Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu các Týp của Helicobacter pylori và sự biểu lộ Protein P53 ở bệnh nhân ung thư dạ dày
1 MéT Sè CH÷ VIÕT T¾T ADN Acid Desoxyribo Nucleic BC§NTT B¹ch cÇu ®a nh©n trung tÝnh BN BÖnh nh©n CagA Cytotoxin associated gene A Cagpai Cytotoxin associated gene Pathogenicity island DSR DÞ s¶n ruét ELISA Enzym linked immunosorbent assay HP Helicobacter pylori IL Interleukin LS Lo¹n s¶n MT p53 Mutant type p53 PCR Polymerase chain reaction TB TÕ bµo UTDD Ung th− d¹ dµy VacA Vacuolating associatede cytotoxin gene A VDD Viªm d¹ dµy VMT Viªm m¹n teo WTp53 Wild type p53 2 ĐặT VấN Đề Trong số các bệnh ung th xuất hiện khắp thế giới, UTDD đứng hàng thứ t trong các loại ung th và khoảng 2/3 các trờng hợp UTDD mới xẩy ra ở các nớc đang phát triển. Tại Việt nam, bệnh đứng hàng đầu trong các loại ung th đờng tiêu hoá. Các yếu tố nguyên nhân và bệnh sinh UTDD còn cha đợc làm sáng tỏ hoàn toàn: yếu tố ngoại sinh (chế độ ăn; HP), yếu tố nội sinh (nhóm máu và sự thay đổi gen). Đặc biệt trong những thập kỷ gần đây ngời ta nhắc đến vai trò của Helicobacter pylori trong bệnh sinh UTDD. Tổ chức y tế thế giới năm 1994 đã xếp HP vào trong nhóm I- các tác nhân gây ung th ở ngời. Các nghiên cứu dịch tễ cho thấy HP đợc coi là nguyên nhân của 30% trờng hợp UTDD tại các nớc phát triển và 50% trờng hợp UTDD tại các nớc đang phát triển. Mối liên quan giữa HP và UTDD đã đợc thiết lập và bàn cãi hơn 10 năm nay, nhng ngời ta vẫn nhận thấy rằng, trong số những ngời nhiễm HP thì 15% sẽ phát triển thành các bệnh lý dạ dày hành tá tràng và chỉ có 1% phát triển trở thành UTDD. Để giải thích đợc điều này, các tác giả trên thế giới đang tập trung nghiên cứu vào yếu tố gây bệnh của vi khuẩn HP: CagA, VacA, trong đó protein VacA, protein CagA là những tác nhân gây bệnh rất quan trọng. Phần lớn các nghiên cứu đều cho thấy, nhiễm một số týp HP có độc lực cao, kết hợp cùng với yếu tố cơ thể chủ, các thay đổi về di truyền thì có nguy cơ UTDD rất cao. Trong số các thay đổi về di truyền, p53 là biến đổi sinh học phân tử thờng gặp nhất trong bệnh lý ung th. Hơn 95% các đột biến gen p53 là đột biến sai nghĩa gây ra những phá huỷ protein p53 là nguyên nhân của gần 50% ung th ở ngời trong đó có UTDD. Các nghiên cứu phát hiện thấy protein p53 trong 26,3-64% UTDD. Nh vậy, HP, p53 và sự phối hợp cả 2 yếu tố trên có vai trò nh thế nào trong bệnh lý UTDD- đó là một vấn đề lớn đang làm cho các tác giả trên thế giới băn khoăn. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu các týp của Helicobacter pylori và sự biểu lộ protein p53 ở bệnh UTDD nhằm mục đích: 3 1.Tìm hiểu tỷ lệ týp HP mang gen CagA, VacA và sự phân bố các týp này trong bệnh lý UTDD tại bệnh viện Bạch mai. 2.Tìm hiểu sự biểu lộ protein p53 ở các BN UTDD có và không nhiễm HP. Những điểm mới về mặt khoa học và giá trị thực tiễn của đề tài 1.Đa ra nhận xét về nhiễm các týp HP trong UTDD nh: tỷ lệ HP CagA (80,9%) với OR=4,68; tỷ lệ VacA (97,6%) với OR= 37,27 lần; HP trong UTDD chủ yếu là týp I (78,6%) và thờng gặp ở týp ruột; không gặp týp II. Đây là một trong những cơ sở để đánh giá vai trò các týp HP trong bệnh lý UTDD và xem xét chỉ định điều trị diệt trừ HP CagA(+) ở những BN khó tiêu không loét. 2.Đa ra nhận xét về biểu lộ protein p53 trong bệnh UTDD: p53(+) là 51,2%. Không có liên quan giữa protein p53 với bệnh UTDD. Không có liên quan giữa nhiễm HP kết hợp với protein p53 ở bệnh UTDD. 3. UTDD còn phổ biến ở Việt nam, nhiễm HP cũng thờng gặp, đề tài đã đóng góp những hiểu biết mới về bệnh sinh UTDD để có những biện pháp kiểm soát căn bệnh này trong tơng lai. Cấu trúc luận án Luận án gồm 122 trang, với 26 bảng, 13 biểu đồ, 11 hình và 14 ảnh minh hoạ. Có 178 tài liệu tham khảo gồm: 12 tài liệu tiếng Việt, 16 tài liệu tiếng Pháp, 150 tài liệu tiếng Anh. Ngoài phần đặt vấn đề và kết luận, luận án gồm 4 chơng Chơng 1-Tổng quan 35 trang Chơng 2-Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 17 trang Chơng 3-Kết quả nghiên cứu 33 trang Chơng 4-Bàn luận 33 trang 4 Chơng 1 Tổng quan 1.1.Nhắc lại một số điểm về UTDD 1.1.1.Dịch tễ học UTDD: trong 4 thập kỷ gần đây, có sự sụt giảm tỷ lệ UTDD mới mắc tại các nớc phơng Tây và châu Mỹ nhng bệnh vẫn là một trong những loại bệnh ung th phổ biến nhất ở châu á và Việt nam. Bệnh thờng gặp ở lứa tuổi trung niên, ngời già, và chiếm u thế ở nam 1.1.2.Các điều kiện tiền ung th dạ dày: loét dạ dày, viêm dạ dày, polyp dạ dày, bệnh Menetrier, dạ dày phẫu thuật. 1.2.Vi khuẩn Helicobacter pylori: thuộc họ Helicobacteraceae, dạng xoắn, bắt màu gram âm 1.2.1.Dịch tễ và cơ chế truyền bệnh: tỷ lệ nhiễm HP thay đổi tùy theo từng nớc: 20-90%, vùng dịch tễ cao: châu á, Nam Mỹ, ấn độ, Trung quốc. Ngời là nguồn chứa HP chính và cách truyền bệnh chủ yếu là giữa ngời với nguời. 1.2.2.Cơ chế gây bệnh: Các lông ở đầu cực và dạng xoắn khuẩn giúp cho HP xâm nhập vào niêm mạc dạ dày. Các yếu tố gây bệnh của HP đợc chú ý nhiều nhất gồm: CagPAI, VacA, các protein tiền viêm. 1.2.3.Các phơng pháp phát hiện HP: phơng pháp xâm phạm (sử dụng mảnh sinh thiết dạ dày): test Urease, mô bệnh học, PCR và phơng pháp không xâm phạm: ELISA, test hô hấp 1.3.Vai trò của HP và các týp HP trong bệnh lý UTDD. 1.3.1.Mối liên quan giữa HP và bệnh UTDD: tỷ lệ nhiễm HP trong UTDD thay đổi từ 60-95%. Nơi có tỷ lệ UTDD lớn, ngời ta phát hiện tỷ lệ cao HP dơng tính. Các nghiên cứu ca bệnh chứng đều cho thấy ngời nhiễm HP có nguy cơ UTDD gấp 6 lần. Có 2 loại UTDD kết hợp vơí HP: ung th biểu mô và u lympho ác tính 5 1.3.2.Liên quan giữa týp HP có gen CagA(+) với UTDD: Cấu trúc của CagA: Gen CagA nằm ở đầu 3 của gen CagPAI và sản phẩm là protein CagA-yếu tố gây bệnh đợc nhắc đến nhiều nhất của HP. Protein CagA có tác dụng kích thích bài tiết IL8, tác động đến hiện tợng chết TB, giảm khả năng sống của TB dạ dày. Vai trò của týp HP CagA: ngời nhiễm HP CagA(+) có nguy cơ UTDD gấp 5-8 lần. Týp HP này gây hiện tợng viêm teo dạ dày đặc biệt là vùng thân vị (do sản xuất IL8), DSR, LS. Đồng thời HP CagA(+) tồn tại trong dạ dày với nồng độ lớn hơn và thời gian lâu hơn 1.3.3.Liên quan giữa týp HP VacA(+) với UTDD Cấu trúc và chức năng của VacA: Gen VacA (vùng s, m) mã hoá protein VacA có cấu trúc giống bông hoa 6 cánh có tác dụng: tích luỹ VacA trong màng nhân TB tạo các hốc, tăng tính thấm màng TB với Fe, Ni, hình thành cực anion trên lớp dính kép Vai trò của týp HP VacA: Nhiễm HP VacAs1, CagA có nguy cơ cao UTDD. Tại Thái lan, ấn độ: UTDD liên quan đến phân týp m2, tại châu Phi là phân týp s1 của VacA 1.3.4.Các týp của HP. Các týp của HP: Xiang là ngời đầu tiên phân loại HP và hiện nay HP đợc chia thành 4 týp: Týp I: CagA(+), VacA(+); Týp II: CagA(-), VacA(-), Týp III: CagA(-), VacA(+); Týp IV: CagA (+), VacA(-). Liên quan giữa các týp HP với UTDD: týp I gây tổn thơng TB biểu mô và VDD nặng(týp I có tác dụng thu hút BCĐNTT, tổng hợp và giải phóng IL8; týp I gây rối loạn hiện tợng thực bào, kích hoạt ĐTB); týp II chỉ đính vào TB. Týp I gây giảm bài tiết axít đến 60% và kích hoạt các yếu tố và các gen đóng vai trò quan trọng trong sự chuyển biến ác tính niêm mạc dạ dày. 1.4.Protein p53. Gen p53(17p13.1) mã hoá protein p53-393axit amin. Khi bị đột biến p53 có thể mất toàn bộ 2 alen hoặc chỉ một alen bị mất 6 đi trong khi alen kia bị đột biến ở một hoặc một vài vị trí dẫn đến đến sự tạo ra protein p53 đột biến hay MTp53. Khi ADN của TB bị tổn thơng, làm kích hoạt protein p53 (WTp53). WT p53 có tác dụng ngừng chu trình phân bào cho đến khi ADN đợc sửa chữa hoặc gây hiện tợng chết tế bào theo chơng trình nếu ADN tổn thơng không thể sửa chữa đợc vì vậy protein p53 có thể coi nh là trạm gác của bộ gen tế bào (guardian genome.). Ngoài ra protein p53 còn có khả năng kích hoạt hay ức chế một số gen khác. 1.5.Vai trò của protein p53 trong bệnh UTDD: Tỷ lệ biểu lộ p53 (+) thay đổi từ 26,3% đến 64% các trờng hợp UTDD (theo các nghiên cứu của Wang, Victorzon, Munig, Maeda ) 1.5.1.Trong UTDD, sự biểu lộ protein p53 liên quan đến sự lan tràn của khối u dạ dày: p53 liên quan đến sự xâm lấn khối u theo các lớp của thành dạ dày và di căn xa. Khi có p53 dơng tính thời gian sống thêm của BN thờng ngắn. 1.5.2Sự xuất hiện MT p53 trong UTDD: MTp53 thờng xuất hiện ở UTDD giai đoạn muộn và thờng gặp ở týp ruột 1.6.Nhiễm HP, sự biểu lộ protein p53 trong bệnh UTDD 1.6.1.Nhiễm HP làm mất sự ổn định bộ gen của TB chủ dẫn đến UTDD và điều trị diệt trừ HP làm cải thiện mức độ VDD, viêm teo, DSR, LS và sự không ổn định của bộ gen. Các BN có tổn thơng tiền ung th thờng liên quan đến nhiễm HP CagA(+) cùng với sự không ổn định của bộ gen, p53 làm tăng nguy cơ UTDD. 1.6.2.HP tác động vào quá trình phân bào và hiện tợng chết TB thông qua trung gian p53. Hiện tợng chết TB tại cổ tuyến gây viêm teo dạ dày và lâu dài dẫn đến UTDD. 1.6.3.HP bằng các con đờng khác nhau hoặc gây ra sự biểu lộ quá mức WTp53 hoặc gây sự xuất hiện MT p53 và kết quả là tăng nguy cơ UTDD. 7 Chơng 2 Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu 2.1.Đối tợng nghiên cứu: Gồm 126 BN: 84 BN đợc chẩn đoán xác định UTDD qua mô bệnh học và 42 BN VDD nhiễm HP. Tất cả BN đều đợc điều trị nội hoặc ngoại trú tại khoa Tiêu hoá và/hoặc khoa thăm dò chức năng bệnh viện Bạch mai từ tháng 4/2000 đến tháng 9/2004. Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh phẩm không đạt yêu cầu đặt ra. Phân nhóm nghiên cứu: 3 nhóm Nhóm I: 42 BN UTDD nhiễm HP Nhóm II: 42 BN VDD nhiễm HP Nhóm III: 42 BN UTDD không nhiễm HP 2.2.Phơng pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu, cắt ngang mô tả và so sánh đối chứng. Cỡ mẫu tối thiểu với nhóm UTDD là 84 (với năng lực nghiên cứu 90%, mức ý nghĩa 5%, 1 bệnh, 1 chứng, dự kiến OR=2, HP/chứng: 65%) 2.2.1.Các bứơc tiến hành. -Khám lâm sàng: BN đợc hỏi bệnh và khám lâm sàng toàn diện, làm bệnh án theo mẫu nghiên cứu. -Nội soi dạ dày tá tràng xác định tổn thơng ung th (phân loại Borrman) hay viêm dạ dày. Sinh thiết 6-8 mảnh: 3-5 mảnh tại khối u: nhuộm HE và hoá mô miễn dịch phát hiện protein p53, 3 mảnh ở hang vị: mô bệnh học và xác định gen CagA, VacA theo phơng pháp PCR -Chẩn đoán UTDD và VDD: qua mô bệnh học. áp dụng phân loại của Lauren 1965 để xem xét mối liên quan giữa HP với 2 týp: týp ruột, týp lan toả. Đánh giá tổn thơng niêm mạc dạ dày qua xét nghiệm mô 8 bệnh học dựa theo phân loại Whitehead 1985: viêm cấp, viêm mạn nông, viêm mạn teo (nhẹ, vừa, nặng), DSR, LS. -Xác định nhiễm HP qua test Urease và mô bệnh học. BN đợc coi là có nhiễm HP khi test Urease và mô bệnh học đều cho kết quả dơng tính 2.2.2.Xét nghiệm phát hiện gen CagA, VacA ở mảnh sinh thiết dạ dày theo kỹ thuật khuyếch đại gen tại labo trung tâm trờng Đại học Y Hà nội -Chỉ có BN HP(+) thì mảnh sinh thiết mới đợc tiến hành làm PCR xác định gen CagA, VacA. -Mẫu sinh thiết đợc giữ trong tủ đông (-70 0 C). Tách chiết ADN từ mảnh sinh thiết dạ dày, mồi (primer) dùng cho gen CagA, VacA và chu trình nhiệt đợc làm theo quy trình của Yamaoka. Thành phần trình tự mồi nh sau. Primer Trình tự (5-3) Số nucleotide Gene CagA-F GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG G 22 CagA-R CTG CAA AAG ATT GTT TGG CAG A 22 CagA 349bp VacA-F ATG GAA ATA CAA CAA ACA CAC 21 HP VacA-R CTG CTT GAA TCG GCC AAA C 19 VacA 259bp Mảnh sinh thiết đợc nghiền nhỏ rồi cho dung dịch tách ADN vào. ADN trong dịch đợc tủa bằng cồn tuyệt đối, ly tâm lấy cặn, rửa cặn, làm khô và hoà tan bằng TE-dung dịch ADN để làm PCR. Dung dịch tham gia phản ứng PCR đợc pha chế từ Ready-To-Go PCR Beads Phản ứng đợc chạy với 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 95 0 C/phút, 52 0 C/phút, 72 0 C/phút. Sản phẩm PCR đợc điện di ngang với agarose 9 1,5% trong TAE 1* trên máy điện di ngang Mupid II(Nhật bản). Sau khi điện di xong, bản thạch agarose đợc nhuộm trong ethidium bromide rồi soi dới tia UV và chụp ảnh. Chứng dơng: HP ATCC 43504(CagA dơng tính, VacA dơng tính) Xác định các týp HP: Týp I: CagA(+), VacA(+); Týp II: CagA(-), VacA(-), Týp III: CagA(-), VacA(+); Týp IV: CagA(+),VacA(-) 2.2.3.Xác định sự biểu lộ protein p53 trên mảnh sinh thiết dạ dày theo kỹ thuật hoá mô miễn dịch tại bộ môn Giải phẫu bệnh trờng Đại học Y Hà nội -Sử dụng các kháng thể đơn dòng kháng các kháng nguyên đặc hiệu áp dụng cho cấc mảnh cắt mô đã chuyển đúc trong paraffin. -Phơng pháp hoá mô miễn dịch với p53: tẩy paraffin tiêu bản, khử peroxidase nội sinh, rửa tiêu bản bằng dung dich TrisBufferSaline, khử các protein không đặc hiệu, các tiêu bản đợc phủ kháng thể chuột kháng p53 của ngời, rửa trong TBS 2 lần, phủ phức hợp Avidin Biotin, rửa TBS 2 lần, phủ dung dịch diaminobenzidine, rửa nớc, nhuộm Hematoxylin, khử nớc, làm sạch tiêu bản, gắn lá kính rồi đọc kết quả dới kính hiển vi quang học -Kết quả: phản ứng dơng tính thể hiện bằng mầu nâu đỏ ở nhân tế bào. Chứng âm là biểu mô lành tuyến dạ dày. Chứng dơng đợc xác định bằng các trờng hợp dơng tính thật trong cùng một lô nhuộm. Những trờng hợp dơng tính giả và âm tính giả đợc loại khỏi nghiên cứu trong quá trình đánh giá. 2.3.Xử lý số liệu: tất cả số liệu thu đợc sẽ xử lý theo các thuật toán thống kê y học trên máy vi tính với chơng trình EPI-INFO 6.04 của tổ chức y tế thế giới năm 1988, và SPSS 11.0 của hiệp hội thống kê Hoa kỳ 10 Chơng 3 Kết quả nghiên cứu 126 BN nghiên cứu gồm: 84 BN UTDD và 42 BN VDD có nhiễm HP; Nhóm I: UTDD nhiễm HP (n=42): nam-31(73,8%), nữ:11(26,2%) Nhóm II: VDD nhiễm HP (n=42): nam-32 (76,2%), nữ -10 (23,8%) Nhóm III:UTDD HP(-) (n=42): nam-26(61,9%), nữ-16 (38,1%) 3.1.Nhận xét về đặc điểm nhóm BN nghiên cứu: -Không có sự khác biệt về tuổi và giới ở 3 nhóm nghiên cứu -Nhóm UTDD: Khối u hay gặp ở hang vị và dạng Borrman III. Theo phân loại Lauren, týp ruột chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả 2 nhóm UTDD. -Nhận xét về tổn thơng niêm mạc dạ dày: viêm mạn teo, DSR, LS ở nhóm UTDD cao hơn so với nhóm VDD (P<0,05). 3.2.Nhận xét về các týp HP ở BN nhiễm HP 3.2.1.Tình trạng nhiễm HP mang gen CagA,VacA ở BN nhiễm HP Bảng 3.1.Tỷ lệ nhiễm HP mang gen CagA, VacA ở nhóm BN HP(+) Nhóm BN CagA(+) CagA(-) VacA(+) VacA(-) p UTDD 34 (80,9%) 8(19,1%) 41(97,6%) 1(2,4%) VDD 20 (47,6%) 22(52,4%) 22(52,4%) 20(47,6%) <0,05 -Tỷ lệ HP CagA(+) ở nhóm UTDD (80,9%) cao hơn tỷ lệ CagA(+) ở nhóm VDD (47,6%)(P<0,05). -Tỷ lệ HP VacA(+) ở nhóm UTDD (97,6%) cao hơn tỷ lệ VacA (+) ở nhóm VDD (52,3%) (P<0,05). [...]... 33,3%) Có mối liên quan giữa týp I của HP với tổn thơng niêm mạc dạ dày: týp I thờng gây nên viêm teo niêm mạc dạ dày kết hợp với DSR, LS 2 .Sự biểu lộ protein p53 và nhiễm HP trong bệnh UTDD -Tỷ lệ protein p53( +) là 51,2% ở các BN UTDD, thờng gặp ở lứa tuổi dới 65 và ở nam giới -Không có liên quan giữa protein p53 với vị trí và tổn thong đại thể khối u Protein p53 hay gặp ở UTDD týp ruột (35,7%) -Không... n=80 NS . già, và chiếm u thế ở nam 1.1.2 .Các điều kiện tiền ung th dạ dày: loét dạ dày, viêm dạ dày, polyp dạ dày, bệnh Menetrier, dạ dày phẫu thuật. 1.2.Vi khuẩn Helicobacter pylori: thuộc họ Helicobacteraceae,. p53 ở bệnh UTDD nhằm mục đích: 3 1.Tìm hiểu tỷ lệ týp HP mang gen CagA, VacA và sự phân bố các týp này trong bệnh lý UTDD tại bệnh viện Bạch mai. 2.Tìm hiểu sự biểu lộ protein p53 ở các. trong bệnh lý UTDD- đó là một vấn đề lớn đang làm cho các tác giả trên thế giới băn khoăn. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu các týp của Helicobacter pylori và sự biểu lộ protein p53