Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu ảnh hưởng của diclodietyl sulfid lên protein, ADN trong cơ vân, gan và tác dụng điều trị của natri thiosulfat và naturenz trên động vật thực nghiệm
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y Nguyễn Quốc Chiến NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DICLODIETYLSULFID LÊN PROTEIN, ADN TRONG CƠ VÂN, GAN VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ CỦA NATRI THIOSULFAT VÀ NATURENZ TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Độc chất Mã số: 62 72 50 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2008 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Bằng Quyền TS. Hoàng Công Minh Phản biện 1: GS. TSKH. Đái Duy Ban Phản biện 2: GS. TS. Đào Văn Phan Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Khắc Hải Luận án đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước, họp tại Học viện quân y vào hồi 14 giờ 00 ngày 14 tháng 7 năm 2008 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện quốc gia - Thư viện Học viện quân y 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Diclodietyl sulfid (DCDS) là chất độc gây chết người thuộc nhóm chất độc gây loét nát, được quân đội nhiều nước trang bị chính thức trong vũ khí hóa học. DCDS được sử dụng nhiều lần từ cuối CTTG lần thứ nhất cho tới tận những năm gần đây, để lại những hậu quả nặng nề. Với khối lượng tồn đọng lớn, theo nhiều chuyên gia, DCDS vẫn có khả năng được sử dụng trong các cuộc xung đột vũ trang. Đặc biệt gần đây xuất hiện một nguy cơ mới là DCDS có thể được dùng vào mục đích khủng bố. Xuất phát từ tính chất nguy hiểm của DCDS, nhiều công trình nghiên cứu về chất độc này đã được tiến hành liên tục ở nhiều nước. Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu về DCDS trong lĩnh vực y - sinh học, song cho đến nay, một số vấn đề về tác động của DCDS vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn. DCDS là tác nhân alkyl hóa gây tổn thương ADN, làm rối loạn tổng hợp protein, rối loạn chuyển hóa, suy mòn. Tuy nhiên, chưa thấy có tài liệu nào công bố chi tiết về những biến đổi hàm lượng và thành phần protein, ADN trong các mô sinh học. Do chưa có thuốc chống độc đặc hiệu nên việc điều trị nhiễm độc DCDS còn gặp khó khăn, chủ yếu vẫn là dùng natri thiosulfat kết hợp với điều trị các tổn thương tại chỗ. Naturenz là một chế phẩm mới được sản xuất từ các nguyên liệu tự nhiên trong nước. Naturenz có tác dụng chống oxy hóa, cải thiện chức năng gan, tăng cường phục hồi cơ quan tạo máu, hạn chế tổn thương do các chất độc hóa học gây nên. Điều này gợi ý cho chúng tôi thử nghiệm sử dụng naturenz để điều trị nhiễm độc DCDS. Từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm: 2 1) Xác định sự biến đổi hàm lượng và thành phần protein, ADN trong mô cơ vân, gan trên động vật nhiễm độc diclodietyl sulfid. 2) Đánh giá tác dụng của naturenz phối hợp với natri thiosulfat trong điều trị nhiễm độc DCDS thông qua sự biến đổi hàm lượng và thành phần protein, ADN trên động vật thực nghiệm. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI : Đề tài có đóng góp mới về mặt khoa học là: 1. Trên chuột nhắt trắng, DCDS gây giảm nhẹ hàm lượng ADN trong gan và cơ; giảm hàm lượng protein trong gan và cơ; giảm hàm lượng nhóm -SH và hoạt độ peroxidase trong gan; gây tổn thương oxy hóa protein thể hiện ở tăng hàm lượng carbonyl protein. Phát hiện một thành phần protein lạ trong cơ vân trên điện di ở ngày thứ nhất sau nhiễm độc. 2. Điều trị theo hướng kết hợp chống oxy hóa bằng naturenz trên động vật nhiễm độc DCDS đã thấy có kết quả tương đối tốt theo sự biến đổi các chỉ tiêu trên. CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN: Luận án gồm 135 trang, có 4 chương (không kể phần đặt vấn đề và kết luận): Tổng quan; Đối tượng và phương pháp nghiên cứu; Kết quả; Bàn luận. Phần kết quả có 27 bảng, 6 ảnh và 12 biểu đồ. Luận án tham khảo tổng cộng 183 tài liệu, trong đó 21 tài liệu tiếng Việt, 7 tài liệu tiếng Nga và 155 tài liệu tiếng Anh. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm chung của chất độc diclodietyl sulfid DCDS, công thức hóa học S(CH 2 -CH 2 Cl) 2 , được trang bị trong VKHH của quân đội nhiều nước do có độc tính cao, xâm nhập cơ thể qua nhiều đường và gây ô nhiễm kéo dài. DCDS gây tổn thương alkyl hóa cho hầu hết các đại phân tử sinh học, trong đó quan trọng nhất là 3 ADN và protein. Gần đây người ta cũng chỉ ra một số con đường trung gian trong cơ chế gây độc như tổn thương oxy hóa thông qua các gốc tự do và giảm các chất chống oxy hóa, chết tế bào theo chương trình, 1.2. Độc động học của diclodietyl sulfid DCDS thâm nhập qua da, niêm mạc khá nhanh và được phân bố toàn thân. Các phản ứng trong cơ thể gồm alkyl hóa trực tiếp, liên hợp, thủy phân và oxy hóa. DCDS được chuyển hóa và thải trừ khá nhanh, chủ yếu qua nước tiểu dưới dạng các thiodiglycol. Có nhiều phương pháp phát hiện DCDS và các sản phẩm chuyển hóa của nó trong mẫu sinh học và môi trường, phổ biến nhất hiện nay là sắc ký khí/khối phổ. Gần đây người ta đã xác định được các ADN và protein bị alkyl hóa. 1.3. Các tổn thương và biểu hiện lâm sàng trong nhiễm độc diclodietyl sulfid Tùy theo liều và đường nhiễm, sau thời gian tiềm ngắn, DCDS gây các tổn thương viêm - hoại tử tại chỗ và bội nhiễm khuẩn, dẫn tới các biểu hiện lâm sàng ở da, niêm mạc mắt và đường hô hấp, và có thể gây tử vong. DCDS hấp thu gây tác động toàn thân gồm các rối loạn chuyển hóa, suy mòn, giảm miễn dịch, đặc biệt tác động mạnh tới các mô tế bào đổi mới nhanh. Gần đây người ta quan tâm nhiều tới các tác động dài kỳ sau nhiễm độc, chủ yếu gồm các rối loạn bệnh lý ở da, mắt, đường hô hấp, thần kinh ngoại vi và gây ung thư. 1.4. Dự phòng và điều trị nhiễm độc diclodietyl sulfid Hiện chưa có thuốc chống độc đặc hiệu; natri thiosulfat được chấp nhận sử dụng làm thuốc chống độc toàn thân. Nguyên tắc chung trong cấp cứu, điều trị nhiễm độc gồm: giảm hấp thu, giảm gánh nặng của cơ thể, và can thiệp vào các cơ chế tác động đã biết. Nhiều thuốc chống oxy hóa, trong đó có naturenz, được khẳng định có hiệu quả trong điều trị nhiễm DCDS (Hoàng Công Minh, 2001; Bhattachrya R., 2006). 4 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng, trọng lượng trung bình 20g. - Chất độc diclodietylsulfid do Học viện Quân y cung cấp. - Thuốc điều trị: natri thiosulfat (Merck); naturenz do Viện Công nghệ sinh học cung cấp dạng viên nén 0,50 g. 2. 2. Phương pháp nghiên cứu - Phân nhóm động vật nghiên cứu: Ngoài số lượng để nghiên cứu thăm dò, số chuột nhắt dành cho nghiên cứu các chỉ tiêu chính được chia thành 4 nhóm với ký hiệu và số lượng như sau: nhóm đối chứng (ĐC, 50 con), nhóm nhiễm độc DCDS không điều trị (DCDS, 100 con), nhóm NĐ điều trị natri thiosulfat đơn thuần (NTS, 100 con), và nhóm NĐ điều trị thiosulfat + naturenz (NTS+Nz, 100 con). - Phương pháp và liều gây NĐ: Chuột được gây nhiễm độc qua da 1 lần với liều 9 mg/kg thể trọng. - Liều thuốc và cách dùng: natri thiosulfat tiêm màng bụng với liều 0,5 g/kg/ngày trong 3 ngày đầu. Naturenz cho uống với liều 250 mg/kg/ngày trong 30 ngày. 2.3. Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp tiến hành - Tỷ lệ động vật sống sót: xác định bằng cách đếm số lượng còn sống vào buổi sáng, tính tỷ lệ %. Thời gian sống trung bình tính trong 30 ngày. Trọng lượng động vật: xác định bằng cách cân chính xác vào buổi sáng. Trọng lượng gan, lách, thận: xác định bằng cách cân chính xác ngay sau khi mổ động vật. - Hàm lượng protein trong gan và cơ vân: thông qua định lượng nitơ toàn phần theo phương pháp Kjeldahl. Tỷ lệ hàm lượng các thành phần protein ở cơ vân và gan theo kích thước phân tử: Xác định bằng điện di (SDS-PAGE) trong hệ đệm Tris-glycin. Hoạt độ enzym peroxidase trong gan: Xác định theo phương pháp của Josephy (1982); Kết quả biểu thị 5 bằng IU/mg protein. Hàm lượng nhóm -SH trong gan: Xác định theo phương pháp của Ellmann (1952); Kết quả biểu thị bằng nM/mg protein. Hàm lượng carbonyl protein trong gan và cơ: Xác định bằng phương pháp đo quang theo Adams (2001); Kết quả biểu thị bằng nM/mg protein. Hàm lượng ADN trong gan và cơ vân: Tách chiết và định lượng ADN theo Blin và Stafford (1976) có thay đổi, định lượng theo OD 260 . Kiểm tra ADN bằng điện di trên gel agarose 0,4%. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các chỉ tiêu nghiên cứu đều được xử lý thống kê; so sánh thống kê giữa các nhóm DCDS - ĐC, 2 nhóm NĐ có điều trị với nhau và với nhóm DCDS. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tỷ lệ và thời gian sống sót, thay đổi trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, thận, lách động vật thực nghiệm Bảng 3.2: Tỷ lệ chuột sống sót sau nhiễm độc với liều 9 mg/kg ở các nhóm nghiên cứu Nhận xét: - Ở cả hai nhóm nhiễm độc có điều trị, tỷ lệ chuột sống sót tăng đáng kể so với nhóm không được điều trị. Bảng 3.3: Thể trọng chuột ở các nhóm nghiên cứu tại các thời điểm sau nhiễm độc (Đơn vị tính: g. X ± SD) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 n 30 25 20 15 ĐC (1) 20,0 ± 1,1 21,7 ± 0,9 22,6 ± 1,5 24,9 ± 1,1 DCDS (2) 19,4 ± 0,5 15,5 ± 0,7 ** 17,0 ± 1,5 ** 17,2 ± 1,8 ** NTS (3) 19,3 ± 0,7 16,0 ± 1,1 17,7 ± 0,8 18,1 ± 1,2 (NTS+Nz) (4) 19,3 ±1,0 17,7 ±1,2 ** 18,4 ±0,7 ** 20,0 ±0,7 ** ** : p < 0,01 (tương ứng theo p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ) 6 Nhận xét: - So với nhóm ĐC, nhóm DCDS có thể trọng thấp hơn ở ngày thứ 7 (giảm 21,7% so với ban đầu), ngày thứ 15 và 30. Thể trọng chuột nhóm NTS không khác biệt đáng kể so với nhóm DCDS ở cả 4 thời điểm. Thể trọng chuột nhóm NTS+Nz cao hơn so với nhóm DCDS và NTS ở 3 thời điểm sau, và đạt thể trọng ban đầu vào ngày thứ 30. Bảng 3.7: Tỷ lệ trọng lượng gan/ thể trọng chuột ở các nhóm sau nhiễm độc tại các thời điểm khảo sát (mg/g. X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 63,6 ± 5,8 63,8 ± 3,3 63,7 ± 5,2 63,4 ± 2,4 DCDS (2) 76,3 ± 9,8 ** 49,2 ±12,6 ** 53,7 ±11,1 ** 55,3 ±7,5 ** NTS (3) 70,6 ± 8,2 56,7 ± 5,2 * 56,4 ± 6,9 57,1 ± 3,6 NTS + Nz (4) 67,3 ± 6,5 * 56,8 ± 4,7 * 61,0 ± 4,7 * 61,3 ± 3,5 * * : p < 0,05; ** : p< 0,01 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X±SD: p 4-3 <0,05. Nhận xét: - So với ĐC, nhóm DCDS có tỷ lệ trọng lượng gan/thể trọng cao hơn ở ngày thứ nhất và thấp hơn ở 3 thời điểm sau. Nhóm NTS có tỷ lệ trọng lượng gan/thể trọng chỉ cao hơn so với nhóm DCDS ở ngày thứ 7. Nhóm NTS+Nz có trọng lượng gan ở ngày đầu thấp hơn và 3 thời điểm sau cao hơn so với của nhóm DCDS. Bảng 3.8: Tỷ lệ trọng lượng thận so với thể trọng chuột ở các nhóm nghiên cứu tại các thời điểm khảo sát (mg/g. X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 12,8 ± 1,5 14,4 ± 0,8 14,4 ± 1,1 14,3 ± 0,7 DCDS (2) 13,2 ± 1,5 12,3 ± 1,9 ** 13,7 ± 1,8 13,9 ± 2,5 NTS (3) 13,9 ± 1,7 14,1 ± 2,2 * 14,0 ± 1,6 14,0 ± 1,1 NTS + Nz (4) 13,0 ± 1,7 13,7 ± 1,8 * 14,0 ± 1,7 14,0 ± 1,5 * : p < 0,05; ** : p< 0,01 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X±SD: p 4-3 <0,05. 7 Nhận xét: - Tỷ lệ trọng lượng thận/thể trọng ở nhóm DCDS chỉ giảm rõ rệt ở ngày thứ 7. Cả hai nhóm nhiễm độc được điều trị đều có tỷ lệ trọng lượng thận/thể trọng ở thời điểm ngày thứ 7 cao hơn so với nhóm không điều trị. Bảng 3.9: Tỷ lệ trọng lượng lách so với thể trọng chuột ở các nhóm nghiên cứu tại các thời điểm khảo sát (mg/g; X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 3,3 ± 0,4 4,1 ± 0,5 4,0 ± 0,3 4,0 ± 0,4 DCDS (2) 3,5 ± 0,5 2,9 ± 0,4 ** 3,4 ± 0,7 * 3,5 ± 0,6 * NTS (3) 3,3 ± 0,4 3,7 ± 0,5 * 4,0 ± 0,7 * 4,1 ± 0,7 * NTS + Nz (4) 3,4 ± 0,4 4,4 ± 0,7 ** 5,1 ± 0,7 ** 5,2 ± 0,8 ** * : p < 0,05; ** : p< 0,01 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X±SD: p 4-3 <0,05. Nhận xét: Tỷ lệ trọng lượng lách/thể trọng ở nhóm DCDS thấp hơn so với đối chứng ở các thời điểm ngày thứ 7, 15 và 30; nhóm NTS cao hơn so với của nhóm DCDS ở 3 thời điểm sau; nhóm NTS+Nz tăng liên tục và luôn tương đương hoặc cao hơn so với nhóm ĐC. 3.2. Hàm lượng nitơ trong gan và cơ vân Bảng 3.10: Hàm lượng nitơ trong gan (mg/g) chuột ở các nhóm tại các thời điểm khảo sát (X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 24,37 ± 0,76 24,68 ± 0,63 25,18 ± 1,03 25,19 ± 0,98 DCDS (2) 23,41 ± 1,56 23,44 ±1,43 * 23,21 ±1,87 ** 23,29 ±1,60 ** NTS (3) 23,36 ± 1,81 23,52 ± 1,55 23,92 ± 2,10 23,79 ± 2,07 NTS+Nz (4) 23,19 ±1,96 23,58 ±1,37 25,17 ±0,78 ** 25,23 ±1,25 ** * : p < 0,05; ** : p< 0,01 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X±SD: p 4-3 <0,05. Nhận xét: - Hàm lượng nitơ trong gan nhóm DCDS thấp hơn đối chứng ở ngày thứ 7, 15 và 30; Diễn biến hàm lượng nitơ có tương 8 quan thuận với diễn biến thể trọng (r = 0,81). Nhóm NTS có hàm lượng nitơ tương đương với nhóm DCDS ở tất cả các thời điểm. Nhóm NTS+Nz có hàm lượng nitơ cao hơn so với nhóm NTS ở ngày thứ 30. Bảng 3.11: Hàm lượng nitơ trong mô cơ vân (mg/g) các nhóm chuột tại các thời điểm (X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 29,99 ± 0,92 30,77 ± 0,87 31,25 ± 0,85 31,50 ± 1,05 DCDS (2) 28,82 ± 2,01 27,44 ±1,91 ** 27,86 ±2,06 ** 28,48 ±2,17 ** NTS (3) 28,56 ± 2,34 28,01 ± 1,75 28,77 ± 1,67 28,83 ± 2,39 NTS + Nz (4) 28,78 ± 1,89 28,54 ± 1,28 29,30 ± 1,51 30,80 ±1,45 ** * : p < 0,05; ** : p< 0,01 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X±SD: p 4-3 <0,05. Nhận xét: - Hàm lượng nitơ trong cơ vân nhóm DCDS giảm đáng kể so với ĐC ở 3 thời điểm sau, và có tương quan thuận với thể trọng động vật (r = 0,98). Nhóm NTS có hàm lượng nitơ không khác biệt so với của nhóm DCDS (p 3-2 > 0,05). Ở nhóm NTS+Nz, hàm lượng nitơ tăng dần theo thời gian, đến ngày thứ 30 thì tương đương với của nhóm ĐC và cao hơn rõ rệt so với nhóm DCDS (p 4-2 < 0,05) cũng như nhóm NTS (p 4-3 < 0,01). 3.3. Hàm lượng protein carbonyl trong mô gan và cơ vân động vật thực nghiệm Bảng 3.12 : Hàm lượng protein carbonyl (nM/mg) trong gan chuột ở các nhóm nghiên cứu tại các thời điểm (X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 3,77 ± 0,54 3,15 ± 0,68 3,75 ± 0,48 3,50 ± 0,69 DCDS (2) 9,81 ± 1,91 ** 9,26 ± 2,35 ** 9,74 ± 2,09 ** 7,40 ± 1,84 ** NTS (3) 9,32 ± 1,60 9,49 ± 2,08 9,23 ± 2,22 7,77 ± 1,66 NTS +Nz (4) 9,89 ± 1,25 7,42 ± 1,83 * 5,89 ± 0,63 ** 3,94 ± 0,87 ** * : p < 0,05; ** : p< 0,001 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X ±SD: p 4-3 <0,05. 9 Nhận xét: - So với đối chứng, hàm lượng carbonyl trong gan ở hai nhóm DCDS và NTS đã tăng gấp gần 3 lần ngay ở ngày thứ nhất; Sự khác biệt giữa hai nhóm này chưa có ý nghĩa thống kê. Nhóm NTS+Nz có hàm lượng carbonyl thấp hơn rõ ràng so với nhóm DCDS cũng như nhóm NTS ở các thời điểm ngày thứ 7, 15 và 30 . Bảng 3.13: Hàm lượng protein carbonyl (nM/mg) trong cơ vân chuột ở các nhóm tại các thời điểm khác nhau (X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 3,57 ± 0,50 3,16 ± 0,70 3,42 ± 0,57 3,26 ± 0,66 DCDS (2) 9,34 ± 1,60 ** 9,39 ± 1,47 ** 8,80 ± 1,68 ** 6,56 ± 1,29 ** NTS (3) 8,53 ± 1,08 8,74 ± 1,50 8,20 ± 1,79 5,80 ± 1,37 NTS+Nz (4) 8,59 ± 1,84 6,70 ± 2,06 ** 5,35 ± 0,95 ** 3,34 ± 1,34 ** * : p < 0,05; ** : p< 0,01 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X±SD: p 4-3 <0,05. Nhận xét: - Nhóm DCDS và nhóm NTS có hàm lượng carbonyl trong cơ vân tương đương nhau ở các thời điểm và cao hơn rõ rệt so với nhóm ĐC. Ở nhóm NTS+Nz, hàm lượng carbonyl ngày thứ nhất cũng tăng cao như ở nhóm DCDS, nhưng sau đó đều thấp hơn so với nhóm DCDS và trở về mức bình thường vào ngày thứ 30. 3.4. Hoạt độ peroxidase và hàm lượng nhóm -SH trong gan Bảng 3.14: Hoạt độ peroxidase (IU/mg protein) trong gan các nhóm chuột tại các thời điểm khảo sát (X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 8,83 ± 1,20 8,85 ± 1,14 9,02 ± 1,06 8,96 ± 0,97 DCDS (2) 9,23 ± 1,24 6,27 ± 1,02 ** 7,65 ± 0,88 ** 7,73 ± 1,38 * NTS (3) 9,38 ± 1,30 7,10 ± 1,38 7,52 ± 1,45 8,19 ± 1,52 NTS+Nz (4) 9,53 ± 1,16 8,21 ± 1,34 ** 8,86 ± 1,54 * 10,71 ± 1,92 ** * : p < 0,05; ** : p< 0,01 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X±SD: p 4-3 <0,05. 10 Nhận xét: - Ở nhóm DCDS, hoạt độ POD thấp hơn so với nhóm ĐC ở ngày thứ 7, 15 và 30 (p 2-1 < 0,05); giảm nhiều nhất vào ngày thứ 7 (giảm 29,2%). Hoạt độ POD trong gan của nhóm NTS không khác biệt so với nhóm DCDS. Nhóm NTS+Nz có hoạt độ POD tương đương với của nhóm ĐC, riêng ngày thứ 30 lại cao hơn đối chứng. Bảng 3.15: Hàm lượng nhóm sulfhydryl trong gan chuột tại các thời điểm sau nhiễm độc (nM/mg protein. X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 0,31 ± 0,03 0,35 ± 0,04 0,35 ± 0,04 0,31 ± 0,03 DCDS (2) 0,28 ± 0,05 0,21 ± 0,03 ** 0,25 ± 0,04 ** 0,25 ± 0,04 ** NTS (3) 0,27 ± 0,05 0,29 ± 0,05 ** 0,30 ± 0,04 ** 0,28 ± 0,04 NTS + Nz) (4) 0,30 ± 0,05 0,31 ± 0,04 ** 0,35 ± 0,04 ** 0,31 ± 0,03 ** * : p < 0,05; ** : p< 0,01 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X±SD: p 4-3 <0,05. Nhận xét: - Ở nhóm DCDS, hàm lượng nhóm -SH giảm ở ngày thứ 7 (giảm 39,5% so với ĐC), ngày thứ 15 (-27,8%) và 30 (-20,0%). Hàm lượng -SH trong gan nhóm NTS chỉ cao hơn nhóm DCDS (p 3-2 < 0,01) ở ngày thứ 7 và 15. Nhóm NTS+Nz có hàm lượng -SH tự do tương đương với của nhóm ĐC tại cả 4 thời điểm và cao hơn so với nhóm NTS vào ngày thứ 15 và 30. 3.5. Hàm lượng ADN trong gan và cơ vân chuột Sau khi tách chiết, các mẫu ADN gan và cơ đều có độ sạch nằm trong giới hạn cho phép định lượng (OD 260 /OD 280 > 1,7). 11 Bảng 3.16: Hàm lượng ADN trong mô gan chuột (µg/g) tại các thời điểm sau nhiễm độc (X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 9617 ± 961 9721 ± 919 10461 ± 1011 10753 ± 991 DCDS (2) 9409 ± 1111 8569 ± 1066 ** 9447 ± 1126 * 11630 ± 1706 NTS (3) 9514 ± 1369 9411 ± 885 * 10504 ± 1229 * 11020 ± 1301 NTS + Nz (4) 9445 ± 986 9921 ± 926 ** 10309 ± 1048 * 10559 ± 1170 * : p < 0,05; ** : p< 0,01 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X±SD: p 4-3 <0,05. Nhận xét: - Hàm lượng ADN ở nhóm DCDS ngày thứ 7 và 15 thấp hơn do với ĐC. Mức độ giảm thì không lớn (≈ 13% so với ĐC). Nhóm NTS và NTS+Nz có hàm lượng ADN cao hơn rõ rệt so với nhóm DCDS ở các thời điểm ngày thứ 7 và 15. Bảng 3.17: Hàm lượng ADN trong mô cơ vân chuột (µg/g mô) tại các thời điểm sau nhiễm độc (X ± SD, n = 10) Nhóm Ngày 1 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 30 ĐC (1) 5842 ± 522 6190 ± 477 6626 ± 442 6955 ± 347 DCDS (2) 4739 ± 562 ** 4911 ± 555 ** 6766 ± 845 7046 ± 698 NTS (3) 5346 ± 552 * 5570 ± 465 ** 6946 ± 683 7003 ± 812 NTS + Nz (4) 5757 ± 551 ** 5954 ± 567 ** 6931 ± 652 6903 ± 791 * : p < 0,05; ** : p< 0,01 (tương ứng p 2-1 , p 3-2 và p 4-2 ). X±SD: p 4-3 <0,05. Nhận xét: - Ở nhóm DCDS, hàm lượng ADN trong cơ vân thấp hơn so với nhóm ĐC chỉ ở ngày thứ nhất và thứ 7. Hai nhóm được điều trị có hàm lượng ADN tại các thời điểm ngày thứ nhất và ngày thứ 7 đều cao hơn rõ rệt so với nhóm DCDS. 12 3.6. Hình ảnh điện di ADN tách từ gan và cơ vân chuột Ảnh 3-1: Hình ảnh điện di ADN genom mẫu gan và cơ vân chuột các nhóm ngày thứ nhất và ngày thứ 7 (không dùng kit). Ký hiệu mẫu: 1 - 8: mẫu ngày thứ 1 (lần lượt của 4 nhóm ĐC-DCDS-NTS-NTS+Nz - mỗi nhóm 2 mẫu, mẫu số lẻ là gan, số chẵn là cơ); từ 9 - 16: mẫu ngày 7 (theo 4 nhóm tương tự ngày 1); a-i: mẫu ngày 15 và k-r: mẫu ngày 30 (xếp theo thứ tự 4 nhóm như ngày 1, mẫu gan xen kẽ mẫu cơ). Ảnh 3-2: ADN genom tách từ mẫu gan và cơ vân (xếp xen kẽ mẫu gan- cơ; sử dụng kit của Sigma). Nhóm ĐC (a, b, k, l, 1, 2, 9, 10), nhóm DCDS (c, d, m, n, 3, 4, 11, 12), nhóm NTS (e, g, o, p, 5, 6, 13, 14) và nhóm NTS+Nz (h, i, q, r, 7, 8, 15, 16) tại các thời điểm: ngày thứ nhất (A), thứ 7 (B), 15 (C) và thứ 30 (D). 13 Nhận xét: chưa phát hiện có sự thay đổi ADN nào giữa các nhóm cũng như giữa các thời điểm. Tiến hành phân tích một số mẫu bằng kit của hãng Sigma cũng cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng ADN, song hình ảnh điện di có cải thiện rõ rệt (ảnh 3-2). 3.7. Kết quả nghiên cứu protein cơ vân và gan chuột bằng điện di Ảnh 3-4: Trắc diện mật độ quang gel điện di protein mẫu gan cả 4 nhóm chuột tại các thời điểm. Ảnh trái: ngày thứ 7; ảnh phải: ngày thứ 30. Trên các gel polyacrylamid sử dụng, bằng phần mềm chúng tôi đã phân tích được từ 42 - 50 thành phần protein theo kích thước phân tử trong các mẫu gan của động vật. Bảng 3-18: Thành phần protein trong gan chuột ngày thứ nhất Bảng 3-19: Các thành phần protein trong gan chuột ngày thứ 7 Bảng 3-20: Các thành phần protein trong gan chuột ngày thứ 15 Bảng 3-21: Các thành phần protein trong gan chuột ngày thứ 30 Nhận xét chung: So với thời điểm ngày thứ nhất, các thành phần protein trong gan theo kích thước phân tử xác định được ở 3 thời điểm sau có chênh lệch không lớn. Giữa các nhóm ở mỗi thời điểm có một số khác biệt nhất định về khối lượng tương đối ở một vài thành phần, song sự chênh lệch là không lớn và chưa có chiều hướng rõ ràng. Tỷ lệ khối 14 lượng của từng thành phần nhìn chung chưa khác biệt đáng kể giữa các nhóm. So sánh giữa các thời điểm cũng chưa thấy có sự thay đổi đáng kể nào về kích thước các thành phần cũng như khối lượng tương đối của từng thành phần. Ảnh 3-6: Trắc diện mật độ quang gel tách protein cơ vân của các nhóm chuột ngày thứ nhất. A: Nhóm ĐC; B: nhóm DCDS. Bảng 3-22: Các thành phần protein trong cơ vân chuột ngày thứ nhất Nhận xét: Cả 3 nhóm DCDS, NTS và NTS+Nz có một thành phần protein kích thước 32,2 kDa với khối lượng tương đối trung bình khoảng 1,4% mà không phát hiện thấy ở một số mẫu cơ của nhóm đối chứng. Còn lại không thấy có khác biệt đáng kể nào về số lượng, kích thước cũng như khối lượng tương đối của các thành phần protein giữa các nhóm. Bảng 3-23: Các thành phần protein trong cơ vân chuột ngày thứ 7 Bảng 3-24: Các thành phần protein trong cơ vân chuột ngày thứ 15 Bảng 3-25: Các thành phần protein trong cơ vân chuột ngày thứ 30 Nhận xét chung: Các gel sử dụng đã tách được khoảng 40 thành phần protein của mẫu cơ vân theo kích thước phân tử, trong đó các thành phần chính là 200 - 42,8 - 35,8 - 31 - 23,2 - 16 và 10,7 kDa. Tại các thời điểm, các thành phần protein trong cơ vân chuột xác định được A B 15 tương đối giống nhau, chưa phát hiện thấy thành phần bất thường nào ở các nhóm gây nhiễm độc. Khối lượng tương đối của một số thành phần có dao động chút ít ở các thời điểm song không thể hiện một xu hướng chắc chắn nào. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Ảnh hưởng của chất độc diclodietyl sulfid đến động vật thực nghiệm trên các chỉ tiêu nghiên cứu Tác động gây chết động vật thực nghiệm của diclodietyl sulfid Với các liều 6,5 - 9 - 11,5 và 14 mg/kg, DCDS gây chết và giảm thời gian sống trung bình của chuột có tương quan với liều nhiễm. Ảnh hưởng của diclodietyl sulfid tới thể trọng và trọng lượng gan, thận, lách Nguyên nhân gây suy mòn trong nhiễm độc cho tới nay được giải thích theo gợi ý từ những rối loạn chuyển hóa bao gồm tăng tiêu hủy các protein và chết tế bào, hạn chế đường phân do cạn kiệt NAD + và rối loạn tổng hợp các enzym. Ở ngày thứ nhất, tỷ lệ trọng lượng gan/thể trọng tăng cao có thể do gan bị xung huyết. Ngày thứ 7, 15 và 30, tỷ lệ trọng lượng gan/thể trọng thấp hơn đối chứng có thể do hậu quả của các tổn thương hoại tử, do cạn kiệt các dự trữ glycogen, mỡ, acid amin và protein trong gan dưới tác động của chất độc. Kết quả giảm trọng lượng thận có thể liên quan đến giảm các vật chất dự trữ (đường, lipid, protid) ở tạng và toàn bộ cơ thể nói chung. Ngoài ra trọng lượng thận giảm ở đây cũng có thể liên quan đến các tổn thương chết tế bào, hoại tử xảy ra trong nhiễm độc. Ở nhóm nhiễm độc không được điều trị, tỷ lệ trọng lượng lách/thể trọng chuột giảm mạnh nhất ở ngày thứ 7 (-29,3%). Nguyên nhân chủ yếu có thể là hoại tử và chết tế bào do CĐ tác động mạnh lên các mô sinh sản nhanh. 16 Ảnh hưởng của diclodietyl sulfid tới hàm lượng và thành phần protein trong mô cơ vân và gan động vật Qua kết quả của nhóm DCDS, chúng tôi nghĩ rằng có thể hàm lượng nitơ ở gan và cơ giảm theo kiểu hai kỳ, trong đó kỳ đầu giảm trong vòng 24 giờ (có hồi phục tạm thời), sau đó ổn định ở mức thấp cho tới ngày thứ 30. Trong cơ thể, DCDS tạo thành phức hợp các protein alkyl hóa, dẫn tới thay đổi cấu trúc và làm mất chức năng của chúng. Những phân tử này sẽ bị loại bỏ - chủ yếu nhờ enzym (protease), đồng thời có sự tổng hợp bù đắp để duy trì ổn định về cấu trúc và chức năng cho các mô cơ quan. Tuy nhiên, trong nhiễm độc DCDS, cả ADN có thể cũng bị tổn thương. Chúng tôi cho rằng, giảm hàm lượng protein còn liên quan đến những rối loạn chuyển hóa chung, trong đó cạn kiệt NAD + sớm gây ức chế đường phân, tăng giải phóng các enzym tiêu hủy protein nội bào, tăng tiêu thụ protein vào chuyển hóa năng lượng. - Ảnh hưởng tới hàm lượng thành phần carbonyl protein Kết quả hàm lượng carbonyl trong gan và cơ cho thấy, DCDS có tác động gây tổn thương protein do tăng gánh nặng oxy hóa khá sớm và tình trạng này còn kéo dài tới ngày thứ 30. Nguyên nhân của hiện tượng này theo các tài liệu là do mất cân bằng giữa sự hình thành và khả năng trung hòa các ROS (tăng tạo gốc tự do oxy hóa và chủ yếu do giảm GSH). - Ảnh hưởng tới thành phần protein theo kích thước phân tử So sánh kết quả về kích thước và khối lượng tương đối của các thành phần chính trong mẫu gan giữa các nhóm và giữa các thời điểm chưa phát hiện thấy có sự thay đổi khác lạ nào đáng kể. Đối với mẫu cơ, ở ngày thứ nhất có phát hiện một thành phần khác biệt ở cả 3 nhóm nhiễm độc, kích thước 32,2 kDa, khối lượng khoảng 1,4%. Đây có thể là sự thay đổi kích thước (cả tăng do gắn thêm các đoạn peptid hoặc giảm do phân tử bị phân cắt) của thành phần nào đó. Do mẫu chứa quá nhiều 17 thành phần nên riêng bằng điện di (SDS-PAGE) chỉ có thể khẳng định những thay đổi tương đối lớn về kích thước và trọng lượng phân tử protein. Ảnh hưởng của diclodietyl sulfid tới hoạt độ peroxidase và hàm lượng nhóm -SH trong gan động vật Ở ngày thứ nhất, hoạt độ POD gan nhóm DCDS có xu hướng tăng cao, đồng thời hàm lượng carbonyl protein cũng tăng đáng kể. Điều này gợi ý rằng, gánh nặng oxy hóa tăng rất sớm, và đáp ứng tăng hoạt độ POD có thể đã xảy ra ngay trong 24 giờ đầu, đến thời điểm phân tích thì đã bắt đầu có ức chế tổng hợp gây giảm dần hoạt độ enzym này (cũng như các enzym chống oxy hóa khác; Husain, 1996), phù hợp với kết quả hàm lượng nitơ trong gan và cơ vân ngày thứ nhất. Hàm lượng nhóm -SH giảm ở ngày thứ 7, 15 và 30 do DCDS gây alkyl hóa các nhóm chức của axit amin và protein - trong đó có nhóm - SH, do tăng mạnh các gốc tự do oxy hóa, và cũng có thể do các rối loạn chuyển hóa protein do alkyl hóa các acid nucleic ở gan Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh một cơ chế chủ yếu khử độc DCDS trong cơ thể là liên hợp với GSH và cystein, những chất khử giàu -SH, vì thế giảm hàm lượng -SH là kết quả hợp lý, phản ánh sự tham gia của các protein, enzym chứa nhóm chức này trong quá trình chuyển hóa chất độc (Gautam A., 2006). Hoạt độ POD trong gan chuột nhóm DCDS có tương quan thuận rất chặt chẽ với với hàm lượng nhóm -SH (r = 0,97, p < 0,001). Tương quan này gợi ý tới khả năng giảm các dạng hoạt động của POD phụ thuộc GSH (GPx). Trong điều kiện có tăng gánh nặng oxy hóa, cơ thể thường có đáp ứng tăng hoạt độ POD để đối phó. Nhưng ở đây, phản ứng này có thể không xảy ra do tác động ức chế tổng hợp protein nói chung của DCDS. Khả năng này được củng cố bằng tương 18 quan thuận rất chặt chẽ giữa hoạt độ POD và hàm lượng nitơ trong gan (r = 0,79; p < 0,001). Ảnh hưởng của diclodietyl sulfid tới hàm lượng ADN trong cơ vân và gan Hàm lượng ADN trong gan và cơ giảm là do phản ứng tiêu hủy các ADN bị tổn thương, do loại bỏ các tế bào hoại tử. DCDS là chất độc gây alkyl hóa ADN trong nhân tế bào, dẫn tới các tổn thương như đứt chuỗi (đứt chuỗi đơn hoặc đứt đoạn), đột biến, tạo ADN dị hình. Giảm hàm lượng ADN cũng có thể liên quan đến chết tế bào theo chương trình do DCDS. Hàm lượng ADN trong gan và cơ vân giảm ở các thời điểm khác nhau có thể liên quan đến quá trình phân bố của DCDS. 4.2. Tác dụng của natri thiosulfat đơn thuần và kết hợp naturenz trong điều trị nhiễm độc diclodietyl sulfid Tác dụng của thuốc điều trị trên các chỉ tiêu tỷ lệ sống sót, thể trọng và trọng lượng gan, thận, lách Phù hợp với các tài liệu kinh điển về điều trị NĐ DCDS, natri thiosulfat đã làm tăng được tỷ lệ chuột sống sót ở các thời điểm. Điều trị kết hợp thêm naturenz không mang lại hiệu quả đáng kể, song dường như sau ngày thứ 15, chuột không bị chết thêm như khi chỉ dùng natri thiosulfat đơn thuần. Mặc dù không loại trừ hoàn toàn được sự giảm thể trọng, song naturenz hạn chế đáng kể được ảnh hưởng này của DCDS, đồng thời giúp thể trọng hồi phục sớm hơn. Cơ chế có thể là nhờ tác dụng hỗ trợ chống độc của naturenz (hạn chế rối loạn chuyển hóa, chống oxy hóa, làm tăng đường máu, protein máu và hàm lượng -SH). So sánh thống kê cho thấy, điều trị bằng natri thiosulfat đơn thuần hạn chế được thay đổi trọng lượng gan chỉ ở ngày thứ 7, song cần lưu ý rằng đây cũng là thời điểm có thay đổi sâu sắc nhất. Điều trị bằng natri [...]... peroxidase, hàm lư ng nhóm sulfhydryl trong gan chu t nh t nhi m c diclodietyl sulfid qua da và tác d ng i u tr c a natri thiosulfat và naturenz , Dư c li u, 12, tr 185-188 4 Nguy n Qu c Chi n, Hoàng Công Minh, L i Văn Hòa, Nguy n H ng Minh, Nguy n C m Th ch, Vũ Quang H p (2008), Nghiên c u s thay nh t nhi m i protein, ADN trong gan và cơ vân chu t c diclodietyl sulfid và tác d ng c a thu c i u tr ”, Y h... ng bi n i hàm lư ng ADN trong gan và cơ vân - i u tr b ng naturenz k t h p v i natri thiosulfat ã tăng ư c hi u qu hơn so v i natri thiosulfat ơn thu n: giúp sulfhydryl và ho t ng v t h i peroxidase trong gan KI N NGH - Ti p t c nghiên c u sâu thêm v nh hư ng c a ch t c diclodietyl sulfid lên các thành ph n ADN và protein b ng các k thu t phân tích hi n i; c bi t là làm rõ s có m t và b n ch t c a thành... tr t i hàm lư ng ADN trong cơ vân và 3 Diclodietyl sulfid gây gi m hàm lư ng nitơ trong gan và cơ vân gan chu t t th i i m ngày th 7, sau 30 ngày chưa h i ph c Di n bi n D a trên k t qu thay i hàm lư ng ADN nhóm nhi m c không i u tr (b ng 3-18, 3-19), chúng tôi th y i u tr b ng natri thiosulfat ơn thu n cũng như k t h p v i naturenz ã n hàm lư ng ADN trong gan và cơ vân chu t nh ư c các th i i m có... tr c a natri thiosulfat và naturenz. ”, Y h c th c hành, 573, tr 68-71 2 Nguy n Qu c Chi n, L i Văn Hòa, Nguy n H ng Minh, Nguy n B ng Quy n, Hoàng Công Minh (2007), “S thay i hàm lư ng protein carbonyl trong mô gan, cơ vân chu t nh t b nhi m c diclodietyl sulfid qua da và tác d ng i u tr c a natri thiosulfat và naturenz , Các báo cáo khoa h c - H i ngh khoa h c hóa sinh y dư c năm 2007 (Hà N i và các... cao và gi m th i ngày th nh t các th i i m ngày th 7, 15 và 30 T l tr ng lư ng th n và lách so v i th tr ng gi m m nh nh t ngày th 7 2 Diclodietyl sulfid gây gi m hàm lư ng ADN gan v i m c v a ph i t ngày th 7 và h i ph c ngày th 30; cơ vân gi m ngay t ngày th nh t và h i ph c ngày th 15 sau nhi m c Không có hình nh t n thương ADN trên i n di Tác d ng c a các thu c i u tr t i hàm lư ng ADN trong cơ. .. cho th y, naturenz không có tác d ng hàm lư ng nitơ trong cơ vân có tương quan thu n r t ch t ch v i th tr ng ng v t (r = 0,98) B ng i n di (SDS-PAGE) phát hi n thành ph n protein l kích thư c 32,2 kDa, kh i lư ng trung bình 1,4% trong cơ vân chu t ngày th nh t sau nhi m c diclodietyl sulfid Diclodietyl sulfid gây tăng gánh n ng oxy hóa l i nh i hàm lư ng ADN trong mô Tác hư ng rõ r t trên protein,. .. tiêu hàm lư ng nhóm –SH, và hi u qu này ch duy trì ư c trong 15 ngày M t khác, i u này cũng cho th y tác c trên hàm lư ng –SH là khá dai d ng K t qu ng c a nhi m nhóm NTS+Nz cho th y naturenz rõ ràng có tác d ng h i ph c lư ng -SH trong gan chu t b nhi m 22 K T LU N c; và tác d ng này ư c hi p ng khi ph i h p v i natri thiosulfat Cơ ch c a hi u qu này theo d oán là do naturenz có tác d ng ch ng các g c... ng, ho t Vi c i u tr b ng natri thiosulfat ơn thu n không gi i quy t nhi m gan peroxidase và hàm lư ng b ng 3-14 cho th y, tác d ng i u tr c a natri K t qu th c nghi m cho th y, natri thiosulfat không ch ng ư c tác i u này cho th y kh năng tách khá l n c a i n di (SDS-PAGE), nhưng m t khác l i h n các th i i m ngày 15 và 30 Có th naturenz có tác d ng tăng cư ng s , tam th t, và có kh năng ây là m t ph... u tr trên hàm lư ng và thành ph n protein nhóm -SH trong gan trong mô cơ vân và gan T ng v t k t qu ng v t nhi m thiosulfat ơn thu n trên ho t ng gây gi m hàm lư ng protein trong mô gan do nhi m qu này cũng g i ý tr k t h p naturenz ã h n ch ngày th 15 m i b t c ư c tình tr ng này, nhưng ph i u có hi u qu Theo k t qu nói, riêng natri thiosulfat có tác d ng nh t i u n b ng 3-11 có th nh song chưa có... t hi n trong m u cơ ngày th nh t sau nhi m c trên i n di - Ti p t c nghiên c u ánh giá hi u qu c a naturenz trong i u tr nhi m dài hơn c diclodietyl sulfid v i các li u khác nhau và v i th i gian c NH NG BÀI BÁO C A TÁC GI LIÊN QUAN Ã CÔNG B N LU N ÁN 1 Nguy n Qu c Chi n, Hoàng Công Minh, Nghiêm Danh B y (2007), “S thay nhi m i th tr ng, kh i lư ng gan, lách, th n chu t nh t c DCDS qua da và tác d ng . DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y Nguyễn Quốc Chiến NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DICLODIETYLSULFID LÊN PROTEIN, ADN TRONG CƠ VÂN, GAN VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ CỦA NATRI THIOSULFAT. hàm lượng và thành phần protein, ADN trong mô cơ vân, gan trên động vật nhiễm độc diclodietyl sulfid. 2) Đánh giá tác dụng của naturenz phối hợp với natri thiosulfat trong điều trị nhiễm độc. khi được điều trị hỗ trợ bằng naturenz. Tác dụng của các thuốc điều trị trên hàm lượng và thành phần protein trong mô cơ vân và gan động vật Kết quả thực nghiệm cho thấy, natri thiosulfat