: http://www.slate.com/id/2189856/ ; http://2.bp.blogspot.com/) Về hình thái học, mạt có cấu tạo bao gồm: i) Thể hàm: Gồm có miệng và bộ phận phụ, đó là các chân xúc giác phát triển nhiều hoặc ít tuỳ theo từng loài, mà các kìm (đầu chân) có chức năng cầm, nắm hoặc gộp lại với miệng thành vòi hút hay vòi trích (châm đốt); ii) Phần thân: Có hình oval, lông ở phần hông nhiều hơn phân lưng và bụng, độ dài và hình dạng lông thay đổi tuỳ theo loài; phần ngực mang hai cặp chân trước; phần thân gi ữa mang hai cặp chân sau; phần thân sau: không chân có hậu môn (Hình 1.1); iii) Các cấu tạo khác: gồm Vỏ (hay còn gọi là da): có nhiều kiểu khác nhau trơn hoặc có nếp nhăn; mềm, mịn hoặc cứng, da có chức năng trao đổi nước và hô hấp; Chân: Con trưởng thành có 8 chân, gồm nhiều đốt, các lông ở chân đóng vai trò cơ quan xúc giác và được dùng để xác định loài theo phương pháp phân loại hình thái học; Hậu môn và cơ quan sinh sản: Phần dưới cùng của thân phía mặt bụng là hậu môn, cơ quan sinh sản nằm giữa các chân sau, phân biệt giữa con đực và cái ở hình dạng ngoài của cơ quan này, con cái đẻ trứng, trứng phát triển thành ấu trùng, sau đó thành mạt trưởng thành gây bệnh (Lyon, 1991). 1.2.2. Tên gọi, phân loại và phân bố Dermatophagoides pteronyssinus và Dermatophagoides farinae thuộc Ngành Chân Khớp (Arthropoda), Lớp Nhện (Arachnida), Bộ Acarina, Họ Pryoglyphidae, Giống Dermatophagoides (Hình 1.2). Nghiên cứu về sự phân bố của các loài mạt có trong bụi nhà đã phát hiện trên 130 loài mạt thuộc 27 họ, trong đó D. pteronyssinus là ABAB 6 loài mạt phổ biến nhất, chiếm từ 70%- 98% tổng số mạt phát hiện được, phần lớn số còn lại đều ít gặp (Suarez-Martinez và cs, 2005). Sự phân bố của các loài mạt phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau: mùa, vị trí địa lí, đặc điểm khí hậu, điều kiện xã hội và sinh hoạt (Fleming và cs, 1999). Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố cho thấy, ở các nước châu Âu chủ yếu gặp các loài m ạt thuộc họ Pyroglyphidae. Đặc biệt, mạt thuộc họ này được phát hiện trong 100% các mẫu bụi nghiên cứu ở Hà Lan và ở Italia là 73%. Cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu được công bố về sự phân loại chính xác của các loài mạt này trong bụi nhà, tuy đã có một số nghiên cứu nuôi cấy, tách chiết dị nguyên và khảo sát đặc tính sinh hoá học miễn dịch dị nguyên của loài mạt phân lập tại Việt Nam (Đ oàn Thị Thanh Hà, 2002; Phạm Quang Chinh và cs, 2003; Phạm Quang Chinh, 2004). ARTHROPODA PROARTHROPODA EUARTHROPODA TRILOBITIFORMA CHELICERATA MANDIBULATA Crustaceans Myriapoda Insects ARACHNIDA ARANEAE SCORPIONES ACARINA GAMASIFORMA SARCOPTIFORMA TROMBIDIFORMA GAMASOIDAE IXOIDAE ACAROIDAE ORIBATEI TARSONEMOIDAE TROMBIDIOIDAE DEMODICOIDAE Derman- yssus gallinae Tiques Aoutats & Rougets Demodex folliculorum Psoroptidae Pyroglyphidae Acaridae (Tyroglyphidae) Glycyphagidae Sarcoptidae Otodectes cyanotis Dermatophagoides pteronyssinus Dermatophagoides farinae Euroglyphus maynei Acarus siro Tyrophagus putrescentiae Lepidoglyphus destructor (Glycyphagus destructor) Glycyphagus domesticus Sarcoptess cabier Hình 1.2. Sơ đồ vị trí phân loại của D. pteronyssinus và D. farinae. 7 1.3. Hệ gen ty thể động vật và chỉ thị phân tử gen ty thể 1.3.1. Giới thiệu về ty thể Ty thể (mitochondria) là bào quan (organelle) phổ biến của tế bào nhân chuẩn (Eucaryota). Ty thể có các đặc điểm cấu tạo đặc trưng, không giống với các bào quan khác trong tế bào. Bao ngoài ty thể là hai lớp màng, màng ngoài nhẵn, màng trong gấp nếp. Chúng có ADN hệ gen riêng cấu tạo dạng vòng cùng với đó là bộ máy phiên mã và dịch mã riêng. Bào quan này nhân lên độc lập không phụ thuộc vào quá trình phân chia c ủa tế bào. Các đặc điểm này của ty thể rất giống với đặc điểm cấu tạo của vi khuẩn và do đó các nhà khoa học cho rằng ty thể là bào quan bắt nguồn từ vi khuẩn sống cộng sinh nội bào (endosymbiosis) với các tế bào nhân thật xuất hiện sớm nhất (Saccone và cs, 1999; Kuroiwa và cs, 2006). Ty thể có hình hạt đậu hoặc ovan, kích thước từ 0,5-1 µm, được bao bọc bởi hai lớp màng: màng ngoài nhẵn, trên đó có các protein có chức năng vận chuyển các chất vào và ra khỏi ty thể; màng trong cuộn lại thành các nếp gấp, là nơi diễn ra quá trình tổng hợp ATP của ty thể. Hai màng ty thể chia ty thể thành hai khoang khác biệt. Khoang chứa chất đệm cơ bản (matrix) nằm bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa màng trong và màng ngoài, trong đó có hệ gen ty thể (Kuroiwa và cs, 2006). Ở hầu hết các động vật, hệ gen ty thể là các phân tử ADN dạng vòng, kích thước 13-20 kb, chứa 36 hoặc 37 gen, cùng với một số vùng cần thiết cho quá trình tái bản và phiên mã (Boore, 1999). Trong số đó, có 12 hoặc 13 gen mã hoá cho các protein tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử; 2 gen ARN ribosome, 22 gen ARN vận chuyển acid amin cần thiết cho quá trình tổng hợp protein và một vùng không mã hóa có kích thước thay đổi tuỳ theo loài động vật (Zhang và Hewitt, 1997; Boore, 1999) (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể động vật Protein được mã hóa Tên gọi ADN ty thể động vật Tên chuẩn hóa dùng hiện nay Cytochrome oxidase subunits I, II, III COI, COII, COIII cox1, cox2, cox3 Cytochromeb apoenzyme Cytb cob NADH dehydrogenase subunits 1-6, 4L ND1-6, 4L nad1-6, nad4L ATP synthase subnits 6,8 A6, A8 hoặc ATP6, ATP8 atp6, atp8 ARN ribosome tiểu phần lớn LrARN rnl, rrnL ARN ribosome tiểu phần nhỏ SrARN rns, rrnS 18 ARN vận chuyển chuyên biệt cho mỗi acid amin Mỗi acid amin tương ứng với một ký tự trnV, trnH 2 ARN vận chuyển đặc hiệu cho leucine Được phân biệt bởi codon nhận biết L(CUN) và L(UUR) trnL1, trnL2 2 ARN vận chuyển đặc hiệu cho serine Được phân biệt bởi codon nhận biết S(AGN) và S(UCN) trn S1, trnS2 (Ghi chú: Gen được viết tắt bằng chữ nghiêng; không có quy ước chung về tên gọi tắt của các gen (Boore, 1999). Mặc dù hệ gen ty thể có tỷ lệ biến đổi nucleotide cao, nhưng phần lớn sự sắp xếp các gen thường không thay đổi trong một giai đoạn dài và sự bảo tồn này cũng 8 mang tính đặc trưng cho các loài trong một ngành động vật. Trật tự gen ở các loài có xương sống (vertebrate) được chuẩn hoá cao. Cụm gen mã hoá cho ARN vận chuyển các acid amin N-W-A-C-Y ở động vật có xương sống là vị trí có sự thay đổi không đáng kể. Trật tự này được xem là trạng thái nguyên thủy của sự sắp xếp gen ty thể ở động vật có xương sống. Sự chuyển vị làm cho trình tự N-W-A-C-Y thành W-A-N- C-Y là đặc trưng cho sự sắ p xếp phổ biến ở động vật có xương sống. Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng đã quan sát thấy có sự sắp xếp trật tự này thành A-C-W-N-Y ở một số loài thú có túi (Boore, 1999). Hệ gen ty thể của động vật có vú có cấu trúc và tổ chức hết sức chặt chẽ, các gen không chứa intron, một số trường hợp có hiện tượng các gen gối lên nhau, giữa các gen không có sự tách biệt rõ ràng, nucleotide cuối cùng của m ột gen nằm gần nucleotide đầu tiên của gen tiếp theo và gần như là chỉ cần một cặp base sau mỗi gen đã có thể xác định ranh giới cho một gen. Ngoại trừ vùng không mã hoá (non-coding region), vùng này ở hệ gen ty thể của người và động vật bậc cao còn có tên gọi là ‘D loop’, bắt đầu cho việc sao chép ADN (Lewine, 2008). Sau động vật có xương sống, động vật chân khớp (Arthropoda) là nhóm có hệ gen ty thể được nghiên cứu nhiều hơn c ả. Các trình tự ADN toàn bộ hệ gen ty thể của Drosophila melanogaster và D. yakuba được xác định có lẽ sớm nhất, không lâu sau đó hệ gen ty thể ở người cũng đã được xác định. Nói chung, có rất ít sự sắp xếp lại trật tự ADN ty thể giữa các loài trong cùng giống (genus), thuộc động vật chân khớp. Nếu có, thì sự sắp xếp lại trong hệ gen ty thể chỉ xảy ra đối với các gen ARN vận chuyển. S ự thay đổi phổ biến nhất ở chân khớp thường xảy ra ở các gen nằm gần vùng không mã hoá (long non-coding region). Sự sắp xếp lại dường như cũng xảy ra ở các gen mã hóa cho ARN vận chuyển của vùng tương ứng với các acid amin A-R- N-S 1 (AGN) -E-F ở Drosophila (Zhang và Hewitt, 1997; Boore, 1999). 1.3.2. Các gen ty thể làm chỉ thị phân tử Các gen mã hóa cho các protein ở hệ gen ty thể động vật bao gồm: 7 gen mã hoá cho phức hợp nicotinamide dehydrogenase (nad) đó là nad1-6 và nad4L; 3 gen mã hóa cho phức hợp cytochrome oxidase (cox) là cox1-3; 1 gen mã hoá cho cytochrome b (cob) và 2 gen mã hoá cho adenosine triphosphatase (atp) là atp6 và atp8. Hệ gen ty thể của tất cả sinh vật đa bào đều chứa 13 gen mã hoá protein, trong đó có gen atp8 (Boore, 1999), kể cả ở loài mạt Dermatophagoides pteronyssinus (Dermauw và cs, 2009), nhưng cho đến nay, các nghiên cứu ở giun tròn (Nematoda) và t ất cả các sán dẹt (Platyhelminthes) cho thấy vẫn không có sự hiện diện của gen này trong hệ gen ty thể (Le và cs, 2002; Hu và Gasser, 2006). Tính bảo tồn cao về độ dài của các gen mã hoá protein trong các loài thuộc các ngành khác nhau, ở cả hai mức nucleotide và amino acid, làm cho việc xác định các gen này phục vụ nhiều mục đích khác nhau đều thực hiện tương đối dễ dàng. Đặc biệt các gen cox (ví dụ, cox1) và phần lớn các gen nad (ví dụ, nad1, nad3) được ứng dụng nhiề u trong việc giám định các loài theo dòng mẹ (chị em, siblings), cũng như các 9 loài có quan hệ gần gũi phả hệ (Le và cs, 2002; Lee và cs, 2004; Hu và Gasser, 2006; Dermauw và cs, 2009). Tuy nhiên, sự tương đồng về các gen atpase (apt6, atp8) và một số gen nad (nad4L, nad3 và nad6) thì ít hơn, thậm chí ngay ở cả các loài có quan hệ gần gũi. Để xác định chính xác các gen này, ngoài việc so sánh sự tương đồng với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu thuộc Ngân hàng gen, còn phải xét đến đặc tính sinh hoá của chúng (ví dụ, như tính chất ưa nướ c, kỵ nước và một số đặc tính khác) (Le, 2001; Hu và Gasser, 2006). ARN ribosome ty thể gồm 2 tiểu phần (rrnL - 16S rARN cấu tạo nên tiểu phần lớn của ribosome; và rrnS - 12S rARN cấu tạo nên tiểu phần nhỏ), cuộn lại thành cấu trúc bậc hai, tồn tại ở ty thể tất cả động vật đa bào. Ở hầu hết các loài, các gen mã hóa cho ARN ribosome nằm trên cùng một chuỗi và được tách biệt bằng một hoặc vài ARN vận chuyể n hoặc một số gen mã hoá protein khác nhau. ARN ribosome ty thể là chỉ thị phân tử có giá trị trong chẩn đoán, giám định, phân loại và nghiên cứu di truyền quần thể (Boore, 1999; Le, 2001; Le và cs, 2002; Hu và Gasser, 2006; Suarez-Martinez và cs, 2005; Dermauw và cs, 2009). 1.4. Đặc điểm hệ gen ty thể của Arthropoda 1.4.1. Xác định chỉ thị hệ gen ty thể trong nghiên cứu giám định loài mạt Cho đến đầu năm 2009, chưa có các công trình nghiên cứu cơ bản nào về đặc tính phân tử hệ gen ty thể của các loài mạt gây bệnh dị ứng ở Việt Nam cũng như trên thế giới được công bố. Tuy nhiên, trình tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh của 28 loài thuộc ngành Chân khớp Arthropoda đã được xác định. Gần đây, đầu năm 2009, công trình giải mã toàn bộ hệ ge ty thể của loài mạt D. pteronyssinus đã được hoàn thành (Dermauw và cs, 2009), hệ gen gồm 14.203 bp (đăng ký Ngân hàng gen số: EU884425) (Hình 1.4). Trong hơn một thập kỷ qua, phương pháp giám định loài sinh vật dựa trên đặc điểm phân tử ADN đã phát triển và đang được sử dụng rộng rãi. Thực chất của phương pháp phân loại này là dựa vào các đặc điểm kiểu gen (genotype) thay vì sử dụng kiểu hình (phenotype) trong phương pháp phân loại hình thái học, ưu điểm là cần ít mẫu vật, không phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển cá thể của sinh vật, có độ chính xác cao rất phù hợp cho việc phát hiện và định loại các loài sinh vật. Hiện nay, nhiề u chỉ thị phân tử (các gen hay tổ hợp gen) đang được sử dụng trong việc giám định loài, đây là các gen hay tổ hợp gen có tính bảo tồn cao, và đặc trưng cho loài sinh vật. Thông thường, gen cox1, nad1, cob của hệ gen ty thể là những gen có giá trị được chọn làm chỉ thị trong giám định và định loại các loài có họ hàng gần gũi; các gen nad3, 16S (rrnL), 12S (rrnS), vùng không mã hoá (NR, non-coding region) được chọn trong phân loại và so sánh biến đổi gen của các loài h ọ hàng xa (hình 1.9). Các gen ty thể là các cấu trúc di truyền đại diện dòng mẹ, do vậy, khi giám định các loài có khả năng giao phối hay trong vùng tạp lai ngoại loài (inter-specific hybridization), nhất thiết cần xem xét thêm chỉ thị hệ gen nhân (ví dụ ITS-2). Từ đó, việc phân tích [...]... (Df) thường có mặt trong bụi nhà, gây nên các triệu chứng bệnh lý d ứng: hen phế quản, viêm mũi d ứng, viêm kết mạc ở người (Tilak và Jogdand, 1989) Giảm thiểu và điều trị d ứng mạt bụi nhà là cách sử d ng miễn d ch học liệu pháp đặc hiệu bằng d nguyên Dp và/ hoặc Df (Đoàn Thị Thanh Hà, 2002; Fleming, 1999; Vũ Thị Minh Thục, 1995) Điều kiện mang tính quyết định là d nguyên phải được chiết xuất từ. .. tách d ng 3.3.2 Kết quả giám định gen và định kỳ kiểm tra giống - Trong các lô DpT1, DpT2, DpT3, DpT4, một lô được sử d ng để giám định phân tử (Lô DpT4), đồng thời các lô khác cũng được giám định với mục đích kiểm nghiệm giống để sản xuất d nguyên - Một lần nữa, lô mạt DpT4 do Viện Tai -Mũi- Họng cung cấp được khẳng định chính xác chỉ chứa loài mạt D pteronyssinus - Do yêu cầu giám định loài để sản xuất. .. lô để sản xuất d nguyên - ADN của 2 loài mạt chuẩn sinh học D pteronyssinus và D farinae (đang sản xuất d nguyên tại Mỹ) do Công ty sinh học Biopol cung cấp để thu nhận chuỗi gen giám định và so sánh đối chiếu 27 - Lô mạt được thu nhận từng cá thể sinh học (ký hiệu: DpT4) của Việt Nam được tách chiết thu ADN tổng số, từ từng cá thể một Từng con mạt được cho riêng vào từng ống Eppendorf và cho dung... phân tích chuỗi gen 12S và cox1, của các loài mạt chuẩn sinh học nhận được từ hãng Biopol (Mỹ), để làm chuỗi so sánh trong giám định gen các lô mạt sản xuất d nguyên tại Việt Nam (Lê Thanh Hòa và cs, 2009) Chúng tôi trình bày kết quả giám định gen một số lô của loài mạt nuôi tại Việt Nam đang sử d ng làm nguồn sản xuất d nguyên điều trị d ứng và khẳng định chắc chắn về phân loại học đó là loài Dermatophagoides... D NG QUI TRÌNH GIÁM ĐỊNH VÀ QUI TRÌNH CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ MẠT BỤI NHÀ D PTERONYSSINUS CỦA VIỆT NAM ĐỂ THỰC HIỆN ĐƯỢC TẠI VIỆT NAM Trên cơ sở thực hiện và kết quả nghiên cứu đạt được, chúng tôi đã xây d ng hai bộ qui trình: Qui trình giám định gen mạt bụi nhà Dermatophagoides pteronyssinus Qui trình chẩn đoán phân tử mạt bụi nhà Dermatophagoides pteronyssinus (Toàn bộ Qui trình ở phần Phụ lục; và đóng thành... gốc từ Mỹ làm chỉ thị phân tử chuẩn để so sánh Nhóm kết quả II: Giám định gen mạt của Việt Nam (lô DpT4) ứng d ng chỉ thị phân tử 12S trong phân tích và so sánh với các chủng của Mỹ và thế giới Nhóm kết quả III: Kết quả định kỳ thực hiện kiểm nghiệm giống mạt theo lô (lô DpT1, DpT2, DpT3) để nuôi cấy tạo nguồn d nguyên thuần khiết Nhóm kết quả IV: Xây d ng qui trình giám định phân tử và qui trình chẩn. .. 3.3.3 Kết luận - Như vậy, kết quả xác định gen 12S thu nhận từ các lô mạt Việt Nam đã chính thức cho kết quả khẳng định loài mạt hiện nay nuôi tại Viện Tai -Mũi- Họng để chế kháng nguyên d ứng là loài D pteronyssinus - Giám định chính xác loài D pteronyssinus của mạt Việt Nam còn có giá trị sử d ng cặp mồi Dp12F-Dp12R để xây d ng qui trình và kit chẩn đoán phân biệt 33 4 NHÓM KẾT QUẢ IV: XÂY D NG QUI... nhận ADN của 2 loài mạt Dp và Df được xác định chuẩn sinh học từ Mỹ, từ đó thu nhận và chọn gen 12S và gen cox1 để biến đổi thành phần nucleotide và acid amin nhằm có d liệu cơ bản làm chỉ thị phân tử trong giám định gen d nguyên acarien của Việt Nam sau này Tóm tắt kết quả nhóm kết quả I Xác định chỉ thị phân tử chuẩn từ (các) loài mạt chuẩn sinh học quốc tế để có d liệu so sánh đối chiếu trong giám. .. hai loài D pteronyssinus và D farinae của Mỹ Bảng 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu STT Mẫu Nguồn gốc Ký hiệu 1 D pteronyssinus Mỹ DpA-US 2 D farinae Mỹ DfA-US 3 Các lô mẫu mạt nuôi tại Viện Tai -Mũi- Họng Việt Nam DpT(1-2-34)-VN Ghi chú Mẫu chuẩn được cung cấp d ới d ng ADN tổng số Mẫu chuẩn được cung cấp d ới d ng ADN tổng số Mẫu nghiên cứu được cung cấp d ới d ng mạt đông lạnh (từng cá thể hoặc từng nhóm)... chủng của loài mạt B tropicalis Loài mạt nuôi tại Việt Nam (lô DpT4) đang sử d ng để chế kháng nguyên d ứng được giám định phân tử chính xác là Dermatophagoides pteronyssinus Trouessart 1897, trên cơ sở phân tích và so sánh với chỉ thị phân tử 12S từ các mẫu chuẩn quốc tế Phân tích phả hệ cũng cho thấy các d ng DpT4(117)VN và DpT4(118)VN của Việt Nam thuộc nhóm Dermatophagoides (Dp và Df) trong khi đó . pteronyssinus để ứng d ng trong ch ẩn đoán, điều trị một số bệnh d ứng: Hen phế quản, Viêm mũi d ứng, Viêm kết mạc do GS.TSKH Vũ Thị Minh Thục chủ nhiệm (Viện Tai -Mũi- Họng) và Viện Vacxin. thường có mặt trong bụi nhà, do hai loài mạt này sống và sản sinh ra trong đó, gây nên các triệu chứng bệnh lý d ứng: hen phế quản, viêm mũi d ứng, viêm kết mạc và nhiều biểu hiện bệnh lý khác (Phòng Miễn d ch học, Viện Công nghệ sinh học), thuộc khuôn khổ đề tài Nhà nước KC1 0-1 0/0 6-1 0: Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin chống d ứng từ mạt bụi nhà acarien Dematophagoides pteronyssinus