Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC HOÀNG THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2014 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hoàng Thị Lan Anh NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2013 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đặng Diễm Hồng, Trưởng phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam- người thầy đã định hướng, truyền dạy những kiến thức khoa học và giúp đỡ tôi vượt qua những trở ngại và khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành PGS. TS. Vũ Mạnh Hùng- Học viện Quân Y, PGS. TS. Nguyễn Văn Chương, Chủ nhiệm Bộ môn – Khoa Nội Thần kinh, Bệnh Viện 103, ThS. Nguyễn Thị Hương-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3, TS. Đoàn Lan Phương- Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, phân tích thành phần và hàm lượng các axít béo không bão hoà. Bên cạnh đó, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các cô chú, anh chị, các bạn đồng nghiệp đã và đang làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Hoàng Thị Minh Hiền, ThS. Ngô Thị Hoài Thu, ThS. Đinh Thị Ngọc Mai, KS. Lê Thị Thơm, KS. Nguyễn Cẩm Hà, KTV. Đỗ Thị Là, ThS. Đinh Đức Hoàng, ThS. Bùi Đình Lãm, ThS. Hoàng Sỹ Nam, ThS. Nguyễn Đình Hưng. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu đánh giá và khai thác hoạt chất từ tảo biển” (2007-2008) và đề tài “Nghiên cứu xây dựng tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng của Việt Nam và nuôi sinh khối một số loài tảo dị dưỡng làm thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản” (2008- 2010) thuộc chương trình công nghệ sinh học trong thủy sản của Bộ NN và PTNT do PGS. TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác gi Hoàng Th Lan Anh ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Hoàng Thị Lan Anh iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chƣơng I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3 1.1. Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi Schizochytrium 3 1.1.1. H thng phân loi 3 1.1.2. t phân lnh tên 6 1.1.2.1. Kĩ thuật phân lập 6 1.1.2.2. Các kĩ thuật định tên 7 1.2. Các axít béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA) 8 1.2.1. Gii thiu chung v -3 PUFA 8 1.2.2. Vai trò ca -i vi sc kho i 9 1.2.3. Sn xut -3 PUFA t vi to 12 1.3. Đặc điểm sinh học của chi Schizochytrium 14 1.3.1. m sinh thái 14 1.3.2. ng ca mt s yu t -3 PUFA Schizochytrium 14 1.3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn C và N 14 1.3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối 16 1.3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 17 1.3.3. ng sinh tng hp DHA chi Schizochytrium 20 1.4. Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng nói chung và chi Schizochytrium nói riêng cho sản xuất -3 PUFA 23 1.4.1. Công ngh nuôi trng vi to bin d ng cho sn xut -3 PUFA 23 1.4.2. Sn xut DHA quy mô ln chi Schizochytrium 25 iv 1.5. Những ứng dụng sinh khối của chi Schizochytrium 27 1.5.1. ng dng trong nuôi trng thy sn 27 1.5.2. Sn xut thm 31 1.5.3. Sn xut du sinh hc giàu omega-3 32 1.5.4. Sn xut nhiên liu sinh hc 33 1.6. Tình hình nghiên cứu vi tảo biển dị dƣỡng ở Việt Nam 34 Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1. Vật liệu 37 2.1.1. Mu vt 37 2.1.2. Vi sinh vt 37 2.1.3. Các b sinh phm 37 2.1.4. ng vt thí nghim 37 2.2. Hoá chất 38 2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 38 2.4. Môi trƣờng 39 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.5.1. Phân lp chi Schizochytrium 40 2.5.2. Chp nh hình thái t i kính hin t quét (SEM) 40 2.5.3. Các phng pháp sinh hc phân t 41 2.5.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ các chủng Schizochytrium spp. 41 2.5.3.2. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 41 2.5.3.3. Tinh sạch sản phẩm PCR 42 2.5.3.4. Tách dòng gen 42 2.5.3.5. Xác định trình tự gen 44 2.5.4. ng ca các chng Schizochytrium spp. 44 v 2.5.5. Nghiên c m sinh lý, sinh hóa ca các chng Schizochytrium spp. 45 2.5.6. ng lipít trong sinh khi to 45 2.5.7. Phân tích thành phng các axít béo trong sinh khi Schizochytrium spp. 46 2.5.8. 46 2.5.9. ng kh bng DNSA 46 2.5.10. Nghiên cu tính an toàn viên Algal Omega -3 47 2.5.10.1. Nghiên cứu độc tính cấp của Algal Omega -3 47 2.5.10.2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 47 2.5.11. Nghiên cu hiu lc ca ch phm Algal Omega- 3 49 2.5.11.1. Xác định phản xạ tìm kiếm thức ăn trong mê lộ 49 2.5.11.2. Nghiên cứu trên mô hình phản xạ tránh shock chủ động có điều kiện 49 2.5.11.3. Nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm năng lực tâm thần kinh 51 2.5.12. Nghiên cu s dng sinh khi to S. mangrovei PQ6 làm giàu luân trùng (Brachionus plicatilis) và Artemia 51 2.5.12.1. Xác định lượng tảo và thời gian làm giàu thích hợp cho luân trùng và Artemia 51 2.5.12.2. So sánh việc sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 tươi, khô và chất cường hoá Golden Power trong việc làm giàu Artemia 52 2.5.12.3. So sánh việc sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 tươi, men bánh mì và vi tảo biển quang tự dưỡng 52 2.5.12.4. Sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) 53 2.5.12.5. Nghiên cứu sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775) 56 2.6. Xử lý số liệu 57 vi Chƣơng III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58 3.1. Đặc điểm sinh học của các đại diện thuộc chi vi tảo biển Schizochytrium 58 3.1.1. Phân lp các chng Schizochytrium spp. t các mu lá cây thu thp vùng rng ngp mn Vit Nam 58 3.1.2. Tuyn chn mt s chng thuc chi Schizochytrium ti vic sn xut DHA 59 3.1.3. Nghiên cm sinh hn ca mt s chng thuc chi Schizochytrium ti 61 3.1.3.1. Một số đặc điểm hình thái điển hình 61 3.1.3.2. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng tiềm năng 63 3.1.3.3. Phân tích hàm lượng lipít, axít béo tổng số và DHA của các chủng tiềm năng 68 3.1.3.4. Bảo quản giống 70 3.1.4. Phân loi các chng ti 72 3.1.4.1. So sánh một số đặc điểm hình thái của các chủng tuyển chọn với một số loài đại diện thuộc chi Schizochytrium 72 3.1.4.2. Phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa 18S rRNA 74 3.2. Công nghệ nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ thống lên men 79 3.2.1. Sng chng PQ6 trong bình lên men 5 và 10 lít 79 3.2.2. ng chng PQ6 trong bình lên men 30 lít t to 83 3.2.3. Xây dng quy trình nuôi trng chng PQ6 trong bình lên men 30 lít t to 87 3.2.4. Phân tích thành phng sinh khi vi tc 89 3.3. Bƣớc đầu sử dụng sinh khối chủng PQ6 trong sản xuất viên thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản 90 vii 3.3.1. Sn xut viên Algal Omega- 3 t sinh khi khô chng PQ6 90 3.3.1.1. Quy trình tạo viên Algal Omega-3 90 3.3.1.2. Nghiên cứu tính an toàn và hiệu lực của viên Algal Omega-3 (AO-3) 93 3.3.2. Ứng dụng sinh khối chủng PQ6 trong nuôi trồng thủy sản 102 3.3.2.1. Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm giàu Artemia và luân trùng (Brachionus plicatilis) 102 3.3.2.2. Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn sống cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775) 117 3.3.2.3. Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu luân trùng và Artemia làm thức ăn sống cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) 119 Chƣơng IV. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 121 4.1. Đặc điểm sinh học của các chủng Schizochytrium đã phân lập 121 4.2. Nuôi trồng chủng tiềm năng PQ6 ở các hệ thống lên men 127 4.3. Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản 135 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 139 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO 143 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Tiếng Việt AA Arachidonic acid (C20:4-6) Axít arachidonic AO-3 Algal Omega- 3 Algal Omega- 3 ALT Alanine aminotransferase Alanine aminotransferase AST Aspartate aminotransferase Aspartate aminotransferase ASTM American Society for Testing and Materials Hiệp hội vật liệu và thử nghiệm Hoa Kỳ CCT Chuột cống trắng Chuột cống trắng CNT Chuột nhắt trắng Chuột nhắt trắng DHA Docosahexaenoic acid (C22:6-3) Axít docosahexaenoic DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic DO Dissolved oxygen Oxy hòa tan DPA Docosapentaeoic acid (C22:5-6) Axít docosapentaeoic E.coli Escherichia coli Vi khuẩn E.coli EPA Eicosapentaenoic acid (C20:5-3) Axít eicosapentaenoic FAME Fatty acid methyl ester Các axít béo dạng methyl ester GPYc Glucose-Polypepton- Yeast extract- chloramphenicol Môi trường phân lập Schizochytrium gồm glucose-polypepton- cao nấm men- chloramphenicol IPTG isopropylthio-β-galactoside isopropylthio-β-galactoside KLCT Khối lượng cơ thể Khối lượng cơ thể KLK Khối lượng khô Khối lượng khô [...]... những nghiên cứu nhằm khai thác và ứng dụng các chi vi tảo biển dị dưỡng, đặc biệt là chi Schizochytrium vẫn còn là rất mới, hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con 2 người Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Có được bộ sưu tập chủng vi tảo. .. tổng số TLS Tỷ lệ sống Tỷ lệ sống VTBDD Vi tảo biển dị dưỡng Vi tảo biển dị dưỡng x DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Những thay đổi trong vi c phân loại một số loài thuộc chi 6 Schizochytrium Bảng 1.2 Hàm lượng lipit và thành phần axít béo của một số loài vi tảo 13 Bảng 1.3 Tóm tắt một số điều kiện quan trọng cho sự tổng hợp DHA ở 18 Schizochytrium Bảng 1.4 Tóm tắt một số nguồn C và N đã được sử dụng. .. ngập mặn ở Vi t Nam; Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của một số chủng tiềm năng đã phân lập; Nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ thống lên men khác nhau (5, 10 và 30 lít); Sản xuất vi n Algal Omega- 3 từ sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm này trên động vật thực nghiệm; Sử dụng sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6 làm giàu... tảo biển dị dưỡng thuộc chi Schizochytrium phân lập từ một số vùng biển, vùng rừng ngập mặn của Vi t Nam và sàng lọc các chủng tiềm năng cho vi c sản xuất -3 PUFA Lựa chọn được một chủng tiềm năng để nuôi thu sinh khối tạo vi n thực phẩm chức năng và thử nghiệm trên một số đối tượng thuỷ hải sản NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phân lập các chủng Schizochytrium spp từ các mẫu lá cây thu thập ở ven bờ biển, ... trong sinh 69 khối của 4 chủng Schizochytrium spp tiềm năng Bảng 3.4 So sánh một số đặc điểm sinh học của 4 chủng tiềm năng với hai loài 73 đại diện của chi Schizochytrium Bảng 3.5 Các loài thuộc chi Schizochytrium có trình tự đoạn gen 18S rRNA đã 76 công bố trên GenBank được sử dụng để phân loại các chủng tiềm năng Bảng 3.6 Lượng sinh khối khô, hàm lượng lipit và DHA trong sinh khối chủng 82 PQ6 nuôi... Artemia và luân trùng (Brachionus plicatilis) để ương nuôi ấu trùng cua xanh (Scylla serrate Forskal, 1775) và cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Bổ sung thêm chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mới vào danh sách các chi vi tảo biển có nguồn gốc từ Vi t Nam; Có được những dẫn liệu khoa học về các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của một số loài /chủng. .. tiềm năng thuộc chi Schizochytrium đã được phân lập; Chứng minh được khả năng ứng dụng chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản 3 Chương I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi Schizochytrium 1.1.1 Hệ thống phân loại Trong những nghiên cứu trước đây, chi Schizochytrium được xếp vào... nhiều lĩnh vực nghiên cứu mới Mặc dù vậy, vi c sử dụng vi tảo nhằm tăng cường giá trị dinh dưỡng của thực phẩm cho con người và thức ăn cho động vật vẫn là những lĩnh vực chiếm ưu thế, mang lại lợi nhuận cao và có một lịch sử phát triển tương đối lâu dài Schizochytrium là một chi vi tảo biển dị dưỡng phân bố rộng rãi trong hệ sinh thái biển và rừng ngập mặn Chúng đóng vai trò là những sinh vật phân... Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng 67 Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng 68 Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số và PCR nhân một phần gen 18S 74 rRNA của 4 chủng tiềm năng Hình 3.11 Plasmid sau khi tách chiết và cắt kiểm tra bởi enzyme giới hạn 76 Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại của 4 chủng Schizochytrium spp nghiên cứu 78 với một số loài thuộc chi Schizochytrium. .. dụng rộng rãi cho vi c nuôi trồng các VTBDD (de Swaaf và cs, 2003b) Hàm lượng lipit và thành phần axít béo của một số loài vi tảo quang tự dưỡng và dị dưỡng được trình bày ở bảng 1.2 Mặc dù vậy, sản xuất ω-3 PUFA từ VTBDD cũng có một số thách thức như: chỉ một số ít các loài VTBDD tích lũy ω - 3 PUFA có hàm lượng cao; do môi trường nuôi rất giàu dinh dưỡng và tốc độ sinh trưởng của tảo tương đối thấp . tài: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 . MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Có được bộ sưu tập chủng vi tảo biển dị dưỡng. VI N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N CÔNG NGHỆ SINH HỌC HOÀNG THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM. CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC