MỞ ĐẦU Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt với thách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo. Vấn đề làm sao để tăng sản lượng nông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho con người luôn là mối quan tâm đặc biệt của nhiều quốc gia trên thế giới. Tình hình lương thực bấp bênh còn khá phổ biến ở nhiều nơi. Bên cạnh những nguyên nhân chính như nông nghiệp chưa được coi trọng đúng mức, đất đai chưa được sử dụng hợp lý, thì sâu bệnh, đặc biệt là côn trùng, là một trong những tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng. Theo thống kê của Dean & Adang [65], Oerke & đtg [154], những tổn thất mùa màng nghiêm trọng trên toàn cầu do sâu bệnh gây ra ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13-16%. Mức độ thiệt hại có khi lên tới 70% nếu như cây trồng không được áp dụng các biện pháp bảo vệ. Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học đang được sử dụng để phòng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sức khoẻ con người, vật nuôi. Để cải thiện tình hình này, chúng ta cần ứng dụng những kỹ thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, bền vững. Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Crops, GMOs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạo dòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp. Hơn nữa, các tiến bộ đạt được còn khắc phục được những hạn chế khi sử dụng các biện pháp trừ sâu hoá học cũng như các biện pháp sinh học truyền thống, nâng mức độ an toàn cho con người, vật nuôi và cải thiện môi trường sinh thái. Bằng các kỹ thuật di truyền mới này, triển vọng tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính mong muốn trong thời gian tương đối ngắn đã trở thành hiện thực. Đến nay hàng loạt gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại (gen 1 kháng côn trùng) như gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá các chất ức chế proteaza và ỏ-amylaza… được chuyển vào thực vật nhờ các phương pháp thích hợp với sản phẩm là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh. Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiên cứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện. Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. Với ưu điểm như ít tốn kém, dễ áp dụng trên các đối tượng cây trồng nên phương pháp này rất phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam [1]. Nhiều nơi trên thế giới, kỹ thuật chuyển và biểu hiện gen kháng côn trùng nói riêng và gen có lợi nói chung vào cây trồng thông qua phương pháp này đã và đang là công cụ hỗ trợ chính trong chọn giống thực vật. Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen thực vật mới chỉ bắt đầu, chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Hầu hết các nghiên cứu sử dụng gen chỉ thị và một số gen khác trên các vectơ plasmit được thiết kế sẵn. Tuy nhiên, phần lớn các vectơ tái tổ hợp và các kết cấu gen được các nhà sáng chế và công ty/ cơ quan đăng ký sở hữu trí tuệ dưới dạng các sáng chế hoặc các giải pháp hữu ích. Về khía cạnh sở hữu trí tuệ, để được quyền sử dụng mỗi thành phần trong vectơ tái tổ hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với các nhà sáng chế, cơ quan hoặc công ty sở hữu để ký các hợp đồng chuyển giao nguyên liệu (Material Transfer Agreement, MTA). Qua các hợp đồng này, chúng ta thường chỉ được sử dụng nguyên liệu cho mục đích nghiên cứu với rất nhiều ràng buộc về khía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên cứu, sở hữu, chuyển giao Rõ ràng, để có được những vectơ mang gen tái tổ hợp có giá trị do nước ngoài thiết kế, bên cạnh những chi phí lớn, còn có nhiều khó khăn phức tạp trong chuyển giao nguyên liệu và công nghệ. Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được các vectơ chuyển gen thực vật nói chung và vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để 2 iu khin biu hin gen khỏng cụn trựng nhm mc ớch chuyn v biu hin cỏc gen ny trong cỏc i tng cõy trng nc ta. Trờn c s ý ngha lý lun v thc tin ca hng nghiờn cu ny, chỳng tụi ó tin hnh ti: To chng vi khun Agrobacterium tumefaciens mang gen khỏng cụn trựng chuyn vo cõy trng, vi cỏc mc ớch v ni dung nghiờn cu chớnh sau õy: Mục đích nghiên cứu Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ gen để nghiên cứu các đoạn khởi động đặc hiệu thực vật và gen có hoạt tính kháng côn trùng. Trên cơ sở đó, thiết kế các vectơ Ti-plasmit và tạo chủng A. tumefaciens phục vụ công nghệ chuyển gen nhằm mục đích nâng cao tính kháng sâu bệnh của cây trồng. Nội dung nghiên cứu Su tập và phân lập các đoạn khởi động đặc hiệu thực vật và gen có hoạt tính kháng côn trùng. Thiết kế các vectơ Ti-plasmit mang gen kháng côn trùng dới sự điều khiển của đoạn khởi động cơ định hoặc đoạn khởi động đặc hiệu thực vật trong tế bào E. coli. Tạo các chủng A. tumefaciens mang các vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng. Thiết kế vectơ và biểu hiện gen kháng côn trùng trong tế bào E. coli. Tạo kháng thể kháng protein có hoạt tính diệt côn trùng phục vụ cho nghiên cứu và giám định cây chuyển gen. Những đóng góp mới của luận án Bản luận án này có những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn nh sau: 1. Đã nhân, tạo dòng và đọc trình tự đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza (sucrose synthase) ở giống lúa C71 có khả năng điều khiển sự biểu hiện gen đặc hiệu ở bó mạch. Đây là đoạn khởi động gen đầu tiên đợc phân lập và đọc trình tự từ một giống lúa Việt Nam. Trình tự của đoạn khởi động này đã đợc đăng ký trong các Ngân hàng trình tự gen quốc tế. 3 2. Đã tạo đợc một kết cấu gen mới đó là gen cryIA(c) dới sự điều khiển của đoạn khởi động đặc hiệu bó mạch C71S-P nhằm mục đích chuyển vào các giống lúa Việt Nam tạo khả năng kháng sâu đục thân lúa. 3. Đã thiết kế thành công 4 vectơ Ti-plasmit mới, cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng và nghiên cứu đoạn khởi động. Trong đó, gen cryIA(c) dới sự điều khiển của đoạn khởi động Ubiquitin hoặc đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71 đã đợc đa vào vectơ Ti- plasmit cải tiến và vectơ chuyển gen thế hệ mới nhất sử dụng hệ thống chọn lọc tích cực (Positive Selection System). 4. Đã hoàn thiện và sử dụng phơng pháp xung điện và phơng pháp phối ba bố mẹ để tạo 4 chủng A. tumefaciens mới, trên cơ sở các chủng LBA4404 và EHA105, mang các vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng. 5. Lần đầu tiên trong điều kiện Việt Nam đã thành công trong việc biểu hiện gen cryIA(c) tổng hợp hoá học bằng vi khuẩn E. coli. Protein CryIA(c) tái tổ hợp sau khi tinh chế đã đợc dùng để sản xuất kháng thể kháng CryIA(c) nhằm mục đích sử dụng làm công cụ kiểm tra sự có mặt của sản phẩm gen cryIA(c) ở các cây trồng đợc chuyển gen. 6. Các vectơ Ti-plasmit mới đã và đang đợc Viện Công nghệ Sinh học chuyển vào lúa và các loại cây trồng quan trọng khác. Ngoài ra, 2 chủng A. tumefaciens mới cũng đã đợc chuyển giao cho Viện Nghiên cứu Ngô (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) nhằm triển khai các nghiên cứu hợp tác chuyển gen cry vào cây ngô Việt Nam. 4 Chơng 1. Tổng quan tài liệu 1.1 Vi khuẩn đất A. tumefaciens và phơng pháp chuyển gen vào cây trồng 1.1.1 A. tumefaciens và hiện tợng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên Những năm đầu thế kỷ 20, Smith và Townsend đã phát hiện ở một số cây hai lá mầm xuất hiện những khối u và tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn đất A. tumefaciens. Đến cuối những năm 1960, mối quan hệ giữa khối u và vật liệu di truyền của loài vi khuẩn này đã đợc Braun và Schilperoort khám phá. A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thơng của cây chủ. Trong tự nhiên, A. tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa. Một vài loài cây một lá mầm thuộc họ hành tỏi và thuỷ tiên mẫn cảm yếu với A. tumefaciens [34]. Hoàn toàn khác với mô và tế bào thực vật bình thờng, khối u do A. tumefaciens sinh ra phát triển rất mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh trởng (auxin và cytokinin). Sở dĩ nh vậy vì A. tumefaciens đã chuyển một đoạn ADN (Transfer DNA - T-ADN) sang tế bào thực vật và T-ADN điều khiển quá trình sinh tổng hợp các hợp chất đó. Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp opin là các axit amin (amino acid - aa) đặc biệt và các dẫn xuất của đờng. Dạng opin đợc tổng hợp có thể là nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin và agropin phụ thuộc vào từng chủng Agrobacterium. Trong đó, octopin và nopalin là hai dạng opin phổ biến. Opin đợc vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hoá opin trên plasmit gây khối u thực vật (Tumour inducing plasmid - Ti-plasmit) [44], [109]. Cơ chế phân tử của sự hình thành khối u đã đợc quan tâm nghiên cứu nhằm tìm ra phơng thức phòng trừ bệnh cho cây. Tuy nhiên, khi phát hiện ra Ti-plasmit và khả năng tự chuyển T-ADN vào genom thực vật, ngời ta đã đặc biệt chú ý và khai thác khả năng sử dụng chúng nh một vectơ tự nhiên để chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo cây trồng mang những tính trạng mong muốn [34], [37], [54]. 1.1.1.1 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmit Zaenen & đtg, Đại học Ghent (Bỉ) là nhóm tác giả đầu tiên phát hiện A. tumefaciens mang một cấu trúc di truyền ngoài nhiễm sắc thể chứa hầu hết các gen liên quan đến sự hình thành khối u. Tuy nhiên, họ nghĩ rằng đó là bản sao của một loại virut xâm nhiễm vi khuẩn. Thực tế, yếu tố di truyền này chính là một plasmit khổng lồ với kích thớc khoảng 200 kb. Các chủng vi khuẩn có quan hệ gần gũi, nh 5 vi khuẩn tạo nốt sần ở rễ (Rhizobium trifolii) và ở lá (Phyllobacterium myrsinacearum) cũng có khả năng hình thành khối u ở thực vật khi bị nhiễm Ti- plasmit. Điều đó khẳng định vai trò quan trọng của yếu tố lây nhiễm nằm trên Ti- plasmit đối với sự hình thành khối u ở cây chủ [54]. Ti-plasmit (hình 1.1) đợc tìm thấy ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dới 30 0 C. Đây là một phân tử ADN mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào nh một đơn vị sao chép độc lập. Phân tích di truyền cho thấy, Ti-plasmit dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, đều có 4 vùng tơng đồng, trong đó vùng T-ADN và vùng gây độc (Virulence Region - vùng VIR), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật. Hai vùng còn lại chứa gen mã hoá cho việc sao chép plasmit (Origin of replication) và chuyển nạp (Conjugative transfer) [34]. Trên Ti-plasmit, chỉ có vùng T-ADN đợc chuyển từ vi khuẩn sang genom của cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở đó [87]. Tuy nhiên, vùng này lại không mã hoá những sản phẩm làm trung gian cho quá trình chuyển T-ADN mà cần có sự trợ giúp đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn (chv genes). Vùng VIR dài khoảng 40 kb đảm nhận chức năng gây nhiễm. ở Ti- plasmit dạng octopin, vùng VIR chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do các gen này mã hoá đã kích thích sự tách biệt T-ADN, bao bọc che chở và giúp chúng tiếp cận với genom của cây chủ. Ngoài các gen vir, các gen trên nhiễm sắc thể của A. tumefaciens (nh chvA và chvB) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của A. tumefaciens vào thành tế bào thực vật [34], [109]. 6 Hình 1.1. Bản đồ Ti-plasmit dạng octopin 1.1.1.2 Cấu trúc và chức năng của đoạn T-ADN Trong genom của cây bị khối u, số lợng bản sao của T-ADN dao động từ một vài đến hơn 10. Chúng có thể nằm trên cùng một locut hoặc tách rời và gắn với các vùng khác nhau trên genom thực vật một cách ngẫu nhiên. ở cà chua, 7 đoạn T- ADN đã gắn vào 5 nhiễm sắc thể thực vật, trong khi ở Crepis capillaris, T-ADN chỉ đợc tìm thấy trên 3 nhiễm sắc thể [109]. Kết quả phân tích trình tự gen trên T-ADN ở các Ti-plasmit khác nhau cho thấy, T-ADN đợc giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần nh hoàn toàn từ khoảng 25 bp và gọi là đoạn biên. Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển và xâm nhập của T-ADN vào tế bào thực vật. ở đoạn biên phải (Right Border - RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T-ADN. Đoạn biên trái (Left Border - LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T-ADN và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thờng [147], [152]. ở Ti-plasmit dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genom thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi, ở Ti-plasmit dạng octopin, đoạn T-ADN này chỉ dài 13 kb. ở một số mô thực vật, khối u lại chứa một đoạn ADN kích thớc 8 kb [208]. T-ADN mang rất nhiều gen nh: (1) Các gen mã hoá những enzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u nh tms1, tms2, tmr mã hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin [34], [109]. 1.1.1.3 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Các tế bào cây bị tổn thơng sẽ tiết ra các hợp chất dẫn dụ hoá học vi khuẩn nh acetosyringon, -hydroxy-acetosyringon. Dới tác dụng của các hợp chất này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Quá trình này đợc sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và đoạn biên phải, trái [32], [34]. Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng VIR hoạt động và tăng cờng biểu hiện. Khi vi khuẩn xâm nhiễm tế bào thực vật qua vết thơng, sản phẩm gen virA sẽ nhận biết sự có mặt và tơng tác với các phân tử acetosyringon rồi truyền thông tin ngoại bào này vào trong tế bào dẫn đến sự hoạt động của các protein VirG. Tiếp theo, VirG lại kích hoạt các gen gây độc khác nh virB, virC, virD và virE cũng nh tăng cờng mức độ phiên mã của virG [34], [44], [144]. Sau đó, virD hỗ trợ quá trình tách T-ADN thành hai sợi đơn. Một sợi sẽ chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5' đi trớc. Sợi đơn còn lại sẽ làm khuôn để tổng hợp nên sợi ADN bổ sung mới. Trong quá trình di chuyển, sợi ADN đơn đợc gắn với 7 protein VirE để chui qua rất nhiều màng trớc khi vào đợc đến nhân tế bào thực vật. Protein VirB nằm trên màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp T-ADN sợi đơn sang tế bào thực vật (hình 1.2) [209], [210]. Quá trình chuyển T-ADN này gần giống với quá trình tiếp hợp ở vi khuẩn, trong đó protein VirB tơng đơng với yếu tố F, hoạt động nh một cầu nối chuyển gen. Sau khi T-ADN qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với genom thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên. Tại đó, các gen trên T-ADN, nhờ sự điều khiển của gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u. Hình 1.2. Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật [208] 1.1.2 Công nghệ gen thực vật và kỹ thuật chuyển gen nhờ A. tumefaciens 1.1.2.1 Hệ thống chuyển gen nhờ A. tumefaciens Nhìn chung, hệ thống chuyển gen này bao gồm các giai đoạn: (i) Chuyển vùng T-ADN vào genom thực vật; (ii) Biểu hiện gen quan tâm (Gene of Interest) trong tế bào thực vật; (iii) Tái sinh tế bào thực vật thành cây hoàn chỉnh. Những yếu tố quan trọng và cần thiết cho hệ thống chuyển gen này bao gồm: (1) Các gen vir; (2) Đoạn biên phải và trái; (3) Vùng T-ADN: ngoài hai đoạn biên, hầu hết các gen trên T-ADN có thể đợc loại bỏ và thay thế bằng các gen quan tâm để chuyển vào cây trồng. Đoạn T-ADN đợc cải biến di truyền này gọi là T-ADN bị vô hiệu hoá (disarmed T-DNA), mất chức năng gây khối u; (4) Vùng mang các yếu tố điều khiển cis: nh đoạn khởi động và đoạn kết thúc hỗ trợ và điều khiển sự biểu hiện các gen; (5) Các gen chỉ thị chọn lọc [71]. 8 Các loại vectơ Ti-plasmit nhân tạo: Ti-plasmit tự nhiên có kích thớc quá lớn nên rất khó để sao chép ở mức phân tử cũng nh không đơn giản để tiến hành chuyển gen. Mặt khác, chúng lại chứa các gen tổng hợp hoocmon sinh trởng thực vật và opin không cần thiết và gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không đợc dùng trực tiếp làm vectơ. Trên cơ sở này, Ti-plasmit đã đợc nghiên cứu cải biến nh cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng (Multi Cloning Site - MCS) tạo hai hệ thống vectơ chuyển gen hiệu quả: vectơ liên hợp (co- integrate vector) và vectơ hai nguồn (binary vector) [197]. Nhờ vậy, cây trồng đợc biến nạp Ti-plasmit cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát triển bình thờng [66], [90]. a) Vectơ liên hợp: đợc xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tơng đồng nằm trên plasmit vi khuẩn (nh vectơ của E. coli) với vùng T-ADN trên Ti-plasmit của A. tumefaciens. Trong đó, ngời ta giữ lại vùng VIR, loại bỏ vùng mã hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn ADN mới trong Ti-plasmit (hình 1.3). Nh vậy, có ba loại vectơ tham gia vào hệ thống vectơ liên hợp: (1) Ti-plasmit: các gen gây khối u đã bị vô hiệu hoá bằng cách thay thế vào đó gen kháng kanamycin của vi khuẩn (Hệ thống vectơ SEV) hoặc một đoạn trình tự của vectơ pBR322 (Hệ thống vectơ pGV); (2) Vectơ trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thớc nhỏ và đợc sử dụng để bổ trợ chức năng không u việt của Ti-plasmit (kích thớc lớn và thiếu vùng MCS). Chúng đợc nhân lên trong E. coli và chuyển sang A. tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp. Do không thể sao chép trong A. tumefaciens nên chúng mang những đoạn ADN tơng đồng với T-ADN. (3) Vectơ trợ giúp: tồn tại trong E. coli, có kích thớc nhỏ, chứa các gen di động (mobilization) và gen chuyển (transfer) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển gen vào A. tumefaciens [197]. Khi tiếp hợp, Ti-plasmit và vectơ trung gian đã xảy ra quá trình tái tổ hợp, gen quan tâm đợc chuyển từ E. coli sang vùng T-ADN của A. tumefaciens để tạo ra cấu trúc T-ADN liên hợp. Nh vậy, vectơ liên hợp thờng bao gồm các thành phần chính: (1) Các vị trí tạo dòng thích hợp; (2) Các gen vir; (3) Đoạn biên phải và trái; (4) Gen quan tâm; (5) Chỉ thị chọn lọc vi khuẩn hoạt động trong E. coli và A. tumefaciens; (6) Chỉ thị chọn lọc thực vật; (7) Vùng sao chép trong E. coli [186]. Vectơ pGV3850 là một vectơ liên hợp điển hình do Zambryski & đtg [207] thiết kế. Các gen gây khối u trên Ti-plasmit dạng nopalin (C58) đã bị loại bỏ và thay thế bằng pBR322. Gen quan tâm đợc tạo dòng trong pBR322 và đợc đa vào vùng T-ADN của pGV3850 thông qua quá trình tái tổ hợp với sự trợ giúp của pGJ28 và pR64drd11 trong tế bào E. coli GJ28. Ngoài pGV3850, hàng loạt vectơ liên hợp khác cũng đã đ- ợc sử dụng nh pMON200, pMON273, pGV831 9 Mặc dù, vectơ liên hợp đợc thiết kế cho phép sự tái tổ hợp đặc hiệu vị trí dựa trên hệ thống tái tổ hợp của phagơ P1 (nh thế hệ wP1/ oxP-Cre), nhng vectơ này ít đ- ợc sử dụng, do: (i) Những trình tự tơng đồng rất dài giữa Ti-plasmit và plasmit của E. coli gây khó khăn khi thao tác và sử dụng; (ii) Hiệu quả chuyển gen thấp với số lợng bản sao của vectơ rất ít [197]. Hình 1.3. Sơ đồ vectơ liên hợp b) Vectơ hai nguồn: Trên cơ sở phát hiện vùng VIR không cần nằm trên cùng một plasmit với vùng T-ADN mà vẫn điều khiển đợc sự chuyển và xâm nhập của T- ADN vào genom thực vật, ngời ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống chuyển gen thực vật nhờ vectơ hai nguồn trong đó vùng T-ADN và vùng VIR nằm trên hai plasmit khác nhau nhng trong cùng một chủng A. tumefaciens. Có hai loại vectơ đ- ợc sử dụng trong hệ thống vectơ hai nguồn: (1) Plasmit nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng chứa gen quan tâm trên T-ADN, đoạn biên phải và trái, chỉ thị chọn lọc và sao chép trong E. coli và A. tumefaciens, chỉ thị chọn lọc thực vật; (2) Ti-plasmit trợ giúp: nằm trong A. tumefaciens, với toàn bộ vùng VIR đợc giữ lại nhng loại bỏ hoàn toàn vùng T-ADN và đoạn biên phải, trái (hình 1.4) [104], [105]. 10 [...]... không mẫn cảm với sự xâm nhiễm của A tumefaciens Hiệu quả chuyển gen thấp cũng có thể do sự cản trở trong quá trình biến nạp nh: sự dẫn dụ hoá học của A tumefaciens với các tế bào thực vật bị tổn thơng, sự gắn kết của A tumefaciens vào tế bào thực vật, sự cảm ứng của những phân tử nhận biết ở thực vật với các gen vir, sự sao chép T-ADN, sự chuyển và xâm nhập của T-ADN vào genom thực vật [192] Mặc dù... lọc thực vật nh gen kháng kanamycin, gentamycin; (5) Ngoài ra, pPZP còn chứa đoạn lacZ với vùng MCS của pUC18 nằm giữa đoạn biên phải và gen chọn lọc thực vật [90] pBECK2000: có chứa đoạn biên phải và trái tổng hợp nhân tạo và gen bar Hơn nữa, chúng sử dụng hệ thống tái tổ hợp đặc hiệu vị trí phagơ P1 Cre/ lox P cho phép quá trình chuyển và xâm nhập gen chọn lọc và gen quan tâm vào genom thực vật. .. Trong số rất nhiều cây chuyển gen thu đợc, có khoảng 35% cây mang 1 bản sao của gen chuyển, còn lại mang từ 2 đến 4 bản sao [102] Vijayachandra & đtg đã tập trung nghiên cứu khả năng cảm ứng của các mô lúa với các gen vir nhằm tìm ra loại mô thích hợp nhất 14 để chuyển gen vào lúa [192] Riazuddin & đtg đã sử dụng vectơ chứa gen cryIA(c) dới sự điều khiển của Ubi-P và gen hpt để chuyển vào lúa tạo khả... proteaza của thực vật không gây ảnh hởng đến proteaza của bản thân chúng mà chỉ ức chế hoạt động proteaza của vi khuẩn và động vật Rất có thể đây là cơ chế tự nhiên của thực vật nhằm bảo vệ mô tế bào khỏi bị tổn thơng do côn trùng gây hại và mầm bệnh tấn công Các chất ức chế đối với proteaza dạng serin và cystein có rất nhiều trong hạt và các mô dự trữ của thực vật Chúng có khả năng diệt nhiều loài sâu hại. .. các gen tự nhiên của vi khuẩn trong thực vật thờng rất thấp, không đủ để bảo vệ cây trồng chống lại một số loài sâu hại chính [25], [64] Một trong những nguyên nhân là gen ở vi sinh vật nói chung và ở vi khuẩn Bt nói riêng có tỉ lệ Adenin/ Timin (Adenyl/ Thymin) khá cao, trong khi mã giàu Adenin/ Timin rất hiếm gặp ở thực vật Do vậy, thực vật 25 không có nhiều ARN vận chuyển phù hợp với mã di truyền của. .. tích, thử nghiệm và quản lý kỹ lỡng Nhờ sự hỗ trợ và chuyển giao, một số nớc đang phát triển đã nhận đợc những công nghệ tạo cây trồng biến đổi di truyền Với nỗ lực của toàn nhân loại, tơng lai của vấn đề phòng chống sâu bệnh cho cây trồng chứa đựng nhiều hứa hẹn 34 Chơng 2 vật liệu và phơng pháp 2.1 vật liệu và hoá chất, thiết bị máy móc 2.1.1 Vật liệu Vật liệu thực vật: Chúng tôi đã sử dụng giống lúa... Những điểm chính bao gồm vai trò quan trọng của kanamycin, neomycin trong chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn ở ngời và sự phát triển rộng khắp của quần thể vi khuẩn kháng chất kháng sinh Tuy nhiên, sự an toàn của các gen kháng kháng sinh nh nptII dới sự điều khiển của các đoạn khởi động đặc hiệu thực vật của Calgene đã đợc nghiên cứu chứng minh và đợc Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dợc phẩm Mỹ (US Food and Drug... trình tự T-ADN mang 2 gen khác nhau để chuyển vào lúa và đã thu đợc rất nhiều thể biến nạp, trong đó đã chứng minh đợc sự xâm nhiễm và phân ly của T-ADN ở thế hệ R0 và R1 [124] Nhờ kỹ thuật chuyển gen hiệu quả này, gen quan tâm có thể dễ dàng đợc chuyển vào genom thực vật và đợc điều khiển biểu hiện ở những mô, cơ quan đặc biệt trong những giai đoạn phát triển nhất định Số lợng gen quan tâm đợc tạo... là mục tiêu nghiên cứu của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới ở nớc ta, những vấn đề này cũng đang bắt đầu đợc tiếp cận nghiên cứu nhằm chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình thiết kế vectơ để chuyển vào cây trồng [2], [9] b) Cải biến vùng mang mã của gen kháng côn trùng nhằm tăng hiệu quả biểu hiện trong thực vật Hầu hết gen kháng côn trùng đợc sử dụng trong công nghệ gen thực vật có nguồn gốc từ vi... rất nhiều, thiệt hại do côn trùng gây hại thực vật vẫn chiếm hơn 10% tổng sản lợng hàng năm [35] Ngoài ra, quần thể sâu hại có khả năng kháng thuốc trừ sâu hoá học đã tăng lên hơn 500 loài [126] Vì vậy, hớng chiến lợc thiết kế vectơ mang gen kháng côn trùng đã mở ra triển vọng mới trong công nghệ chuyển gen nhằm tạo cây trồng tự kháng sâu bệnh Rất nhiều loài cây trồng đã nhận đợc gen kháng côn trùng . sự gắn kết của A. tumefaciens vào tế bào thực vật, sự cảm ứng của những phân tử nhận biết ở thực vật với các gen vir, sự sao chép T-ADN, sự chuyển và xâm nhập của T-ADN vào genom thực vật [192] một plasmit với vùng T-ADN mà vẫn điều khiển đợc sự chuyển và xâm nhập của T- ADN vào genom thực vật, ngời ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống chuyển gen thực vật nhờ vectơ hai nguồn trong đó vùng T-ADN. sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u. Hình 1.2. Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật [208] 1.1.2 Công nghệ gen thực vật và kỹ thuật chuyển gen