QUỸ PHÁT TRIỂN KH&CN QUỐC GIA CÔNG TY CỔ PHẦN HẢI NGUYÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ ĐỔI MỚI CÔNG NGHỆ DO DOANH NGHIỆP THỰC HIỆN BÁO CÁO TỔNG HỢP Đề tài “ Nghiên cứu điều chế chế phẩm HN-LBS phòng trị bệnh đường ruột lợn giảm ô nhiễm môi trường chăn nuôi lợn” Mã số : 25/2009 Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài Th.S Đào Thế Hải Cơng ty cổ phần Hải Nguyên Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia Bộ khoa học công nghệ 8903 HÀ NỘI 2011 31 QUỸ PHÁT TRIỂN KH&CN QUỐC GIA CÔNG TY CỔ PHẦN HẢI NGUYÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ ĐỔI MỚI CÔNG NGHỆ DO DOANH NGHIỆP THỰC HIỆN BÁO CÁO TỔNG HỢP Đề tài “ Nghiên cứu điều chế chế phẩm HN-LBS phòng trị bệnh đường ruột lợn giảm ô nhiễm môi trường chăn nuôi lợn” Mã số : 25/2009 Cơ quan chủ trì đề tài: Cơng ty cổ phần Hải Ngun Chủ nhiệm đề tài Th.s Đào Thế Hải HÀ NỘI 2011 32 QUỸ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA CỘNG HOÀ Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2009 HỢP ĐỒNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ (Dùng cho đề tài nghiên cứu đổi công nghệ doanh nghiệp theo NĐ 119/1999/NĐCP ngày 18/09/1999 Chính Phủ) Số: 25/2009/ HĐKHCN-DN Căn Bộ luật Dân ngày 14 tháng năm 2005; Căn Luật Khoa học Công nghệ ngày tháng năm 2000; Căn Nghị định 119/1999/NĐ-CP ngày 18/9/1999 Chính phủ số sách chế tài khuyến khích doanh nghiệp đầu tư vào hoạt động khoa học công nghệ; Căn Nghị định số 122/2003/NĐ-CP ngày 22/10/2003 thành lập Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia; Căn vào Thông tư liên tịch số 2341/2000/TTLT/BKHCNMT-BTC ngày 28/11/2000 thông tư số 25/2003/BKHCN-BTC ngày 25/8/2003 “ Hướng dẫn thực Nghị định 119/1999/NĐ-CP Chính Phủ”; Căn vào Thông tư liên tịch số 129/2007/TTLT/BTC-BKHCN ngày 2/11/2007 Bộ Tài chính- Bộ Khoa học Công nghệ hướng dẫn thực chế độ quản lý tài Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia; Căn Quyết định số 1672 /QĐ-BKHCN ngày 04 tháng 08 năm 2008 Bộ trưởng Bộ Khoa học Công nghệ việc giao cho Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia thực hỗ trợ kinh phí đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ doanh nghiệp theo Nghị định 119/1999/NĐ-CP Chính phủ; Căn Quyết định số 05 /QĐ-HĐQLQ ngày 28 tháng năm 2009 Hội đồng quản lý Quỹ việc phê duyệt kinh phí hỗ trợ đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ doanh nghiệp năm 2009 theo Nghị định số 119/1999/NĐ-CP Chính phủ; Chúng tơi gồm: BÊN A:QUỸ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA Đại diện Ông: Phan Hồng Sơn Chức vụ: Giám đốc Điện thoại: 04.39367750 fax: 04.39367751 Số tài khoản: 942.90.002 Tại Kho bạc Nhà nước Thành phố Hà Nội BÊN B: CÔNG TY CỔ PHẦN HẢI NGUYÊN Cơ quan chủ trì đề tài Đại diện Ơng: Lê Văn Đơng Chức vụ: Phó giám đốc Điện thoại: 04.36761997 Fax: 04.36760921 Địa chỉ: Ngõ 56 Ngô Xuân Quảng, Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội Số tài khoản: 0531100081003 Tại Kho bạc ( Ngân hàng): Ngân hàng thương mại cổ phần quân đội, chi nhánh Long Biên Chủ nhiệm đề tài: Chức danh: Đơn vị công tác: Điện thoại: Địa chỉ: Email: Đào Thế Hải Bác sĩ thú y Công ty cổ phần Hải Nguyên 04.36761997, 0988515555 Fax: 04.36760921 Ngõ 56 Ngô Xuân Quảng, Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội haidao72@gmail.com Hai bên thoả thuận ký Hợp đồng nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ (sau gọi tắt Hợp đồng) với điều khoản sau: Điều Nội dung Hợp đồng Bên A hỗ trợ phần kinh phí để Bên B thực đề tài “Nghiên cứu điều chế chế phẩm HN - LBS để phòng trị bệnh đường ruột lợn giảm ô nhiễm môi trường chăn nuôi lợn” theo nội dung Thuyết minh Đề tài Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia phê duyệt Thuyết minh đề tài phụ lục 1, kèm theo phận không tách rời Hợp đồng Thời gian thực đề tài: 24 tháng, từ tháng 7/2009 đến tháng 6/2011 Điều Kinh phí phương thức hỗ trợ Tổng kinh phí thực đề tài là: 3.200 triệu đồng Trong đó: - Kinh phí Bên A hỗ trợ từ ngân sách Nhà nước để thực đề tài là: 900 triệu đồng - Kinh phí từ nguồn vốn doanh nghiệp là: 2.300 triệu đồng Phương thức hỗ trợ: Kinh phí hỗ trợ Bên A cấp toán cho Bên B từ Quỹ phát triển khoa học công nghệ Quốc gia theo quy định Thông tư liên tịch số 25/2003/BKHCN-BTC ngày 25/8/2003 Bộ Khoa học Công nghệ Bộ Tài Dự kiến thời gian cấp tốn: Căn vào tiến độ thực đề tài, Bên A dự kiến thời gian cấp kinh phí hỗ trợ cho bên B sau: Đợt Thời gian cấp Kinh phí dự kiến Năm 2009 320 Năm 2010 480 Năm 2011 Ghi 100 Điều 3: Quyền trách nhiệm Bên: Quyền trách nhiệm Bên A: - Có trách nhiệm hỗ trợ kinh phí từ nguồn vốn Quỹ cho Bên B để thực đề tài theo quy định Điều - Trên sở báo cáo tình hình thực đề tài cơng văn đề nghị cấp kinh phí hỗ trợ Bên B, Bên A tổ chức xem xét, kiểm tra, xác nhận khối lượng cơng việc hồn thành kinh phí thực đề tài theo quy định - Sau nhận báo cáo, kiến nghị số kinh phí đề nghị cấp tốn đồn kiểm tra, vịng 30 ngày Quỹ phát triển khoa học công nghệ Quốc gia xem xét cấp tốn kinh phí hỗ trợ cho Bên B - Trong trường hợp Bên B không thực nội dung nghiên cứu ghi thuyết minh, chứng từ chi không hợp lệ, hợp pháp, không đảm bảo đủ vốn cần thiết để thực đề tài cam kết Hợp đồng, Bên A có quyền khơng cấp kinh phí đơn phương chấm dứt Hợp đồng Quyền trách nhiệm cuả Bên B: - Được hưởng ưu đãi lợi ích thu từ kết nghiên cứu khoa học theo Nghị định 119/1999/NĐ-CP ngày 18/09/1999 Chính Phủ - Cam kết thực đề tài theo nội dung tiến độ ghi Thuyết minh đề tài, báo cáo kết đạt theo phụ lục 1,2 kèm theo Hợp đồng - Phối hợp tạo điều kiện cho Bên A việc kiểm tra, xác nhận khối lượng cơng việc hồn thành xem xét tính hợp lệ, hợp pháp chứng từ toán - Có trách nhiệm ứng trước kinh phí để thực nội dung duyệt hỗ trợ kinh phí từ ngân sách Nhà nước huy động đủ kinh phí từ nguồn vốn khác để thực đề tài cam kết Kinh phí ứng trước Bên A cấp tốn cho Bên B sau Bên B thực đầy đủ nghĩa vụ theo quy định, cụ thể hố cơng văn số 32 /QKHCNQG ngày 22/8/2008 Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia việc hướng dẫn thủ tục cấp kinh phí hỗ trợ doanh nghiệp theo Nghị định 119/1999/NĐ-CP - Có trách nhiệm tổ chức hạch toán kế toán theo quy định hành Nhà nước, kinh phí chi thực đề tài phải hạch toán cụ thể, rõ ràng Giám đốc doanh nghiệp chủ nhiệm đề tài chịu trách nhiệm việc sử dụng kinh phí Nhà nước hỗ trợ mục đích, chế độ tốn kinh phí trung thực, xác - Có trách nhiệm gửi báo cáo định kỳ, báo cáo tổng hợp, báo cáo sử dụng kinh phí cho Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia công văn đề nghị cấp kinh phí hỗ trợ (theo mẫu quy định tại công văn số 32/QKHCNQG ngày 22/8/2008) để Bên A làm xem xét cấp kinh phí hỗ trợ lý Hợp đồng kết thúc - Có trách nhiệm phối hợp với bên A để thành lập Hội đồng nghiệm thu sau kết thúc đề tài Đề tài có kết nghiệm thu “ đạt” bên A xem xét cấp tốn kinh phí đợt cuối - Trong trường hợp quan quản lý chức phát Bên B sử dụng kinh phí sai mục đích, Bên A thơng báo thu hồi kinh phí hỗ trợ trước Trong vịng 30 ngày kể từ nhận thơng báo Bên A, Bên B phải có trách nhiệm trả lại kinh phí theo yêu cầu Điều Điều khoản chung Hai Bên cam kết thực điều khoản ghi Hợp đồng có trách nhiệm hợp tác giải vướng mắc phát sinh trình thực Mọi thay đổi nội dung Hợp đồng coi hợp lệ có thoả thuận văn Bên Hai Bên có trách nhiệm bảo mật thông tin thuộc đề tài theo quy định Mọi tranh chấp phát sinh trình thực Hợp đồng bên thương lượng hoà giải để giải Trường hợp khơng hồ giải giải Toà án kinh tế Thành phố Hà Nội Phán Toà án định cuối buộc hai Bên phải thi hành Hợp đồng làm thành 10 có giá trị nhau, Bên A giữ 06 bản, Bên B giữ 04 Hợp đồng có hiệu lực từ ngày ký ĐẠI DIỆN BÊN A ĐẠI DIỆN BÊN B GIÁM ĐỐC QUỸ PHÁT TRIỂN KH&CN QUỐC GIA (Ký tên đóng dấu) CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI (Ký tên đóng dấu) Lê Văn Đơng Phan Hồng Sơn CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký ghi rõ họ tên) Đào Thế Hải PHỤ LỤC (Kèm theo Hợp đồng số: 25 /2009/HĐKHCN-DN) Bảng DANH MỤC TÀI LIỆU TT TÊN TÀI LIỆU SỐ LƯỢNG Báo cáo định hình thực 04 đề tài - Tháng… - Tháng… CHI CHÚ Theo biểu mẫu hướng dẫn Báo cáo tổng kết khoa học 05 công nghệ đề tài Theo biểu mẫu hướng dẫn Báo cáo kết thực đề tài 05 sau nghiệm thu Theo biểu mẫu hướng dẫn Bảng DANH MỤC SẢN PHẨM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TT TÊN SẢN PHẨM SỐ LƯỢNG CHỈ TIÊU KINH TẾ - KỸ THUẬT Quy trình sản xuất chế phẩm HN-LBS 01 Chính xác, HĐKH chun ngành thơng qua Quy trình kiểm nghiệm sản phẩm 01 Chính xác, HĐKH chuyên ngành thông qua Tiêu chuẩn sở chế phẩm HNLBS Quy trình sử dụng bảo quản chế phẩm Chế phẩm HN-LBS Chính xác, HĐKH chun ngành thơng qua 01 5000 kg Chính xác, HĐKH chuyên ngành thông qua TCCS GHI CHÚ PHỤ LỤC (Kèm theo Hợp đồng số: 25 /2009/HĐKHCN-DN) Bảng NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC TT NỘI DUNG, CÔNG VIỆC CỤ THỂ SẢN PHẨM PHẢI ĐẠT THỜI GIAN THỰC HIỆN C¸c chđng vi sinh vËt : - Thuéc c¸c gièng 07 /2009 -12 / 2009 Thu thập VSV tiềm Bacillus (nguồn vật liệu cho nghiên cứu) Thuộc giống Lactobacterium - Thu thập chñng vi sinh vËt - Thuéc gièng nÊm men - Phân lập vi sinh vật Saccharomyces mẫu thức ăn lên men truyền thống, sản phẩm dợc, chế phẩm vi sinh vËt Chän läc c¸c chđng vi sinh vËt Chän läc c¸c chđng vi sinh vËt cã sù sinh trởng 8/2009 - 02/ 2011 cần cho sản xuất : phát triển tốt - Thuộc gièng Bacillus Thuéc gièng Lactobacterium - Thuéc gièng nÊm men Saccharomyces Nghiên cứu công thức phối hợp chủng vi sinh vật dùng - Công thức phối hợp 2/2010 - 12/ 2010 s¶n xt chÕ phÈm chđng vi sinh vật - Xác định công thức phối hợp tốt Nghiên cứu công thức HN LBS 4/2010 - Phối hợp Probiotic với tổ hợp vi Công thức chế phẩm HN sinh vật đà đợc chọn lọc để t¹o - LBS 12/2010 Hồng liên – Ngơ thù du Đại hoàng - Mộc hương Hoàng liên - Mộc hương 12 11 11 10 Mộc hương – Ngô thù du Mộc hương – Ngũ bội 11 Qua bảng nhận thấy kết hợp hai loại đơng dược tác dụng kháng khuẩn có tăng lên Đặc biệt tác dụng hỗ trợ hai loại đông dược mà hai loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột E.coli Salmonella bị kháng mạnh Từ kết thu chúng tơi thấy sử dụng hai tổ hợp đơng dược Đại hồng - Hồng liên – Ngũ bội để phối chế công thức chế phẩm H-N L.B.S IV.Kết luận Qua kết thí nghiệm chúng tơi xây dựng cơng thức sản phẩm H-N L.B.S gồm có thành phần sau: Các chủng vi sinh vật: Chủng Bacillus subtilis – BD1a Chủng Bacillus licheniformis – BN1b Chủng Streptococcus lactis – BA 2c Chủng Saccharomyces cereviseae – BN 1a Thành phần đơng dược Hồng liên Đại hồng Ngũ bội 23 CHUYÊN ĐỀ V NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH Để sản xuất chế phẩm phải tuân thủ theo quy trình chung chặt chẽ Một quy trình vận dụng sản xuất phải trải qua trình nghiên cứu thừ nghiệm khơng phịng nghiên cứu mà cịn phải thực thực tiễn sản xuất thời gian dài tốn nhiều cơng Để có quy trình chung sản xuất cần tiến hành: - Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm - Nghiên cứu xây dựng quy trình kiểm nghiệm sản phẩm - Nghiên cứu xây dựng quy trình sử dụng bảo quản chế phẩm A NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM H-N L.B.S Để sản xuất chế phẩm H-N L.B.S cần tiến hành theo bước sau: - Sản xuất bột chế phẩm vi sinh vật - Sản xuất bột đông dược - Phối chế bột chế phẩm vi sinh vật với bột đông dược số thành phần bổ sung khác Trong bước săn xuất bột chế phẩm vi sinh vật cần phải tuân thủ theo quy trình xây dựng chặt chẽ Cho nên nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm H-N L.B.S xây dựng quy trình sản xuất bột chế phẩm vi sinh vật I Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu bước cụ thể quy trình sau: Giống gốc Mơi trường dịch thể Nhân giống cấp I Mổi trường dịch thể Nhân giống cấp II Môi trường dịch thể Nhân sản xuất Lên men Dịch lên men Bột Hấp phụ Lên men Bột lên men 24 Sấy khô Thành phẩm II Phương pháp nghiên cứu 2.1 Nghiên cứu nhân giống cấp I Các giống vi sinh vật để sản xuất chế phẩm Chủng Bacillus subtilis – BD1a Chủng Bacillus licheniformis – BN1b Chủng Saccharomyces cereviseae – BN 1a Nhân giống môi trường chuẩn: Nấm men môi trường Han-Sen Vi khuẩn Bacillus môi trường L.B Vi khuẩn môi trường L.B.S Sử dụng lượng giống gốc cấy vào môi trường 5.106, 106 10 106/ml, nuôi cấy máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút, nhiệt độ 27, 32, 370C thời gian 24, 36 48 Xác định lượng giống thích hợp, nhiệt độ ni cấy thích hợp thời gian ni cấy thích hợp qua việc đếm số lượng tế bào sau thời gian nuôi cấy 2.2 Nghiên cứư nhân giống cấp II V.K Lactic nhân môi trường: Glucoza 50g Pepton 10g Cao nấm men 3g CaCO3 3g Nước 1lít Vi khuẩn Bacillus nhân môi trường: Pepton 10g Cao thịt 3g NaCl 5g Nước lít Nấm men nhân mơi trường: Đường 50g Pepton 5g 25 (NH4)2SO4 3g KH2PO4 3g Nước 1lít Sử dụng tỷ lệ giống cấp I cấy vào môi trường 5%, 7% 10%, nuôi cấy có sục khí, nhiệt độ xác định nuôi cấy cấp I thời gian 24, 36 48 Xác định lượng giống cấy thích hợp thời gian ni cấy thích hợp qua việc đếm số lượng tế bào sau thời gian nuôi cấy 24, 36 48 2.3 Nghiên cứu nhân sản xuất V.K Lactic nhân môi trường: Gia đỗ 100g CaCO3 3g Đường 50g Pepton 5g Nước 1lít Vi khuẩn Bacillus nhân môi trường: Gia đỗ 100g Pepton 10g NaCl 5g Nước 1lít Nấm men nhân môi trường: Đường 50g Pepton 3g (NH4)2SO4 5g MgSO4 3g KH2PO4 3g Nước 1lít Sử dụng tỷ lệ giống cấp II cấy vào môi trường 5%, 7% 10%, ni cấy có sục khí, nhiệt độ xác định nuôi cấy cấp I thời gian 24, 36 48 Xác định lượng giống cấy thích hợp thời gian ni cấy thích hợp qua việc đếm số lượng tế bào sau thời gian nuôi cấy 24, 36 48 2.4 Nghiên cứu hấp phụ chất lên men Các chất dùng để hấp phụ gồm có loại: Bột ngơ, Cám gạo, bột Sắn, bột thóc nghiền Dùng loại bột tiến hành hấp phụ dịch sau lên men thời điểm xác định trên, theo tỷ lệ dịch men/cơ chất 40%, 35% 30% Sau trộn máy, bột hấp phụ đóng vào bao, để hở sau 2-3 buộc kín, lên men thời gian 24 giờ, nhiệt độ xác định 32oC 26 Xác định số lượng tế bào 2.5 Nghiên cứu chế độ sấy Bột hấp phụ sau lên men đưa vào sấy hai chế độ nhiệt 50oC 55oC độ ẩm 12% Xác định thời gian sấy số lượng tế bào III Kết nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu nhân giống cấp I Xác định sinh trưởng chủng vi sinh vật nhân giống cấp I nhiệt độ khác Kết xác định số lượng tế bào sau 24 nuôi cấy trình bầy bảng 5.1 Bảng 5.1 Số lượng tế bào nuôi cấy nhiệt độ khác sau 24 nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy (Co) 27oC 320C Dịch lên men 370C Số lượng tế bào (106/ml) 24 giờ 24 giờ 24 Vi khuẩn Bacillus BD1a 10,4 108,6 10,4 232,5 10,4 223,4 BN1b 10,7 98,4 10,7 229,4 10,7 231,8 11,3 117,7 11,3 224,8 11,3 235,3 10,8 99,6 10,8 227,5 10,8 223,8 Vi khuẩn lactic BA 2c Nấm men BN 1a Qua kết bảng cho thấy, sinh trưởng chủng vi sinh vật nhiệt độ 27 C thấp nhất; sinh trưởng nhiệt độ 32oC 37oC coi tương đương Do đó, sản xuất sử dụng nhiệt độ nuôi cấy chủng vi sinh vật mức 32oC thích hợp, đạt số lượng tế bào cao chi phí lượng để đảm bảo nhiệt độ cần thiết giảm Xác định lượng giống cấy thích hợp Xác định ảnh hưởng lượng giốn cấy ban đầu khác đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật nhân giống cấp I, kết biểu số lượng tề bào sau 24 nuôi cấy nhiệt độ 32oC, trình bày bảng 5.2 Bảng 5.2 Số lượng tế bào nuôi cấy với lượng giống cấy ban đầu khác D ịch l ên men Số lượng tế bào (106 /ml) 27 5,1-5,7.106/ml 7,1-7,5.106/ml 10,1-10,5.106/ml BD1a 228,5 235,8 237,9 BN1b 221,4 229,7 231,6 232,8 238,6 239,2 217,5 226,8 233,5 Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn lactic BA 2c Nấm men BN 1a Qua bảng nhận thấy số lượng tề bào đạt cấy với lượng giống khoảng 5.106/ml thấp nhất, cao cấy với lượng giống khoảng 10.106/ml Tuy nhiên, khác biệt số lượng tế bào cấy với số lượng giống khoảng 7.106/ml không lớn Do vây, sản xuất dùng lượng giống cấy vào mơi trường giới hạn từ – 10.106 C.F.U/ml thích hợp Xác định thời gian ni cấy thích hợp Kết theo dõi sinh trưởng nuôi cấy chủng vi sinh vật 32oC, sau thời điểm nuôi cấy khác trình bày bảng 5.3 Bảng 5.3 Số lượng tế bào sau nuôi cấy thời điềm khác Số lượng tế bào (106 /ml) D ịch lên men 24 36 48 BD1a 7,5 231,8 242,2 245,9 BN1b 7,3 229,7 234,6 237,6 8,4 238,6 248,7 239,2 8,7 226,8 234,6 233,5 Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn lactic BA 2c Nấm men BN 1a 28 Qua bảng nhận thấy, sinh trưởng nhanh vi sinh vật khoảng thời gian từ đến 24 Trong khoảng thời gian từ 24 đến 48 tốc độ tăng trưởng vi sinh vật giảm rõ rệt thể số lượng tế bào tăng lên Qua ta thấy vi sinh vật sau 36-48 nuôi cấy bắt đầu chuyển dần sang giai đoạn ngừng sinh trưởng (giai đoạn ổn định) Do đó, 36 48 vi sinh vật đạt số lượng tế bào lớn chưa xác định thời điểm ni cấy thích hợp tế bào giai đoạn khơng trẻ, có sức sống cao nhu tế bào lúc 24 Điều cần phải kiểm chứng nhân giống cấp II xác định thời gian ni cấy thích hợp 3.2 Nghiên cứu nhân giống cấp II Xác định thời điểm cấy chuyển tiếp từ nhân giống cấp I sang nhân giống cấp II.Cấy chuyển tiếp giống từ cấp I sang cấp II thời điểm: sau 24 giờ, 36 48 nuôi cấy Kết xác định số lượng tế bào vi sinh vật men giống cấp II, sau 24 ni cấy trình bày bảng 5.4 Dịch lên men Số lượng tế bào (106/ml) lúc Số lượng tế bào (106/ml) sau 24 I II III Vi khuẩn Bacillus BD1a 7,8 228,6 221,8 217,9 BN1b 8,1 226,8 219,7 207,6 7,4 234,3 228,6 219,2 8,7 221,5 212,8 203,5 Vi khuẩn Lactic BA2c Nấm men BN 1a Ghi chú: I Giống cấp I sau 24 ni cấy cấy chuyển sang cấp II II Giống cấp I sau 36 nuôi cấy cấy chuyển sang câp II III Giống cấp I sau 48 cấy cấy chuyển sang cấp II Kết bảng cho thấy chuyển từ giống cấp I sang cấp II chủng vi sinh vật phát triển với số lượng nhân giống cấp I Khi cấy chuyển sang cấp II dùng men giống cấp I sau 24 ni cấy số lượng tế bào ví sinh vật thu giống cấp II cao số lượng tế bào cấy chuyển dùng men giống cấp I sau 36 48 nuôi cấy Điều cho thấy vào số lượng tế bào sinh nhiều hay mà phải vào sức sống tế bào để định cấy chuyển Kết ơtreen cho thấy cấy chuyển 29 lúc 24 sau ni cấy có số lượng tế bào giai đoạn 36 48 tế bào trạng thái trẻ có sức sống cao nên phát triển mạnh Như vậy, cấy chuyển từ cấp men sang cấp men khác nên thực sau 24 nuôi cấy đạt hiệu tốt 3.3 Nghiên cứu nhân sản xuất Xác định môi trường để nhân sản xuất Kết trình bầy bảng 5.5 Bảng 5.5 Số lượng tế bào môi trường nuôi cấy sản xuất Dịch lên men Số lượng tế bào (106/ml) lúc Số lượng tế bào (106/ml) sau 24 Môi trường I Môi trường II Vi khuẩn Bacillus BD1a 7,8 223,5 221,7 BN1b 8,1 220,6 217,6 7,4 228,4 225,5 8,7 219,4 217,7 Vi khuẩn Lactic BA2c Nấm men BN 1a Khi nhân sản xuất sô lượng tế bào tăng thấp so với nhân giống cấp II môi trường, nhiên chênh lệch khơng lớn So sánh hai mơi trường nhânh thấy sử dụng môi trường thay cao men giá đỗ đạt số lượng tế bào gần ngang bằng, cho phép sử dụng mơi trường để nhân giống sản xuất chi phí giảm Qua kết bảng có để định tiêu chuyển đển giám định chất lượng sản phẩm theo công đoạn 3.4 Nghiên cứu hấp phụ chất lên men Nghiên cứu chất dùng hấp phụ Kết nghiên cứu dùng bột ngơ, cám gạo, bột sắn, bột thóc nghiền làm chất hấp phụ, theo tỷ lệ dịch men/cơ chất 35%, nuôi cấy nhiệt độ 32oC 24 trình bày bảng 5.6 30 Bảng 5.6 Số lượng tế bào nuôi cấy môi trường khác Dịch lên men Số lượng tế bào (106/g) nuôi cấy môi trường sau 24 Bột ngơ Cám gạo Bột thóc nghiền Bột sắn BD1a BN1b Vi khuẩn Lactic 20,8 202,3 212,2 210,6 193,7 197,4 189,6 183,8 BA2c Nấm men BN 1a 207,4 215,4 203,2 191,4 212,3 223,5 216,9 197,6 Vi khuẩn Bacillus Qua kết cho thấy vi sinh vật phát triển tốt môi trường Sự chênh lệch số tế bào nuôi cấy môi trường khác nhâu thật không lớn, điều cho phép lựa chọn môi trường để nhân sản xuất Sử dụng môi trường cám ủ có số lượng tế bào lớn, nhiên thực tế khó kiểm sốt chất lượng cám gạo điều quan trọng không dễ tan nước dễ bị oxi hoá sinh mùi khét khơng dùng Vậy có thề dùng bột ngơ bột sắn làm mơi trường thích hợp Xác định tỷ lệ men dùng dùng bột hấp phụ Các dịch lên men sản xuất 24 tiến hành cho bột sắn vào hấp phụ theo tỷ lệ dịch men khác Kết trình bày bảng 5.7 Bảng 5.7 Số lượng tế bào sau 24 nuôi cấy môi trường bột sắn hấp phụ với tỷ lệ dịch men khác Dịch lên men Số lượng tế bào (106//g) hấp phụ với tỷ lệ dịch lên men khác 30% 35% 40% 31 Vi khuẩn Bacillus BD1a 191,2 189,6 181,4 BN1b 180,5 183,8 179,8 189,6 191,4 185,3 202,3 197,6 189,7 Vi khuẩn Lactic BA2c Nấm men BN 1a Kết cho thấy hấp phụ với tỷ lệ men 30% 35% có số lượng tế bào sau lên men cao sấp sỉ nhau, sản xuất sử dụng tỷ lệ men phối hợp men 30% lợi hấp phụ lượng bột lớn thời gian sấy rút ngắn độ ẩm thấp 3.5 Nghiên cứu chế độ sấy Các bột hấp phụ với tỷ lệ dịch men 30% lên men sau 24 đem sấy thử nghiệm Kết theo dõi chế độ sấy bột lên men để sản xuất chế phẩm, trình bày bảng 5.8 Bảng 5.8 Thời gian sấy số lượng tế bào bột lên men sau sấy khô Nhiệt độ sấy 50oC Bột hấp phụ lên men Thời gian sấy (phút) Độ ẩm (%) BD 1a BN 1b BA 2c BN 1a Nhiệt độ sấy 55oC Số lượng T,B Thời gian (106CFU/g) sấy (phút) Độ ẩm (%) 238,8 51 phút 12,2 247,3 235,2 263,8 Số lượng T,B (106CFU/g) 219,7 43 phút 12,1 221,7 198,6 225,1 32 Sấy nhiệt độ 55oC, thời gian sây khô nhanh số tế bào sống lại thấp so với nhiệt độ 50oC Từ kết chọn chế độ sấy cho sản phẩm bột lên men 50oC Sau có thành phần bột lên men vi sinh vật dùng sản xuất chế phẩm H-N L.B.S, tiến hành phối trộn với bột đông dược theo tỷ lệ xác định thành phần khác có chế phẩm H-N L.B.S B NGHIÊN CỨU QUY TÌNH KIỂM NGHIỆM VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM Qua nghiên cứu quy trình sản xuất thí nghiệm nêu phần trên, chúng tơi xác định quy trình kiểm nghiệm xác định tiêu chất lượng sản phẩm Quy trình kiểm nghiệm: Nhân giống cấp I: Thời điểm lấy mẫu 24 sau nuôi cấy Số tế bào đạt được: 220.106/ml – 240.106/ml Nhân giống cấp II: Thời điểm lấy mẫu 24 sau nuôi cấy Số tế bào đạt được: 215.106/ml – 230.106/ml Nhân giống sản xuất: Thời điểm lấy mẫu 24 sau nuôi cấy Số tế bào đạt được: 210.106/ml – 225.106/ml Nhân giống cấp I: Thời điểm lấy mẫu 24 sau nuôi cấy Số tế bào đạt được: 220.106/ml – 240.106/ml Hấp phụ lên men: Thời điểm lấy mẫu 24 sau nuôi cấy Số tế bào đạt được: 180.106/ml – 200.106/ml Kiểm tra bột men sấy khô: Độ ẩm đạt 12-12,3% Số tế bào đạt được: 234.106 260.106/g Chỉ tiêu chất lượng sàn phẩm H-N L.B.S Độ ẩm chế phẩm: 12±0,3% Trong 1g chế phẩm có: Bacillus subtilis 1,45.108 Bacillus licheniformis 1,38.108 Streptococcus lactic 1,22.108 Saccharomyces cereviseae 9,83.107 Thành phần đông dược 400mg C NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN Xác định liều lượng chế phẩm H-N L.B.S sử dụng đề phịng bệnh 33 Thí nghiệm theo dõi tỷ lệ mắc bệnh phân trặng sử dụng liều lượng chế phẩm H-N L.B.S khác để phòng bệnh Kết trình bày bảng 5.9 Bảng 5.9 Tỷ lệ mắc bệnh phân trắng Liều lượng H-N L.B.S (g/con/ngày) 0,3 Số lợn theo dõi (con) 54 Số lợn bị bệnh (con) 22 Tỷ lệ mắc bệnh (%) 40,74 0,4 55 17 30,90 0,5 57 13 22,80 0,6 56 11 19,64 0,7 55 11 20,00 1,0 (Đ.C) 55 23 41,82 Kết cho thấy sử dụng chế phẩm H-N L.B.S có tác dụng phịng bệnh So sánh thấy nồng độ 0,5, 0,6 0,7 hiệu phịng bệnh tốt Như sử dụng chế phẩm H-N L.B.S với liều lượng 0,5-0,7 g/con/ngày đề phịng bệnh Tuy nhiên cần phải xác định nồng độ có hiệu để hướng dẫn cho người sử dụng, tiếp tục theo dõi tỷ lệ mắc bệnh nhiều ổ lợn sinh sử dụng nồng độ 0,5-0,7g/con/ngày chế phẩm H-N L.B.S, so với biện pháp phịng bệnh mà trang trại chăn ni dùng Kết trình bày bảng 5.10 Bảng 5.10 Thời gian bảo hộ Đối chứng Nội dung theo Liều lượng H-N dõi L.B.S (g/con/ngày) 0,5 0,6 0,7 42 44 45 44 10 10 11 11 Tổng thời gian bảo hộ (ngày) 24 23 23 29 Thời gian bảo hộ bình quân (ngày) 2,40 2,30 2,09 2,64 Số theo dõi (con) Số bị bệnh (con) Kết cho thấy hai liều sử dụng 0,5 0,6 lợn có thời gian bảo hộ dài; thời gian bảo hộ dài dùng kháng sinh trại Điều nói lên chế phẩm H-N L.B.S giúp cho vật chậm bị mắc bệnh mà sử dụng kháng sinh Song vấn đề quan trọng chế phẩm H-N L.B.S có hiệu làm giảm tỷ lệ mắc bệnh 34 so với việc sử dụng kháng sinh nồng độ cho hiệu cao Kết theo dõi tỷ lệ mắc bệnh phân trắng đàn lợn trình bày bàng 5.11 Bảng 5.11 Tỷ lệ mắc bệnh phẩn trằng lợn Liều lượng H-N L.B.S (g/con/ngày) Số lợn theo dõi (con) Số lợn bị bệnh (con) Tỷ lệ mắc bệnh (%) 0,5 43 10 23,25 0,6 44 10 22,72 0,7 45 11 24,44 Đ.C 44 11 25,00 Qua kết cho thấy chế phẩm H-N L.B.S có tác dụng phịng bệnh tơt bệnh lợn phân trắng, dùng để thay kháng sinh chăn ni lợn nái Ở hai liều lượng 0,5 0,6 cho hiệu tốt chúng tơi xác định liều sử dụng đạt hiệu cao kinh tế 0,5g/con/ngày Nhưng giảm dần hoạt tính vi sinh vật đơng dược q trìh bảo quản xem xét tăng liều sử dụng lên Xác định liều lượng chế phẩm H-N L.B.S sử dụng để điều trị bệnh Sử dụng chế phẩm H-N L.B.S với liều 1,5g, 2,0g 2,5g để điều trị/con/ngày, so sánh với việc dùng kháng sinh để điều trị Kháng sinh sử dụng dung dịch tiêpm Np – Enroflox 10% Công ty TNHH Thương mại Sản xuất Thuốc Thú Y Napha, lọ 100ml Thành phần: Enrofloxacin 10g Dung môi vừa đủ 100ml Enrofloxacin kháng sinh tổng hợp nhóm hệ II Có hoạt phổ kháng sinh rộng mạnh với nhiều loại vi khuẩn gram âm dương Kết điều trị trình bầy bảng 5.12 35 Diễn giải Liều H-N L.B.S dùng điều trị (g/con/ngày) Đ.C 1,5 2,0 2,5 Số lợn điều trị (con) 26 26 26 26 Số lợn (con) 20 26 25 24 76,92 100,00 96,15 92,30 Số tái phát (con) 2 Tỷ lệ tái phát (%) 15 7,7 8,0 29,17 Thời gian điều trị trung bình (ngày) 3,2 2,8 2,1 1,7 khỏi Tỷ lệ khỏi (%) Kết cho thấy liều dùng 2,0 2,5g/con/ngày cho kết điều trị khỏi bệnh cao, tỷ lệ tái phát thấp So với dùng kháng sinh để trị thời gian điều trị có dài tỷ lệ khỏi cao tỷ lệ tái phát thấp Khi dùng liều 2,5g/con/ngày hướng dẫn liều sử dụng đạt hiệu 2,0-2,5g/con/ngày Xác định thời gian bảo quản sử dụng Kết xác định biến đổi chât lượng chế phẩm H-N L.B.S sau thời gian bảo quản thông qua việc xác định biến đổi số lượng tế bào nấm men độ ẩm chế phẩm, trình bày bảng 5.12 Bàng 5.12 Ảnh hưởng thời gian bảo quản tới chất lượng chế phẩm Nấm BN 1a Số lượng tế bào (106CFU/g) sau thời gian bảo quản (ngày) men 15 30 45 60 9,76 9,62 9,7 9,57 9,39 36 Chế phẩm HN L.B.S Độ ẩm chế phẩm (%) sau thời gian bảo quản (ngày) 15 30 45 60 12,2 12,2 12,2 12,4 12,3 Qua bảng nhận thấy độ ẩm chế phẩm sau 60 ngày bảo quản khơng có biến đổi, điều có tác động lớn đến biến đổi số lượng tế bào sống chế phẩm Điển hình nấm men, biến đổi số lượng tế bào nấm men sống không lơn; sau 60 ngày bảo quản số lượng tế bào giảm 0,37.106CFU/g – 3,8% Như xác định điều kiện bảo quản thời hạn sử dụng chế phẩm là: bảo quản nơi khô mát, tránh ánh nắng chiếu trực tiếp thời hạn sử dụng 12 tháng kể từ ngày sản xuất 37 ... trợ kinh phí thực đề tài ? ?Nghiên cứu điều chế chế phẩm HN- LBS để phòng trị bệnh đường ruột lợn giảm ô nhiễm môi trường chăn nuôi lợn. ” 42 MỤC ĐÍCH YÊU CẦU Nghiên cứu chế phẩm mà cơng thức khơng... häc công nghệ đề tài 11 Mục tiêu đề tài : Nghiên cứu điều chế chế phẩm HN- LBS phòng trị bệnh đờng ruột giảm ô nhiễm môi trờng chăn nuôi lợn Tình hình nghiên cứu nớc Tình trạng đề tài: Nghiên cứu. .. nghiệm chế phẩm HN - LBS để phòng bệnh đờng ruột cho lợn giảm ô nhiễm môi trờng chăn nuôi lợn cho đàn lợn thịt nuôi Huyện Văn Giang - Tỉnh Hng Yên Thời gian: Tháng 04 năm 2011 Thử nghiệm chế phẩm HN