Đang tải... (xem toàn văn)
Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện tại Hà Nội và dịch tễ học phân tử của Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc
bộ giáo dục v đo tạo y tế VIệN Vệ SINH DịCH Tễ TRUNG ƯƠNG ************** NGUYễN VĂN HIếU Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện H Nội v Dịch tễ học phân tử Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc Chuyên ngành : Vi khuẩn học M· sè : 62 72 68 01 tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sü y häc Hμ néi - 2009 c«ng trình đợc hon thnh : Viện Vệ sinh dịch tƠ trung −¬ng Ng−êi h−íng dÉn khoa häc : - PGS.TS Đặng Đức Anh - PGS.TS Trần Thuý Hạnh Phản biện : GS.TSKH Nguyễn Văn Dịp Phản biện : GS.TS Trần quỵ Phản biện : PGS.TS Bùi Khắc Hậu Vào hồi : 00 ngày 15 tháng năm 2009 tìm hiểu luận án : - Th viện Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng - Th viện Quốc gia - Viện Thông tin Th viện Y học trung ơng Những công trình, bi báo đ công bố liên quan đến luận án Nguyễn Văn Hiếu, Hoàng Thuỷ Long, Đinh Hữu Dung (2002), Tìm hiểu vai trò lây truyền vi khuẩn bệnh viện máy trợ hô hấp, Tạp chí Y häc dù phßng, tËp XII, 4(55), tr 17-21 Nguyễn Văn Hiếu, Hoàng Thuỷ Long (2004), Cơ cấu nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn gây viêm phế quản phổi bệnh viện bệnh nhân thông khí nhân tạo, Tạp chí Y học dự phòng, tập XVI, 2+3 (66), tr 55-58 Nguyễn Văn Hiếu, Đặng Đức Anh, Trần Thuý Hạnh, Nguyễn Gia Bình (2007), Tình trạng đa kháng thuốc số chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập đợc bệnh viện Bạch Mai, Y học thực hành, 564, tr 14-15 Nguyễn Văn Hiếu, Đặng Đức Anh, Trần Thuý Hạnh, Nguyễn Gia Bình (2008), Tình trạng đa kháng kháng sinh chủng Acinetobacter spp gây nhiễm trùng bệnh viện, Tạp chí Y học dự phòng, 5(97), tr 18-23 Nguyễn Văn Hiếu, Đặng Đức Anh, Trần Thuý Hạnh, Nguyễn Gia Bình (2008), Tình trạng đa kháng thuốc chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập đợc bệnh viện Hà Nội, Tạp chí Y học dự phòng, 5(97), tr 65-70 Nguyễn Văn Hiếu, Đặng Đức Anh, Trần Thuý Hạnh, Đinh Duy Kháng (2009), Tính đa hình RAPD chủng P.aeruginosa đa kháng thuốc gây nhiễm trùng bệnh viện Hà Nội, Tạp chí Y học lâm sàng, tr 33 39 0 Danh mục chữ viết tắt ATCC CDC ĐTTC MRSA NTBV NTP NTVM NTB NCCLS RAPD VSV VRE WHO American Type Culture Collection, Mỹ Trung tâm kiểm soát phòng chống bệnh tËt Hoa Kú (Centers for Diseases Control and Prevention) §iỊu trị tích cực Tụ cầu vàng kháng methicillin (Methicillin-resistant Staphyloccus aureus) NhiƠm trïng bƯnh viƯn NhiƠm trïng phỉi NhiƠm trïng vÕt mỉ NhiƠm trïng báng đy ban qc gia vỊ tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàng (National Committee for Clinical Laboratory Standards Phân tích đa hình ADN genom nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA) Vi sinh vật Cầu khuẩn đờng ruột kháng Vancomycin (Enterococcus Resistance Vancomycin) Tỉ chøc Y tÕ thÕ giíi (World Health Organization) Mở đầu Đặt vấn đề: Nhiễm trùng bệnh viện có xu hớng gia tăng toàn cầu kỷ 21 chí mức báo động mà tình trạng kháng kháng sinh vi sinh vật ngày gia tăng lan rộng Nhiễm trùng bệnh viện đà làm ảnh hởng đáng kể chất lợng sống bệnh nhân, tăng gánh nặng chi phí cho chăm sóc điều trị Việc lựa chọn véi v· c¸c kh¸ng sinh cã phỉ t¸c dơng réng thay đổi thuốc liên tục điều trị, việc tải bệnh nhân bệnh viện đà làm lên áp lực chọn lọc với chủng vi khuẩn đa kháng thuốc làm xuất héi míi cho nhiƠm trïng ph¸t triĨn Ngn vi sinh vật từ môi trờng bên xâm nhập vào thể VSV gây bệnh ký sinh ë ng−êi Nh÷ng chđng vi khn bƯnh viƯn theo quy luật có tính kháng kháng sinh cao thờng đa kháng Ngày vi khuẩn gây bệnh chủ yếu Staphylococci trực khuẩn Gram (-), trở thành tai hoạ thực cho bệnh viện ngoại khoa; tiết niệu; Khoa hồi sức điều trị tích cực; Khoa chuyên nuôi dỡng trẻ đẻ non trung tâm bỏng Một loài vi khuẩn Gram (-) gây nhiễm trùng bệnh viện phỉ biÕn vµ nguy hiĨm hiƯn lµ Pseudomonas aeruginosa Tốc độ kháng vi khuẩn với nhóm kháng sinh tăng nhanh lan rộng hầu hết sở y tế toàn cầu, ®ã cã ViƯt Nam Víi ý nghÜa thùc tiƠn trªn tiến hành đề tài Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện Hà Nội Dịch tễ học phân tử Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc Mục tiêu nghiên cứu: 2.1 Xác định cấu loài vi khuẩn đa kháng thuốc gây nhiễm trùng bệnh viện Hà Nội 2.2 Xác định tính đa dạng chủng Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc Nội dung nghiên cứu: 3.1 Phân lập định danh loài vi khuẩn gây nhiễm trùng hội bệnh viện 3.2 Xác định tính nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn phân lập đợc với kháng sinh thông dụng 3.3 Xác định phân bố typ huyết tính đa dạng kiểu gen chủng P.aeruginosa đa kháng thuốc phân lập đợc Những đóng góp luận án: 4.1 Xác định tính đa dạng kiểu hình kiểu gen loài P.aeruginosa đa kháng thuốc Hà Nội 4.2 Đề xuất lựa chọn chủng P.aeruginosa phân lập đợc nớc để nghiên cứu sản xuất vắc xin huyết 4.3 Về mặt khoa học, nghiên cứu có phối hợp Miễn dịch học - Sinh học phân tử - RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), để tìm phân bố mối quan hệ di truyền serotyp genotyp chủng P aerugonosa phân lập đợc Hà Nội Bè cơc ln ¸n: Ln ¸n gåm 138 trang, chơng, 238 tài liệu tham khảo, 31 bảng, hình biểu đồ (không kể phần phụ lục, mục lục danh mục chữ viết tắt) 2 Chơng Tổng quan 1.1 Khái niệm định nghĩa nhiƠm trïng bƯnh viƯn NhiƠm trïng bƯnh viƯn lµ mét nhiễm trùng mắc phải (Acquired infection) bệnh viện đợc coi nh nhiễm trùng cục bộ, mặt vào thời điểm bệnh nhân đợc nhập viện Dựa tiêu chuẩn lâm sàng sinh học, có khoảng 50 loại nhiễm trùng khác xảy t¹i bƯnh viƯn Theo Tỉ chøc Y tÕ thÕ giíi (WHO), nhiễm trùng bệnh viện đợc định nghĩa nh sau: " Nhiễm trùng bệnh viện nhiễm trùng mắc phải thời gian điều trị bệnh viện mà thời điểm nhập viện trớc không thấy có u tè nhiƠm khn hay đ bƯnh nµo NhiƠm trïng xuÊt hiÖn sau 48 giê sau nhËp viÖn th−êng đợc coi nhiễm trùng bệnh viện " Tỉ lệ nhiễm trùng bệnh viện gia tăng hầu hết Châu lục vấn đề thách thức chất lợng khám chữa bệnh bệnh viện Theo b¸o c¸o cđa WHO, hiƯn c¸c n−íc ph¸t triĨn có tới - 10% bệnh nhân nằm viện mắc Ýt nhÊt mét lo¹i nhiƠm trïng bƯnh viƯn Tû lƯ nớc phát triển cao gấp từ - 20 lần đà làm tăng đáng kể tỷ lệ tử vong, chi phí cho chăm sóc thuốc điều trị 1.2 Dịch tễ học 1.2.1 Các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện Nguyên nhân nhiễm trùng bệnh viện thờng vi khuẩn gây nên cịng cã thĨ vi rót, nÊm vµ ký sinh trùng, nhng nguyên ký sinh trùng thờng Vi khuẩn gây NTBV vài thập kỷ qua đà có nhiều thay đổi cấu chủng loài, vi khuẩn gây bệnh chủ yếu S.aureus trực khuẩn Gram (-) Nhiễm trùng bệnh viện nấm thờng xuất điều trị kháng sinh kéo dài bệnh nhân suy yếu hệ miễn dịch Vi sinh vật xâm nhập vào thể từ môi trờng bên vi sinh vật ngời VSV gây bệnh hội chủ yếu vi khuẩn Gram (-) Các trực khuẩn Gram (-) gåm Acinetobacter spp, Klebsiella spp, P.aeruginosa, E coli th−êng có liên quan đến NTBV phổ biến bệnh nhân nhiễm trùng phổi Khoa ĐTTC Và khả kháng kháng sinh đà tăng lên đáng kể số liệu pháp điều trị phối hợp kháng sinh 1.2.2 Các yếu tố nguy - Môi trờng: gồm có không khí, nớc môi trờng phục vụ Vi khuẩn không khí chủ yếu cầu khuẩn Gram (+) vi rút lây truyền qua ®−êng kh«ng khÝ nh− vi rót cóm, vi rót ®−êng hô hấp vi khuẩn lao thuỷ đậu Bào tử nấm Aspergillus lan truyền không khí, dễ bị hít phải Nớc nơi chứa số loại vi sinh vật gồm vi khuẩn, vi rút nấm, hệ thống thoát nớc không kín gây rò rỉ làm ô nhiễm môi trờng - Bệnh nhân: Con ngời đóng vai trò nh nguồn vi sinh vật, truyền vi sinh vật cảm thụ vi sinh vật, nhiễm trùng từ ngời sang ngời khác bệnh viện thông qua đồ vật bị nhiƠm bÈn hc cã thĨ vi sinh vËt ký sinh bệnh nhân - Khám điều trị: Tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện liên quan đến qui trình điều trị xâm nhập dụng cụ xâm nhËp chiÕm xÊp xØ 80% tỉng sè c¸c nhiƠm trïng - Kháng sinh: Sử dụng kháng sinh không hợp lý làm tăng chủng vi khuẩn kháng thuốc có phối hợp chọn lọc tự nhiên thay đổi thành phần gen kháng thuốc vi sinh vật 3 1.2.3 Các loại nhiễm trùng Ngày hầu hết nghiên cứu nhiễm trùng bệnh viện cho thấy nhiễm trùng bệnh viện thờng liên quan đến Khoa ĐTTC phổ biến nhiễm trùng phổi, sau ®ã lµ nhiƠm trïng hut, nhiƠm trïng tiÕt niƯu vµ nhiễm trùng vết mổ Bệnh nhân suy giảm hệ miễn dịch, phải sử dụng ống thở, phẫu thuật khí quản, tuổi cao bệnh mạn tính yếu tố thuận lợi dẫn đến nhiễm trùng 4 Chơng đối tợng v phơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tợng nghiên cøu - BƯnh nh©n nhiƠm trïng phỉi (NTP) thë máy bệnh viện Bạch Mai - Bệnh nhân nhiễm trïng báng (NTB) t¹i ViƯn Báng qc gia - BƯnh nhân nhiễm trùng vết mổ (NTVM) bệnh viện Việt Đức - Các chủng vi khuẩn phân lập đợc từ bƯnh phÈm nhiƠm trïng Thêi gian nghiªn cøu: + tõ 12/2005 đến 3/2007 : đọc tài liệu + từ 4/2007 ®Õn 6/2008 : thu thËp vµ xư lý bƯnh phÈm, xử lý số liệu 2.2 Phơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu - Thiết bị phòng thí nghiệm; môi trờng MacConkey, Pseudocel Agar, thạch máu, Endo - Sinh phẩm định danh vi khuẩn : API 20 NE, API 20E 2.2.2 Phơng pháp chọn mẫu - Nghiên cứu ngang mô tả; cỡ mẫu nghiên cứu theo công thức: n = Z2α/2 pq/d2 + Cì mÉu trªn bƯnh nh©n nhiƠm trïng phỉi : 94 bƯnh phÈm + Cì mẫu bệnh nhân nhiễm trùng bỏng : 89 bệnh phẩm + Cỡ mẫu đợc bệnh nhân nhiễm trùng vÕt mỉ : 52 bƯnh phÈm - Tỉng sè bƯnh phẩm cần cho nghiên cứu là: 235 bệnh phẩm 2.2.4 Kỹ thuật định danh vi khuẩn - Sử dụng kít API 20 E: để định danh vi khuẩn đờng ruột trực khuẩn Gram âm dễ mọc - Sử dụng kít API 20 NE: để định danh vi khuẩn không thuộc họ vi khuẩn đờng ruột trực khuẩn Gram âm khác 2.2.5 Kỹ thuật ngng kết kháng hut kh¸ng P.aeruginosa Sư dơng bé hut miƠn dịch P.aeruginosa kháng O đặc hiệu, gồm 16 typ từ O1-> O16 (P1-> P16) đợc sử dụng rộng rÃi quốc gia, Sanofi cung cấp 2.2.6 Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán - Môi trờng làm kháng sinh đồ: Mueller-Hinton Agar; Mueller-Hinton-Chocolate - Khoanh giÊy kh¸ng sinh thư nghiƯm h·ng Sanofi cung cấp - Chủng vi khuẩn đợc hoà vào nớc muối 0,9% tạo huyền dịch có độ đục 0,5 McFland Láng huyền dịch lên mặt đĩa môi trờng Mueller-Hinton, đặt khoanh giấy kháng sinh, ủ ấm 37 0C, 18 24 - Đọc kết quả: đo đờng kính vùng øc chÕ cđa vi khn víi c¸c khoanh giÊy kh¸ng sinh thử nghiệm So sánh với bảng giới hạn độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh, theo tiêu chuÈn cña NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards) 2.2.7 Kỹ thuật RAPD - Chỉ thị ADN (Invitrogen); enzym hạn chế; Taq ADN polymeraza - Các mồi dùng để phát tính đa hình nhân ngẫu nhiên ADN genom (OPA4, OPA10, OPL12) h·ng Invitrogen cung cÊp - Nồng độ ADN đợc xác định đo độ hấp phơ ë b−íc sãng 260nm (A260) nhê m¸y quang phỉ Hewlett Packard (Mỹ) 5 - Mức độ ADN đà tách chiết Độ tinh đợc xác định tỉ số A260/A280 1,8 2.2.7.4 Chu trình phản ứng RAPD Chu tr×nh nhiƯt : 950 - phót, 950C - phót, 310C -1 phót, 720C - (45 chu kú -tõ b−íc ®Õn b−íc 4), 720C - phót, kÕt thóc ë 40C 2.3 Xư lý sè liệu - Phần mềm máy tính MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), version 3.1 NTSYSpc 2.0 đợc sử dụng để phân tích số liệu trình tự kết phản ứng RAPD - Xử lý thống kê t-test phần mềm STATA - Kết khác nghiên cứu đợc xử lý phần mềm Excel 6 Chơng Kết nghiên cứu 3.1 Kết phân lập vi khuẩn Bảng 3.1 Tỷ lệ bệnh phẩm phân lập có nhiƠm khn Cã Kh«ng nhiƠm khn nhiƠm khn NTP 103 ( 87,3) 15 ( 12,7) 118 (100) NTB 126 (100) ( 0,0) 126 (100) NTVM 57 ( 71,3) 23 ( 28,7) 80 (100) BƯnh phÈm Tỉng 286 38 324 (88,3) Tỉng (11,7) (100) KÕt qu¶ (B¶ng 3.1) cho thÊy tỷ lệ bệnh phẩm phát có nhiễm khuẩn 88,3% không nhiễm khuẩn 11,7% Số bệnh phẩm NTB cã tû lƯ ph¸t hiƯn nhiƠm khn cao chiÕm 100%; NTP có tỷ lệ phát nhiễm khuẩn 87,3% NTVB 71,3% Bảng 3.2 Sự phân bố vi khuẩn Gram (-) Kết phân lập Bệnh VK Gr (-) VK Gr (+) NÊm Tæng n % n % n % N % NTP 145 34,6 10 2,4 1,7 162 38,7 NTB 120 28,6 54 12,9 0 174 41,5 NTVM 64 15,3 10 2,4 2,1 83 19,8 Tæng 329 78,5 74 17,7 16 3,8 419 100 phẩm Kết (Bảng 3.2) cho thấy trùc khn Gram (-) g©y nhiƠm trïng bƯnh viƯn th−êng chiếm tỷ lệ cao hầu hết loại nhiễm trïng bƯnh viƯn vµ chiÕm tû lƯ cao nhÊt 78,5%; sau vi khuẩn Gram (+) 17,7% nấm 3,8% Bảng 3.3 Sự phân bố loại vi sinh vật phân lập đợc Nguồn bệnh phẩm Vi sinh vật phân lập đợc NTP NTVM NTB Tổng (N = 419) (n = 162) (n = 174) (n = 83) n n % n % % N % P.aeruginosa 80 19,1 14 3,3 138 32,9 11,2 18 4,3 1,0 69 16,5 Klebsiella spp 24 5,7 1,4 0,95 34 8,1 E.coli 1,9 1,4 20 4,8 34 8,1 Enterobacter spp 12 2,9 0,72 1,9 23 5,5 Vi khuÈn Gr (-) kh¸c 10 2,39 1,7 14 3,3 31 7,4 S.aureus 0,48 44 10,5 0,48 48 11,5 E.faecalis 0,0 1,7 0,0 1,7 Vi khuÈn Gr (+) kh¸c 1,9 0,72 1,9 19 4,5 NÊm kh¸c Gram (+) 10,5 Acinetobacter spp Gram (-) 44 47 1,7 0,0 2,1 16 3,8 419 100 Tæng : KÕt (Bảng 3.3 ) cho thấy số tác nhân vi khuẩn đa kháng thuốc gây NTBV thờng gặp là: P.aeruginosa 32,9%; Acinetobacter spp, 16,5%; S.aureus 11,5%, gặp chủ u ë nhiƠm trïng báng (10,5%); E.coli 8,1%, chđ u ë nhiƠm trïng vÕt mỉ (4,8%) 7 3.2 KÕt qu¶ Định typ huyết chủng P.aeruginosa Bảng 3.4 Sự phân bố typ huyết đơn giá P.aeruginosa phân lập đợc Các typ huyết đơn giá ca chng P.aeruginosa Tổng Sè chñng Khác (N) O1 O2 O4 O5 O6 O8 O11 O12 O15 O16 n 2 15 14 13 14 67 % 0,0 4,4 3,0 3,0 3,0 0,0 22,4 20,9 3,0 19,4 20,9 100 n 3 2 16 0 40 % 10,0 7,5 5,0 7,5 5,0 5,0 15,0 40,0 0,0 0,0 5,0 100 n 0 2 0 % 0,0 0,0 0,0 28,6 0,0 28,6 0,0 14,3 0,0 0,0 28,6 100 N 4 21 31 13 18 114 % 3,5 5,3 3,5 6,1 3,5 3,5 18,4 27,2 1,8 11,4 15,8 100 NTB NTP NTVM Tổng KÕt qu¶ (B¶ng 3.4) cho thÊy typ huyÕt O12 chiÕm tû lÖ cao nhÊt (27,2%); sau ®ã lµ O11 (18,4%); O16 (11,4%) vµ O5 (6,1%) Typ huyết O12 xuất tất loại bệnh phẩm nghiên cứu, nhng gặp chủ yếu bệnh nhân NTP thở máy (14%); sau NTB (12,3%) Typ huyÕt O16 xuÊt hiÖn nhÊt ë bệnh phẩm NTB 3.3 Kết nhạy cảm kháng sinh 3.3.1 Tính nhạy cảm kháng sinh vi khuÈn Gram (-) 78.7 69.3 67.7 57.7 56.2 20 56.6 45.7 Nh¹y 24.0 29.4 25.2 16.4 21.2 21.3 30 39.0 33.4 31.5 31.6 40 58.2 38.9 50 40.4 60.3 40.6 61.8 60 Tû lÖ (% ) 74.7 70.8 67.9 68.4 70 41.2 80 Kh¸ng 10 TIC PIP TZP TCC CTX CAZ IMP TM NET GM AN CIP NOR ATM Kháng sinh thử nghiệm Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Gram (-) Khả kháng kháng sinh vi khuẩn Gram (-) kháng sinh thử nghiệm cao, kết (Biểu đồ 3.1) cho thấy, tỷ lệ kháng với nhóm kháng sinh aminoglycosides từ 39,0% đến 74,7%; dòng cephalosporin cefotaxim ceftazidine kháng 70,8% 61,8%; nhóm quinolones từ 56,6% đến 58,2% 3.3.2 Tính nhạy cảm víi kh¸ng sinh cđa P.aeruginosa 80.0 74.4 70.2 63.6 51.2 36.6 33.6 33.3 23.1 Nhạy Kháng 9.3 20.0 56.1 45.7 49.6 41.1 41.7 45.0 30.0 47.3 58.1 29.0 40.0 30.5 Tû lÖ % 50.0 65.7 57.6 55.0 60.0 74.6 72.0 64.1 33.6 28.0 69.5 70.0 10.0 0.0 TIC PIP TZP TCC CTX CAZ IMP TM NET GM AN CIP NOR ATM Kháng sinh thử nghiệm Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ nhạy cảm kháng sinh P.aeruginosa Kết (Biểu ®å 3.2) cho thÊy tû lƯ kh¸ng víi c¸c kh¸ng sinh thư nghiƯm cđa P.aeruginosa nh− sau: víi gentamicin lµ 74,6%; cefotaxim lµ 74,4%; ticarcillin lµ 69,5%; ceftazidine lµ 64,1% aztreonam 56,1% Một số kháng sinh có tỷ lệ nhạy cao nh piperacillin/tazobactam 70,2%; imipenem 65,7% 3.3.3 Tính nhạy cảm với kháng sinh Acinetobacter spp 100.0 91.1 91.5 89.1 90.0 91.7 91.5 88.1 89.5 89.3 81.7 81.0 78.9 76.3 80.0 21.1 Nhạy Kháng 8.9 10.5 49.2 16.7 6.8 8.5 8.9 20.0 10.9 30.0 45.8 8.3 22.0 40.0 8.5 50.0 49.2 35.6 60.0 17.2 TØ lÖ (%) 70.0 10.0 0.0 TIC PIP TZP TCC CTX CAZ IMP TM NET GM AN CIP NOR ATM Kh¸ng sinh thử nghiệm Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ kháng kháng sinh Acinetobacter spp Kết (Biểu đồ 3.3) cho thấy, hầu hết kháng sinh thử nghiệm đà bị chđng Acinetobacter spp kh¸ng víi rÊt cao C¸c kh¸ng sinh thuộc nhóm - Lactam kháng từ 76,27% đến 81,03%; nhóm cephems kháng 91,53%; nhóm aminoglycosides kháng từ 49,15 đến 91,67%; nhóm quinolon kháng từ 89,29% đến 89,47% kháng imipenem 45,76% 100 3.3.4 Tính nhạy cảm với kháng sinh cña S.aureus 100 96 90 83 83 76 73 76 71 73 71 71 68 TØ lÖ (%) 50 56 57 46 44 50 50 39 E LZN CC NA LEV OX C Te VA AN GM K TM NET CF IMP CAZ TCC CTX TZP AM P 0 Kháng sinh thử nghiệm Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ kháng kháng sinh S.aureus Theo kết (Biểu ®å 3.4) cho thÊy, chđng S.aureus ®· kh¸ng kh¸ cao với nhiều loại kháng sinh thông dụng nh kanamycin tobramycin 83,3%; nhóm cephems kháng từ 71,4% đến 75,6%; gentamicin 71,4%; amikacin 70,7%; imipenem 72,7% Kháng sinh nhạy với chủng S.aureus nh vancomycin 100%; linezolid 95% piperacillin/tazobactam 61% 3.3.6 Tính đa kh¸ng kh¸ng sinh cđa c¸c typ hut chđng P.aeruginosa Bảng 3.5 Tỷ lệ đa kháng kháng sinh typ huyết P.aeruginosa Tình Số chủng phân lập đợc theo typ huyết trạng O5 O6 O8 O11 O12 O15 n=6 (n=7) (n=4) (n=4) (n=2) (n=31) (n=2) kh¸ng Khác (n=11) (n=13 KS (n=26) ) Nhạy hoàn toàn Kháng Tổng O16 O2 (42,9) 0 (4,8) 2 (6,1) 13 (3,2) (7,7) 0 loại KS (50) (50) (3,2) (30,8) (11,4) Số đa 2 20 29 13 16 94 (100) (57,1) (50) (50) (95,2) (93,6) (100) (100) (61,5) (82,5) kh¸ng (2KS) Kết (Bảng 3.5) cho thấy, tình trạng đa kháng với kháng sinh thử nghiệm phổ biến với tỷ lệ 82,5%; kháng với loại kháng sinh 11,4% nhạy hoàn toàn 6,1% Các typ huyết có tỷ lệ đa kh¸ng kh¸ng sinh kh¸c nhau, typ huyÕt O16 cã tỷ lệ đa kháng với kháng sinh thử nghiệm 100%; O11 lµ 95,2% vµ O12 lµ 93,6% 3.4 KÕt RAPD 3.4.1 Tách chiết ADN từ vi khuẩn P.aeruginosa ADN đợc tổng hợp từ vi khuẩn P.aeruginosa đợc tinh sạch, độ ADN đợc kiểm tra phổ hấp phụ tử ngoại điện di gel agaroza 1% Với giá trị A260/A280 dao động từ 1,79 đến 2,06 cho thấy mẫu ADN đợc tách chiết có độ tinh cao 3.4.2 Kết định typ kỹ thuật RAPD Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD thống kê đa hình ADN genom chủng đợc nêu Hình 3.5 (A) (B) (C) (D) (E) Hình 3.5 Phản ứng RAPD với mồi RAPD1 10 Để xác định mối quan hệ di truyền chủng P.aeruginosa, kết đợc tính toán hệ số đồng dạng xây dựng phát sinh chủng loại Kü tht RAPD cã −u ®iĨm thùc hiƯn nhanh, dƠ thực tính đa hình cao Hình 3.6 Cây phát sinh chủng số liệu phản ứng RAPD loại đợc xây dựng 11 Từ phát sinh chủng loại (Hình 3.6) cho thấy từ 87 chủng P.aeruginosa đợc phân tích RAPD đà cho 47 kiểu mẫu RAPD (RAPD pattern) Bảng 3.6 Sự phân bố kiểu RAPD c¸c ngn P.aeruginosa kh¸c Sè KiĨu Ngn P.aeruginosa mÉu P.aeruginosa ph©n tÝch RAPD Sè chđng cã cïng mÉu RAPD I II III IV VI RAPD NTP 22 15 11 NTB 60 35 17 13 NTVM 5 0 0 87 55 33 16 1 (100) (100) (60,0) (29,1) (7,3) (1,8) (1,8) Tỉng KÕt qu¶ (B¶ng 3.6) cho thấy, 87 chủng đợc phân bố 55 mẫu RAPD nguồn bệnh phẩm khác nhau, có mÉu RAPD cã sù trïng ë c¸c bƯnh viện (do phát sinh chủng loại cã 47 mÉu RAPD) Trong ®ã cã 33 mÉu RAPD cã nhÊt chñng (chiÕm 60%); 16 mÉu RAPD cã chñng (chiÕm 29,1%); mÉu RAPD cã chđng (chiÕm 7,3%) vµ mÉu RAPD cã chđng (chiÕm 1,8%) 12 Ch−¬ng bμn luËn 4.1 C¬ cÊu vi khuẩn phân lập đợc Tỷ lệ phân lập có nhiễm khuẩn theo nghiên cứu cho thấy cao đặc biệt bệnh nhân nhiễm trùng bỏng nhiễm trùng phổi (Bảng 3.1) Cơ cấu loài vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện ngày có nhiều thay đổi, vi khuẩn Gram âm nh− P.aeruginosa, Acinetobacter spp, Escherichia coli vµ K pneumoniae cã tû lƯ ph¸t hiƯn cao c¸c bƯnh phÈm nhiƠm trùng 3.3.1 Trực khuẩn Gram âm: đợc coi nh mối lo ngại lớn số tác nhân vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện, bao gồm tỷ lệ mắc mức độ kháng kháng sinh ngày gia tăng Kết (Bảng 3.2) cho thấy tỷ lƯ nhiƠm vi khn Gram (-) lµ rÊt cao (78,5%) phù hợp với nhiều nghiên cứu tác giả nớc nớc xác định trực khuẩn Gram (-) nguyên hàng đầu gây nhiễm trùng hội loài vi khuẩn hay gặp nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt nhiễm trùng phổi thờng phân lập đợc vi khuẩn P.aeruginosa, Acinetobacter spp, E.coli, Klebsiella spp vµ Enterobacter spp 3.3.2 Pseudomonas aeruginosa: lµ tác nhân gây bệnh quan trọng có liên quan nhiều đến nhiễm trùng hộ bệnh viện, theo kết qu¶ b¶ng (3.3) cho thÊy P.aeruginosa chiÕm tû lƯ cao (32,9%), nhiều tác giả cho thấy từ kết minh nh, Phạm Đức Mục (2005) 24,0%; Trơng Anh Th (2008) 28,6%, Nguyễn Văn Hoà (2008) 22,3% điểm đáng lo ngại P.aeruginosa tính nhạy cảm kháng sinh thấp, có carbapenem ceftazidim Tác giả Barsic B CS (2004) tính kháng thuốc P.aeruginosa với imipenem đà tăng lên từ 10,2% đến 22,1%) 3.3.3 Họ Neisseriaceae, loài thờng gặp lâm sàng A.baumannii A.lwofii Khoảng 27 % ngời khoẻ mạnh mang vi khuẩn da 7% có mũi họng Kết nghiên cứu (Bảng 3.3) cho thấy tỷ lệ Acinetobacter spp phân lập đợc cao so với số báo cáo tác giả nớc nớc ngoài, tác giả thống cho Acinetobacter spp nguyên nhân thờng gặp bệnh nhân thông khí nhân tạo Từ nghiên cứu thấy Acinetobacter nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm trùng hội liên quan đáng kể đến tình trạng bệnh cảnh lâm sàng nặng tử vong 3.3.4 Chủng S.aureus: thờng nguyên g©y nhiƠm trïng bƯnh viƯn phỉ biÕn ë bƯnh nh©n bỏng, nhiều nghiên cứu đà cho thấy tỷ lệ S.aureus bệnh nhân nhiễm trùng bỏng cao nhiều so với bệnh nhân nhiễm trùng phổi thông khí nhân tạo Từ kết (Bảng 3.3) cho thấy tỷ lệ S.aureus phân lập đợc cao hẳn nhiễm trùng phổi nhiễm trùng vết mổ Các tác giả nớc nớc đến thống hai loài vi khuẩn thờng gặp bệnh nhân nhiễm trùng bỏng P.aeruginosa S.aureus Các tác giả Đức cho r»ng, với nhiễm trïng phổi liªn quan đến dụng cụ th máy S.aureus ph bin với tỷ lệ 24,2 đến 24,9% 4.2 Sự phân bố typ huyết chủng P.aerugonosa Sự phân bố typ huyết vi khuẩn P.aeruginosa có khác quốc gia khu vực nghiên cứu Các nghiên cứu tác giả nớc trớc đà báo cáo cho thấy typ huyết O12 thờng thấp không có, nhng kết nghiên cứu tỷ lệ typ huyết O12 lại cao (27,2%), sau O11 (18,4%) O16 (11,4%) 13 (Bảng 3.4) Điều gợi ý cho thấy thời điểm nghiên đà có xu hớng thay đổi typ huyết bệnh viện Hà Nội 4.3 Tính nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn Gram (-) Ngày nay, mối quan tâm đặc biệt nhiễm trùng bệnh viện khoảng 70% nhiễm trùng bệnh viện chủng vi khuẩn kháng thuốc Kết (Biểu đồ 3.1), vi khuẩn Gram (-) phân lập đợc có tỷ lệ kháng cao với kháng sinh nh cefotaxim (70,8%) ceftazidine (61,8%) Tác giả Moreno C A (2006) cho 40% vi khuÈn Gram (-) thuéc hä vi khuÈn ®−êng ruét gây nhiễm trùng đờng hô hấp đà kháng với ceftriaxone fluoroquinolones Vi khuẩn Gram (-) gây nhiễm trùng bệnh viện có liên quan đến mức độ bệnh tử vong bệnh nhân nặng kháng thuốc ciprofloxacin rõ rệt 4.4 Tính nhạy cảm kháng sinh cña P.aeruginosa Vi khuÈn Pseudomons aeruginosa th−êng béc lé tÝnh kháng kháng sinh cao thờng đa kháng Sự phát triển đa kháng thuốc P.aeruginosa phân lập đợc đòi hỏi số gen khác chí đột biến thu đợc khác bệnh nhân nhiƠm trïng phỉi vi khn P.aeruginosa th−êng cã bƯnh cảnh lâm sàng nặng tỷ lệ tử vong cao Tác giả Obritsch M.D (2005) cho thấy, chủng P.aeruginosa đa kháng thuốc đà liên tục tăng từ 0,6% đến 32% Kết (Biểu đồ 3.2) cho thấy tỷ lệ P.aeruginosa kháng với nhóm kháng sinh cao, kết tơng đơng với kết nghiên cứu tính kháng thuốc P.aeruginosa gây nhiễm trùng bệnh viện tác giả nớc thời gian gần 29 nớc thuộc châu Âu, chủng vi khuẩn không phổ biến châu Âu 4.5 Tính nhạy cảm kháng sinh Acinetobacter spp Vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem lần Mỹ vào năm 1991 Từ đến nay, nhiễm trùng bùng nổ lan rộng chủng đà xuất hầu hết bệnh viện thuộc nhiều quốc gia giới Kết (Biểu đồ 3.3) cho thấy tỷ lệ đa kháng kháng sinh chủng Acinetobacter spp mức cao cao so với nghiên cứu trớc tác giả nớc nớc Năm 2004, CDC đà báo cáo A baumannii ngày gia tăng trờng hợp nhiễm trùng máu, hầu hết trờng hợp cho thấy đa kháng kháng sinh có vài chủng đà kháng với tất kháng sinh đà thử 4.6 Tính nhạy cảm kháng sinh Staphylococcus aureus Vi khuẩn S aureus kháng methycillin (MRSA) đà vi khuẩn gây rắc rèi nhiƠm trïng bƯnh viƯn B¸o c¸o cđa NNIS dựa số liệu đợc thu thập 1995 2004, tỷ lệ S.aureus phân lập đợc Khoa Điều trị tích cực đà kháng methicillin, oxacillin, nafcillin gần 60% Ngoài S Aureus tác nhân đóng vai trò quan trọng thờng liên quan đến nhiễm trùng vết bỏng Kết (Biểu đồ 3.4) cho thấy, chủng S.aureus đà kháng hầu hết kháng sinh thử nghiƯm víi tû lƯ rÊt cao nh− amikacin 70,7%; gentamicin 71.4%; netilmicin 44%, nhng với vancomycin nhạy 100% Một số tác giả khác đà thực nghiên cứu tÝnh kh¸ng kh¸ng sinh cđa c¸c chđng S.aureus nhiƠm trïng bệnh viện bệnh viện tuyến trung ơng thống tính kháng kháng sinh tăng nhanh thời gian gần đây, nhng cho S.aureus nhạy với vancomycin, từ 98,9% đến 100% 4.7 Tính ®a kh¸ng kh¸ng sinh cđa typ hut chđng P.aeruginosa 14 Kết kháng kháng sinh typ huyết P.aeruginosa với kháng sinh thử nghiệm (Bảng 3.5) cho thấy, hầu hết chủng đà kháng loại kháng sinh Tình trạng đa kháng kháng sinh phổ biến với tỷ lệ 82,5% Tác giả Nguyễn Văn Hiếu (2007) bệnh nhân thông khí nhân tạo cho thấy tỷ lệ đa kháng typ hut lµ chđ u, chiÕm 72,6% vµ tû lƯ nhạy hoàn toàn 9,6% Bouza E (1999), cho thấy typ huyết có tỷ lệ đa kháng cao O1(25,1%); O4 (21,6%) O3 (11,3%) Chi phí cho kháng sinh hàng ngày NTBV khoản phụ trội quan trọng cần đợc giảm thiểu cách sử dụng kháng sinh hợp lý 4.8 Tính đa dạng kiĨu gen cđa c¸c chđng P.aeruginosa Mèi quan hƯ ph¸t sinh chủng loại nhóm VSV đợc trình bày dới dạng hình học gọi phát sinh chủng loại (Hình 3.5) Phân tích mối quan hệ kiểu gen typ huyết (Hình 3.5) cho thấy typ huyết O12 đà phân bố 17 kiểu mẫu RAPD khác nhau; typ huyết O11 đà phân bè ë 15 kiÓu mÉu RAPD; typ huyÕt O16 đà phân bố 10 kiểu mẫu RAPD Vậy, chủng P.aeruginosa đa dạng phenotype mà đa dạng genotype mối liên quan genotype phenotype Khi nghiên cứu chủng P aeruginosa phơng pháp PFGE, nhà khoa học Italy đà cho thấy mối liên quan genotype phenotype, thay đổi phenotype lµ vi khn thÝch øng víi vËt chđ HƯ số đồng dạng chủng thuộc 47 mẫu RAPD dao ®éng tõ 0,40 ®Õn 0,93 Trong ®ã cã 51 chủng có hệ số đồng dạng tơng đối gần ( 0,93), tức mặt di truyền chủng gần Dựa theo thớc đo Simpson, hệ số đồng dạng chủng thuộc 47 kiểu mẫu RAPD dao động từ 0,40 đến 0,93 Nói cách khác 87 chủng P.aeruginosa nghiên cứu đà hình thành nên 47 dòng khác Phân tích mối quan hệ di truyền dựa vào kết phân tích hệ số đồng dạng (Bảng 3.19) cho thấy, 47 dòng cã tíi 27 dßng, gåm 51 chđng cã hƯ sè đồng dạng tơng đối gần ( 0,93) Các chủng thuộc dòng 42, 43, 44, 45 46 có khoảng cách xa so với dòng khác ( 0,87) (Bảng 3.20) Kết nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng đà cho thấy tính đa dạng kiểu hình kiểu gen chủng P.aeruginosa đa kháng thuốc bƯnh viƯn Sù ph¸t hiƯn c¸c chđng cã cïng mÉu RAPD đà góp phần hiểu biết dịch tễ học phân tử chủng P.aeruginosa nhiễm trùng bệnh viện Đặc biệt chủng có mẫu RAPD bệnh viện để có biện pháp chủ động kiểm soát ngăn chặn đờng lây nhiễm 15 kết luận Cơ cấu loài vi khuẩn đa kháng thuốc phân lập đợc 1.1 Căn nguyên vi khuẩn - Vi khuẩn Gram (-) lµ 78,5%; Gram (+) lµ 17,7%; nÊm lµ 3,8% - Vi khuÈn P.aeruginosa 32,9%; Acinetobacter spp 16,5%; S.aureus 11,5%, E.coli 8,1% - Cơ cấu số loài vi khuẩn loại nhiễm trùng có tính đặc tr−ng nh−: + NhiƠm trïng phỉi, Acinetobacter spp 29%; P.aeruginosa 27,2% vµ Klebsiella spp 14,8% + NhiƠm trïng vÕt báng, P.aeruginosa 46,0%, S.aureus 25,3% vµ Acinetobacter spp 10,3% + NhiƠm trïng vÕt mỉ, E.coli 24,1%, P.aeruginosa 16,9% vµ S.aureus 2,4% 1.2 Tính nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn phân lập đợc - P.aeruginosa kháng với gentamicin 74,6%; cefotaxim 74,4%; ticarcillin 69,5%; ceftazidine 64,1% aztreonam 56,1% Kháng sinh có tỷ lệ nhạy cao piperacillin/tazobactam 70,2%; imipenem 65,7%; netilmicin 58,1% ticarcillin/clavulanic acid 57,7% - Acinetobacter spp kháng víi nhãm β – Lactam tõ 76,27% ®Õn 81,03%; cephems 91,53%; aminoglycosides tõ 49,15% ®Õn 91,67%; quinolon tõ 89,29% ®Õn 89,47% imipenem 45,76% - Chủng S.aureus kháng với kanamycin tobramycin 83,3%; nhóm cephems từ 71,4% đến 75,6%; gentamicin 71,4%; amikacin 70,7%; imipenem 72,7% Nh¹y víi vancomycin 100%; linezolid 95% piperacillin/tazobactam 61% - Tỷ lệ đa kháng typ huyết chủng P.aeruginosa 82,5% Typ đa kháng cao O16 (100%), sau O11 (95,2%) O12 (93,5%) Tính đa dạng chủng Pseudomonas aeruginosa 2.1 Sự phân bố typ huyết chủng P.aeruginosa đa kháng thuốc - Typ huyết O12 27,2%; O11 lµ 18,4%; O16 lµ 11,4% vµ O5 (6,1%) - Typ hut O12 ë bƯnh nh©n nhiƠm trïng phỉi lµ 14%; nhiƠm trïng báng lµ 12,3% - Typ hut O11 xt hiƯn nhiỊu nhÊt nhiƠm trïng báng (13,1%) vµ nhiƠm trïng phỉi ( 5,3%) - Typ hut O16 chØ cã ë bƯnh phÈm nhiƠm trïng báng 2.2 Tính đa dạng kiểu hình kiểu gen chủng P.aeruginosa đa kháng thuốc - Phân tích từ 87 chđng P.aeruginosa, cho 47 kiĨu mÉu RAPD (RAPD pattern) KiĨu mẫu RADP nhiễm trùng vết bỏng từ R1R21 từ R33R47 Kiểu mẫu RAPD nhiễm trùng phổi (Bạch Mai) tõ R22 – R33 vµ R4, R6, R7, R8, R12 - Hệ số đồng dạng chủng P.aeruginosa dao ®éng tõ 0,40 ®Õn 0,93 Trong ®ã 51 chđng có hệ số đồng dạng tơng đối gần ( 0,93) Các chủng thuộc dòng 42, 43, 44, 45 46 có khoảng cách xa so với dòng khác ( 0,87) - Typ huyết O12 phân bố ë 17 kiĨu mÉu RAPD kh¸c nhau; typ hut O11 ph©n bè ë 15 kiĨu mÉu RAPD; typ hut O16 ph©n bè ë 10 kiĨu mÉu RAPD VËy, chủng P.aeruginosa đa dạng phenotype genotype mối liên quan genotype phenotype 16 kiến nghị Dựa kết nghiên cứu đợc tiến hành đối tợng có nguy mắc nhiễm trùng bệnh viện Hà Nội, xin đề xuất số kiến nghị nh sau: Để hạn chế tính kháng thuốc ngày gia tăng, trớc điều trị nên tham khảo tính kháng kháng sinh cđa vi khn ë tõng vïng, miỊn vµ khu vực khác Tốt dựa vào kết kháng sinh đồ có điều kiện làm kháng sinh đồ Trên sở kết dịch tễ học di truyền chủng P.aeruginosa đa kháng thuốc cần đầu t tiếp để nghiên cứu, sản xuất huyết vắc xin P.aeruginosa cho dự phòng điều trị cho đối tợng có nguy cao Trong nghiên cứu này, chủng phù hợp cho bệnh nhân bỏng chủng có mẫu RAPD từ R1 đến R21 R33 đến R47; chủng phù hợp cho bệnh nhân nhiễm trùng phổi R22 đến R32 R4, R6, R8, R12; bệnh nhân nhiễm trùng vết mổ R13, R18, R22, R27, R28 ... bệnh vi? ??n Hà Nội Dịch tễ học phân tử Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc Mục tiêu nghiên cứu: 2.1 Xác định cấu loài vi khuẩn đa kháng thuốc gây nhiễm trùng bệnh vi? ??n Hà Nội 2.2 Xác định tính đa. .. typ huyết bệnh vi? ??n Hà Nội 4.3 Tính nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn Gram (-) Ngày nay, mối quan tâm đặc biệt nhiễm trùng bệnh vi? ??n khoảng 70% nhiễm trùng bệnh vi? ??n chủng vi khuẩn kháng thuốc Kết... Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc Nội dung nghiên cứu: 3.1 Phân lập định danh loài vi khuẩn gây nhiễm trùng hội bệnh vi? ??n 3.2 Xác định tính nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn phân lập đợc với kháng