BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỸ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tên đề tài: KHÁNG THỂ TRUNG HÒA VÀ CYTOKINE TRONG SỮA MẸ: ẢNH HƯỞNG ĐẾN VẮC XIN PHÒNG ROTAVIRUS Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Đặng Đức Anh Đơn vị chủ trì: Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương Thời gian thực hiện: Từ 9/2010 đến 9/2011 Mã số đề tài: 106.99.182.09 Hà nội - 2012 2 MỤC LỤC Những từ viết tắt….……………………………………………………………… 3 Bảng tóm tắt nghiên cứu………………………………………………………… 4 Phần I. Thông tin chung…………………………………………………………… 6 Phần II. Nội dung và kết quả nghiên cứu 1. Tổng quan………………………………………………………………………. 7 2. Mục tiêu ………………………………………………………………………… 9 3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu………………………………………… 9 4. Kết quả nghiên cứu…………………………………………………………… 11 5. Bàn luận………………………………………………………………………… 31 6. Kết luận…………………………………………………………………………. 33 7. Tài liệu tham khảo 35 Phần III. Kết quả công bố và đào tạo 39 Phần IV. Tình hình sử dụng kinh phí……………………………………………… 42 Phần V. Kiến nghị……………………………………………………………… 42 PHỤ LỤC 1. Các quy trình thao tác chuẩn……………………………………………………. 43 1.1. Quy trình lấy, vận chuyển và bảo quản mẫu phân 44 1.2. Quy trình ELISA xác định RV-IgA 48 1.3. Quy trình định lượng kháng thể trung hòa trong mẫu sữa 58 1.4. Quy trình trung hòa giảm đám hoại tử 62 1.5. Quy trình ELISA định lượng TGF-1 63 1.6. Quy trình ELISPOT xác định đáp ứng tế bào sinh kháng thể đặc hiệu RV 65 2. Danh sách mẫu và kết quả xét nghiệm…………………………………………. 68 3. Giấy chứng nhận Y đức của Hội đồng cấp cơ sở……………………………… 69 4. Thông tin người cho mẫu sữa…………………………………………………… 70 5. Phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu (dành cho mẫu sữa)………………….… 72 6. Phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu (dành cho mẫu máu cuống rốn)……… 76 7. Các bài báo công bố từ kết quả của đề tài………………………………………. 79 3 NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ACIP Hội đồng cố vấn về tiêm chủng – Tổ chức Y tế thế giới ELISA Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme ELISPOT Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme tạo điểm MEM Môi trường minimul essential medium MN Microneutralization assay Kỹ thuật trung hòa vi lượng POLYVAC Trung tâm sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế RRV Rhesus rotavirus – chủng virus từ khỉ RV Rotavirus TGF-ß1 Transforming growth factor beta 1 Yếu tố chuyển đổi tăng trưởng beta 1 VN Kháng thể trung hòa virus WHO Tổ chức y tế thế giới 4 BẢNG TÓM TẮT NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu - Xác định hiệu giá kháng thể IgA, kháng thể trung hoà với các type rotavirus (RV) lưu hành ở Việt nam và hàm lượng TGF-β1 trong sữa mẹ. - Đánh giá ảnh hưởng bởi sữa mẹ đến vắc xin Rotavin-M1 phòng tiêu chảy do RV. • Đánh giá khả năng sữa mẹ làm giảm hiệu giá virút trong vắc xin phòng rotavirus. • Đánh giá ảnh hưởng của TGF-β1 đến đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin phòng tiêu chảy do RV. Phương pháp và đối tượng nghiên cứu 300 mẫu sữa (20-30 ml) được thu thập từ các bà mẹ tại thành phố Thái Bình và huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ. Phụ nữ lựa chọn tham gia nghiên cứu là phụ nữ khoẻ mạnh, có con từ 6 tuần tuổi đến 6 tháng tuổi và đang cho con bú, không có bệnh tật, đồng ý tham gia nghiên cứu và ký đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu. Những phụ nữ đang bị mắc các bệnh cấp tính, sốt (>38 o C) trong vòng 3 ngày trước khi đ ến địa điểm cho mẫu không được chọn tham gia nghiên cứu. Kháng thể trung hoà kháng RV trong sữa mẹ được định lượng bằng phương pháp trung hoà vi lượng (microneutralization assay) sử dụng chủng virus vắc xin G1P[8] (Rotavin-M1) và G4P[6] (do POLYVAC, PGS/TS Lê Thị Luân cung cấp), cùng với một số chủng chuẩn phòng thí nghiệm như DS1 (G2P[4]) và RRV (G3P[3]). Cytokine TGF- β1 ở cả 2 dạng, tự do và ẩn trong sữa mẹ được định lượng bằng ELISA dựa trên đường chuẩn nồng độ của bộ kít Emax Immunoassay Systems (Promega). Ảnh hưởng của kháng thể với hiệu giá khác nhau trong sữa đến hiệu giá vắc xin Rotavin-M1 được đánh giá bởi kỹ thuật trung hòa giảm đám họa tử. Để đánh giá ảnh hưởng của sữa mẹ đến đáp ứng kháng thể đối với Rotavin-M1, đáp ứng tế bào sinh kháng thể bằng kỹ thuật ELISPOT được đánh giá trên vitro sử dụng tế bào lympho, kích hoạt bởi RV-chủng Wa với sụ có mặt của TGF-β1 với các nồng độ khác nhau. Kết quả Tỷ lệ mẫu sữa có kháng thể IgA đặc hiệu rotavirus cao, trên 93% ở cả 2 địa điểm nghiên cứu, trong đó 68% mẫu có kháng thể trung hòa đối với 1 trong 2 chủng G1 và G4, chủ yếu với hiệu giá thấp (2-16). Không có sự khác biệt về hiệu giá kháng thể trung hòa giữa hai điểm nghiên cứu, tuy nhiên kháng thể IgA đặc hiệu rotavirus cao hơn ở Thái Bình so với Thanh Sơn, Phú Thọ cho thấy mức độ tiếp xúc với virus khác nhau giữa nông thôn miền núi và thành thị. Sữa mẹ giảm 80% lượng virus trong vắc xin ngay cả khi đã pha loãng 8-128 lần. Phần lớn mẫu sữa (57-89%) có chứa TGF-ß1, nồng độ cao nhất là 1,4ng/ml. Ở nồng độ cao (5ng/ml), TGF-1 ức chế sự tăng trưởng của tế bào lympho. Ở nồng độ thấp (0,1ng/ml), TGF-ß1 kích thích kháng thể IgA (toàn phần và đặc hiệu RV). Như vậy, nghiên cứu này một lần nữa khẳng định sự điều chế đáp ứng miễn dịch của TGF-ß1 phụ thuộc vào nồng độ của cytokine này. 5 Kết luận Kháng thể trung hòa RV và TGF-ß1 trong sữa mẹ trung hòa virus trong vắc xin và ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch đối với RV invitro. Cần có các nghiên cứu tiếp theo để đánh giá khả năng sữa mẹ ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch và hiệu lực của vắc xin ở trẻ em Việt Nam. 6 Mẫu M4a PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG 1. Tên đề tài: Kháng thể trung hòa và cytokine trong sữa mẹ: Ảnh hưởng đến vắc xin phòng rotavirus 2. Mã số:106.99.182.09 3. Danh sách chủ nhiệm, thành viên tham gia thực hiện đề tài: TT Họ và tên Đơn vị công tác Chức danh trong đề tài 1 PGS.TS. Đặng Đức Anh Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ Chủ nhiệm đề tài 2 T.S. Nguyễn Vân Trang Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ Thành viên tham gia chính 3 Th.S. Vũ Thị Bích Hậu Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ Kỹ thuật viên 4 Th.S. Lê Thị Hồng Nhung Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ Kỹ thuật viên 5 CN. Trần Thị Nhã Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ Kỹ thuật viên 6 CN. Ngô Thị Thanh Hoa Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ Kỹ thuật viên 7 CN. Lê Thị Kim Anh Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ Kỹ thuật viên 4. Tổ chức chủ trì: Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương 5. Thời gian thực hiện: 5.1 Theo hợp đồng: 24 tháng, từ (11/2009) đến (11/2011) 5.2 Gia hạn (nếu có): tháng 5.3 Thực hiện thực tế: 24 tháng, từ (11/2009) đến 11/2011) 6. Tổng kinh phí được phê duyệt củ a đề tài: 730 triệu đ ồng. Hà nội ngày tháng năm 2012 Tổ chức chủ trì đề tài (Thủ trưởng đơn vị ký tên, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) PGS. TS. Đặng Đức Anh Mã số hồ sơ Ngày nhận báo cáo (Do Cơ quan điều hành Quỹ ghi) 7 PHẦN II. NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan Rotavirus (RV) là loại virút không có vỏ ngoài, có vật liệu di truyền là ARN kép, thuộc họ Reoviridae (10). RV được phân nhóm thành A, B và C dựa theo protein VP6 ở lớp vỏ trong, với nhóm A gây nhiễm trên người với tỷ lệ cao nhất. Trong cùng một nhóm, RV được phân chia thành các genotyp hoặc serotyp, dựa trên cả 2 protein lớp vỏ ngoài của virút là VP4 và VP7, hay còn gọi là P genotyp và G genotyp. Hiện nay có đến 15 G genotyp và 22 P genotyp được phát hiện. Do tính đa dạng của RV, trẻ có thể bị nhiễm một hoặc nhiều chủng trong cùng một năm. Sau khi nhiễm RV, kháng thể IgA là thành phần chính được tạo ra tại niêm mạc ruột. Kháng thể IgA đặc hiệu với RV trong phân của trẻ có liên quan đến việc bảo vệ trẻ khỏi bị nhiễm virút và tiêu chảy (9). Đây cũng là kháng thể chính có mặt trong các dịch thể như nước bọt, dịch ruột, dịch mật và sữa mẹ . Kháng thể IgA có khả năng trung hoà hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của RV qua rào chắn màng ruột. Sau khi nhiễm RV, kháng thể IgG được tạo ra chủ yếu ở máu, một số lượng nhỏ IgG có khả năng thẩm thấu từ máu ra niêm mạc ruột và trung hoà RV ở đây (29). Ở trẻ, kháng thể trung hoà đặc hiệu RV rất cần thiết để tạo miễn dịch ngăn ngừa tình trạng nhiễm và tiêu chảy do virút này (11). Hàng năm, ước tính trên thế giới RV là nguyên nhân gây ra 1,4 tỷ ca tiêu chảy ở trẻ dưới 5 tuổi với 608,000 trường hợp tử vong, chiếm tỷ lệ 5% trong các ca tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi (5). Trong hơn 30 năm qua, nhiều loại vắc xin phòng RV đã và đang được nghiên cứu như vắc xin từ chủng gây nhiễm trên bò, khỉ, người hoặc vắc xin tái tổ hợp từ những chủng trên. Tuy nhiên các vắc xin này có hiệu quả không cao và không đồng đều giữa các địa điểm nghiên cứu, giữa các nước phát triển và đang phát triển. Vắc xin tái tổ hợp dựa trên chủng virút trên người và khỉ rhesus RRT-TV có hiệu lực cao ở Mỹ và Phần Lan, nhưng lại kém hiệu quả khi thử nghiệm ở các nước phát triển như Peru và Brazil (3, 15, 18, 37). Một trong những nguyên nhân được xem xét là ảnh hưởng của kháng thể nhận từ mẹ đến vắc xin (39). Kháng thể nhận từ mẹ qua rau thai hoặc qua sữa vừa có thể bảo vệ con khỏi nhiễm virút và tiêu chảy, vừa ảnh hưởng đến khả năng gây miễn dịch và bảo vệ của vắc xin trên trẻ. Nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu RV ở bà mẹ và trẻ em ở New York, Mỹ và Venezuela cho thấy kháng thể trẻ nhận từ mẹ trước khi sử dụng vắc xin RRV (làm từ chủng RV gây nhiễm trên khỉ rhesus) làm giảm động lực kháng thể (seroconversion) ở trẻ sau khi tiêm vắc xin. Một số thử nghiệm lâm sàng khác cũng cho thấy động lực kháng thể sau khi dùng vắc xin phòng RV giảm đi nhiều ở trẻ có kháng thể mẹ cao. Ở các nước đang phát triển như Banglades, Venezuela v.v , kháng thể mẹ đặc hiệu RV cao và bao phủ một khoảng hiệu giá rộng (8, 34, 39), trong khi đó ở các nước phát triển như Australia, Đức, Mỹ, kháng thể này thấp hơn và phủ một khoảng hiệu giá hẹp hơn nhiều (6, 21, 38, 45). Vắc xin Rotarix khi cho uống 2 liều cách nhau 1 tháng chỉ đạt được động lực kháng thể trong 50% trẻ ở Châu Phi, 50-60% ở các nước Châu Á, trong khi tỷ lệ này là 70-90% ở Mỹ, các nước Mỹ latinh và Châu Âu. Cũng như ở người, mặc dù kháng thể mẹ truyền cho con có khả năng bảo vệ trên mô hình động vật như bò, lợn và khỉ (12, 31, 47), kháng thể mẹ truyền cũng ức chế khả năng tạo miễn dịch bảo vệ của vắc xin trên lợn (25, 27). Chúng tôi cũng đã chỉ ra rằng 8 mức độ ảnh hưởng đối với vắc xin phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể mẹ (Xem phần tiến độ nghiên cứu). Sữa mẹ, ngoài các chất dinh dưõng cần thiết cho cơ thể, sữa mẹ chứa kháng thể và các yếu tố miễn dịch, có tác dụng bảo vệ trẻ khỏi các bệnh truyền nhiễm đặc biệt là tiêu chảy. Tuy nhiên sự có mặt của kháng thể và các yếu tố miễn dịch như cytokine có thể ảnh hưởng đến hiệu lực của vắc xin, đặc biệt là vắc xin sống. Sữa mẹ có chứa TGF-β 1, hàm lượng từ 100pg/ml -3000pg/ml. Cytokine này đóng vai trò điều hoà miễn dịch trong quá trình mang thai và khi sinh, đồng thời cytokine này là nguyên nhân của hệ miễn dịch trẻ sơ sinh nghiêng về loại Th2 (16, 35). Để làm việc này, TGF-β1 ức chế tế bào ghi nhớ Th1 trong bào thai, làm cho hệ miễn dịch của trẻ có chiều hướng nghiêng về Th2 ngay từ trước khi sinh (20, 46). Khi TGF-β1 truyền cho chuột con thông qua chuột mẹ trong thời gian mang thai hoặc qua sữa khi cho bú đã cứu chuột con mới sinh thiếu gen sản sinh TGF-β1 khỏi những ảnh hưởng tim mạch nghiêm trọng (17). Ở những chuột đang bú mẹ, cho chuột ăn sữa bột không có TGF-β1 dẫn đến phản ứng dị ứng thức ăn bao gồm tập trung sản xuất IL-18, số lượng lớn tế bào dendritic, bạch cầu ưa axit, và tế bào mast (33). Những phản ứng viêm trên chuột đang bú này có thể giảm đi bằng cách cho chuột ăn khẩu phần có thêm TGF-β2. Ở người, TGF-β1 và TGF-β2 trong sữa non liên quan đến nồng độ IgA trong máu trẻ trong tháng đầu sau khi sinh (30). Ở lợn, nồng độ TGF- β1 thấp kích thích quá trình chuyển isotype sang IgA, trong khi đó nồng độ TGF-β1 cao ức chế tế bào sản xuất IgA. Khi cho chuột ăn TGF-β1, lượng cytokine này giữ nguyên hoạt tính trong ruột, và làm giảm kháng thể IgE và IgG1 đặc hiệu với kháng nguyên, và tăng tolerance với thức ăn (1). Như vậy TGF-β1 trong sữ a mẹ có khả năng ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của trẻ đối với vắc xin phòng RV. Tình hình nghiên cứu trong nuớc Ở nước ta, tỷ lệ nhiễm RV trên trẻ em bị tiêu chảy phải nhập viện là 44-62% (28, 44) với ước tính 5300-6800 ca tử vong hàng năm ở trẻ dưới 5 tuổi, chiếm 8-11% tỷ lệ tử vong ở trẻ có cùng độ tuổi. Ước tính rằng ở nước ta, hàng năm đã có 820.000 ca cần hỗ trợ của bác sỹ và 122.000-140.000 trường hợp nhập viện và do tiêu chảy với tác nhân là RV (2). Tình trạng nhiễm RV ở miền Bắc khác với miền Trung và miền Nam (28) Ở miền Bắc, tiêu chảy do RV thường xảy ra vào mùa lạnh, trong khi đó các tháng hè tỷ lệ nhiễm giảm xuống. Ở miền Trung và Nam, nhiễm RV xảy ra quanh năm với tỷ lệ tương đương. Chủng RV lưu hành ở Việt Nam đa dạng với chủng G1, G2, G4 và G9 chiếm tỷ lệ đáng kể (44). Hiện tại, G3 đang là chủng lưu hành rộng rãi ở nước ta. Do nhu cầu cấp thiết chế tạo vắc xin phòng RV ở Việt Nam, Trung tâm khoa học sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế (POLYVAC), hợp tác với Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật CDC, Mỹ đang tiến hành nghiên cứu vắc xin phòng RV sử dụng chủng phân lập Việt Nam (Rotavin) và sẽ tiến hành thử nghiệm vắc xin này (19). Tuy nhiên bên cạnh thử nghiệm vắc xin, cần có những nghiên cứu về yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực của vắc xin ở những địa điểm khác nhau. Rotavirus (RV) nhóm A là tác nhân phổ biến gây ra tiêu chảy cấp ở trẻ em chiếm 30-50% trong các tác nhân gây tiêu chảy cấp. Với tỷ lệ nhiễm RV cao ở trẻ, trong suốt hơn 30 năm qua, vắc xin phòng RV đã và đang được phát triển để bảo vệ trẻ. Hiện nay, có 2 vắc xin phòng RV là vắc xin Rotarix (Glaxo-Smith-Kline, GSK) và RotaTeq (Merck) đã được Tổ chức kiểm dịch Thực phẩm và Thuốc (FDA), Mỹ cấp phép sử dụng ở trẻ em. Cả hai vắc xin này đều đã được Hội đồng cố vấn về tiêm chủng của Tổ chức Y 9 tế Thế giới (Advisory Committee on Immunization practices) khuyên dùng cho trẻ từ 1.5- 4 tháng tuổi. Rotarix đã được bán rộng rãi ở Việt Nam, tuy nhiên với giá thành cao (gần 50 đô la Mỹ/liều) và không thuộc chương trình tiêm chủng mở rộng, khả năng đưa vắc xin này đến đa số dân nước ta là rất ít. Ở Việt Nam, chúng ta cũng đang sản xuất thử vắc xin phòng RV và đang đưa vào thử nghiệm. Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực của vắc xin cần được xem xét. Một trong các yếu tố đó là kháng thể đặc hiệu RV trong sữa mẹ có khả năng trung hoà làm giảm hiệu giá của vắc xin, dẫn tới làm giảm hiệu lực củ a vắc xin. Ảnh hưởng bởi kháng thể mẹ truyền đối với vắc xin phòng sởi đã được biết đến từ lâu, và do đó trẻ chỉ được tiêm vắc xin này ở độ tuổi 9-15 tháng. Ảnh hưởng của kháng thể mẹ đối với vắc xin phòng RV đã được chứng minh ở các mô hình động vật. Trong khi vắc xin phòng RV có tên RIT4327 cho hiệu lực cao trong các thử nghiệm lâm sàng ở Phần Lan, vắc xin này lại không bảo vệ trẻ em ở Rwanda, Gambia cũng như một khu vực dân cư thuộc vùng Tây Nam nước Mỹ. Tương tự như vậy, vắc xin RRV-TV có hiệu quả cao ở Mỹ và Phần lan nhưng lại có hiệu quả kém hơn ở Brazil và Peru. Trong khi đó các thử nghiệm lâm sàng của Rotarix này ở các nước đang phát triển ở Châu Á cũng cho hiệu lực thấp hơn so với các nư ớc như Mỹ, Châu Mỹ la tinh và Châu Âu. Đ iều này cho thấy có sự khác biệt đáng kể giữa hiệu lực của vắc xin ở các địa điểm khác nhau. Giả thuyết đưa ra là hiệu giá kháng thể trong sữa mẹ ở các nước đang phát triển cao hơn ở các nước phát triển, do đó khả năng trung hoà virus trong vắc xin ở các nước đang phát triển cao hơn. Một yếu tố khác trong sữa có thể ảnh hưởng đến hiệu lực của vắc xin là cytokine, cụ thể là TGF-β1. Đây là cytokine có vai trò điều phối đáp ứng miễn dịch TGF-β1có tác dụng kích thích hoặc ứng chế miễn dịch tuỳ theo nồng độ khác nhau. Có khả năng nồng độ TGF-β1 trong sữa mẹ ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch đối với RV vắc xin. 2. Mục tiêu Mục tiêu của đề tài. - Xác định hiệu giá kháng thể IgA, kháng thể trung hoà với các type RV lưu hành ở Việt nam và hàm lượng TGF-ß1 trong sữa mẹ. - Đánh giá ảnh hưởng bởi sữa mẹ đến vắc xin Rotavin-M1 phòng RV • Đánh giá khả năng sữa mẹ làm giảm hiệu giá virút trong vắc xin phòng tiêu chảy do RV. • Đánh giá ảnh hưởng của sữa mẹ và TGF-β1 đến đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin phòng tiêu chảy do RV. 3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.1 Định lượng kháng thể trung hoà và cytokine trong sữa mẹ 300 mẫu sữa (20-30 ml) được thu thập từ các bà mẹ tại 2 địa điểm bao gồm 4 quận huyện tại thành phố Thái Bình và 4 Trung tâm Y tế xã tại huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ. Tại các trung tâm y tế này, các bà mẹ đưa trẻ đến tiêm phòng vắc xin trong một ngày cố định trong tháng. Tại thời điểm này, bà mẹ cho con đến tiêm/uống vắc xin trong khoảng 6 tuần-6 tháng tuổi được lựa chọn cho nghiên cứu. Trẻ ở lứa tuổi này được khuyến cáo sử dụng vắc xin phòng RV. Các bà mẹ được giải thích về mục đích nghiên 10 cứu, và ký vào phiếu cam kết tham gia nghiên cứu nếu đồng ý cho mẫu sữa. Các thông tin nhưtuổi của bà mẹ, tuổi hoặc ngày sinh của trẻ và tình trạng sức khoẻ của mẹ. Đề cương nghiên cứu và phiếu đồng ý tham gia nghiên cứuđã được thông qua hội đồng y đức, Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW. Tiêu chí tham gia nghiên cứu Phụ nữ khoẻ mạnh có con từ 6 tuần tuổi đến 6 tháng tuổi và đang cho con bú, không có bệnh tật, đồng ý tham gia nghiên cứu và ký đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu (Phụ lục 5). Tiêu chuẩn loại trừ: Phụ nữ đang bị mắc các bệnh cấp tính, Sốt (>38 o C) trong vòng 3 ngày trước khi đến địa điểm cho mẫu. Mẫu sữa được giữ tại 4 o C sau khi lấy. Ở phòng thí nghiệm (PTN), mẫu sữa sẽ được chia thành 4 mẫu nhỏ, và giữ tại -80 o C. Kháng thể trung hoà kháng RV trong sữa mẹ được định lượng bằng phương pháp trung hoà vi lượng (microneutralization assay). Chúng tôi xác định hiệu giá trung hoà đặc hiệu với chủng virút sẽ sử dụng trong vắc xin phòng RV sản xuất tại Việt Nam (G1P[8] và G4P[6] do POLYVAC, PGS/TS Lê Thị Luân cung cấp), cùng với một số chủng chuẩn phòng thí nghiệm như DS1 (G2P[4]) và RRV (G3P[3]). Đây cũng là những serotype có mặt trong các vắc xin đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Vắc xin Rotarix (công ty GSK) là chủng giảm động lực từ người thuộc type G1P[8], Rotateq (Merck) là vắc xin bao gồm 5 chủng (G1-G4 và P1[8]) tái tổ hợp có nguồn gốc một phần từ virút phân lập tại bò (WC3). Như vậy trong nghiên cứu của chúng tôi, hiệu giá kháng thể trung hoà với những chủng RV lưu hành rộng rãi trên thế giới và Việt Nam với tỷ lệ cao như G1, G2, G3, G4, P[4], P[6]và P[8] được xác định. Kháng thể IgA đặc hiệu RV trong sữa được xác định bằng ELISA (Phụ lục 1). Cả hai kỹ thuật này đã được phát triển tại PTN đường ruột, CDC (13, 47). Tuy nhiên kỹ thuật trung hòa (Phụ lục 1) ứng dụng cho một chủng virus có một điều kiện phản ứng riêng, vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu thay đổi điều kiện phản ứng cho phù hợp với từng type virus (Bảng 3.1). Bảng 3.1. Các điều kiện tối ưu cho kỹ thuật trung hòa vi lượng G1P[8] Rotavin G2P[4]DS1 RRV G4P[6] POLYVAC Nồng độ trypsin 5µg/ml 5µg/ml 5µg 5µg/ml Nồng độ Ca 2+ 80µg/ml 80µg/ml 0 80µg/ml Thời gian nuôi cấy sau khi gây nhiễm 60-72h 60-72h 24h 40-48h Đồng thời, một số mẫu sữa này được gửi đến phòng thí nghiệm (PTN) virút đường ruột, CDC (Dr Baoming Jiang) để kiểm nghiệm, sử dụng một số virút trên và các [...]... G3P[3] hay chủng G4P[6] trong sữa mẹ Như vậy với liệu vắc xin sử dụng là 106FFU/liều và nếu trẻ uống 100ml trong thời gian uống vắc xin, mẫu sữa với hiệu giá RV-IgA cao và trung bình có khả năng trung hoà virus vắc xin 25 Hình 4.9 Khả năng trung hòa virus trong vắc xin bởi các hiệu giá kháng thể trung hòa khác nhau trong mẫu sữa 26 So sánh hoạt tính trung hoà trong mẫu sữa với các chủng virus G1P[8]... từ mẫu sữa sau khi xử lý bằng acid (10 phút) theo hướng dẫn của nhà sản xuất 3.2 Ảnh hưởng của kháng thể mẹ trong sữa đến hiệu giá vắc xin Thay vì phân loại kháng thể theo hiệu giá kháng thể IgA (RV-IgA), chúng tôi sử dụng kháng thể trung hòa chủng G1P[8] để phân loại thành (1) không có kháng thể trung hòa,, (2) kháng thể với mức hiệu giá 2-16, (3) kháng thể với mức hiệu giá >=32 Các mẫu sữa với hiệu... uống vắc xin, hiệu giá kháng thể kháng virus G1 ở trong huyết thanh trẻ ở Phú Thọ thấp hơn trẻ ở Thái Bình (p . giá ảnh hưởng của sữa mẹ và TGF-β1 đến đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin phòng tiêu chảy do RV. 3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.1 Định lượng kháng thể trung hoà và cytokine trong sữa. có khả năng trung hoà làm giảm hiệu giá của vắc xin, dẫn tới làm giảm hiệu lực củ a vắc xin. Ảnh hưởng bởi kháng thể mẹ truyền đối với vắc xin phòng sởi đã được biết đến từ lâu, và do đó trẻ. vắc xin này ở độ tuổi 9-15 tháng. Ảnh hưởng của kháng thể mẹ đối với vắc xin phòng RV đã được chứng minh ở các mô hình động vật. Trong khi vắc xin phòng RV có tên RIT4327 cho hiệu lực cao trong