Đang tải... (xem toàn văn)
Xác định vi khuẩn lậu và phát hiện đột biến gen kháng ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007
Bộ giáo dục đào tạo Bộ y tế Trờng đại học y h nội Lê văn hng Xác định vi khuẩn lậu v phát đột biến gen kháng Ciprofloxacin kỹ thuật sinh học phân tử Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007 Chuyên ngành: Vi khuẩn học Mà số: 62.72.68.01 tóm tắt Luận án tiến sỹ y học Hà Nội - 2009 Công trình đợc hoàn thành tại: Trờng Đại học Y Hà Néi Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: PGS TS Lª Văn Phủng TS Lê Thị Phơng Phản biện 1: PGS.TS Phạm Văn Hiển Phản biện 2: PGS.TS Vũ Tân Trào Phản biện 3: PGS.TS Đinh Duy Kháng Luận án đà đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm Luận án cấp Nhà nớc tại: Trờng Đại học Y Hà Nội Vào hồi 14 00 ngày 22 tháng 12 năm 2009 Có thể tìm hiểu luận án th viÖn: - Th− viÖn Quèc gia - Th− viÖn Tr−êng Đại học Y Hà Nội - Th viện thông tin Y học Trung ơng Danh mục nhữ n tác giả Danh mục công trình tác giả đ đăng in có liên quan đến luận án Lê Thị Phơng, Dơng Thị Nở, Lê Văn Hng cộng (1994), "Tìm hiểu kháng lại penicillin có sản xuất men -lactamase chủng lậu cầu phân lập đợc Viện Da liễu nhng năm gần đây", Viện thông tin th viện Y học trung ơng Hà Nội 1994, trang 43-45 Lê Thị Phơng, Phạm Văn Hiển, Lê Văn Hng (2002), "Giám sát kháng kháng sinh lậu cầu Viện Da liễu Trung ơng từ năm 1996-2000" Néi san Da liƠu, sè 2, Tỉng héi Y Dợc học Việt Nam: trang 34-43 Lê Văn Hng (2006), "Sù kh¸ng kh¸ng sinh cđa c¸c chđng vi khn lậu phân lập đợc Viện Da liễu Quốc gia năm 2005" Tạp chí Nghiên cứu y học 46 (6): trang 83-86 Lê Văn Hng, Nguyễn Thị Nh Lan (2008), "Giá trị kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khn lËu", T¹p chÝ Y häc ViƯt Nam, tËp 351 (2): trang 66-70 Lê Văn Hng, Nguyễn Thị Nh− Lan (2008), " Sù kh¸ng kh¸ng sinh cđa c¸c chủng vi khuẩn lậu phân lập đợc Viện Da liễu Quốc gia năm 2006", Tạp chí Y học Việt Nam, tháng 10 số 2/2008, trang 183-187 Đặt vấn đề Tính cấp thiết đề tài Bệnh Lậu bệnh lây truyền qua đờng tình dục (LTQĐTD) phổ biến nớc ta nhiều nớc Thế giới Bệnh không gây tử vong nhng điều trị không kịp thời, không phác đồ để lại nhiều biến chứng di chứng làm ảnh hởng thân mà đến xà hội, kinh tế, gia đình giống nòi Ciprofloxacin kháng sinh đợc đa vào điều trị bệnh Lậu năm gần víi mét liỊu ng nhÊt (500 mg) ®· ®iỊu trị đợc bệnh Lậu cấp; kháng sinh đợc thầy thuốc bệnh nhân a chuộng Chính thế, việc lạm dụng kháng sinh đà làm gia tăng tính kháng thuốc vi khuẩn gây khó khăn nhiều cho việc chẩn đoán Các kỹ thuật chẩn đoán thông thờng nh nhuộm soi, nuôi cấy thờng không phát đợc vi khuẩn lậu trờng hợp Vì vậy, bổ sung phơng pháp chẩn đoán mới, có độ nhạy độ đặc hiệu cao so với phơng pháp kinh điển cần thiết, để đánh giá tình hình bệnh Lậu giải thích chế ®Ị kh¸ng cđa vi khn lËu, tõ ®ã cã biƯn pháp can thiệp hữu hiệu Nếu không, ciprofloxacin trở thành kháng sinh tác dụng vi khuẩn lậu thời gian tới Tôi tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu: - Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007 - So s¸nh tû lƯ ph¸t hiƯn vi khn lËu kỹ thuật: PCR, nhuộm soi nuôi cấy - Tìm hiểu kháng kháng sinh chủng vi khuẩn lậu phân lập đợc Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007 - Phát đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin vi khuẩn lậu ý nghĩa thực tiễn đóng góp ln ¸n: * ý nghÜa thùc tiƠn cđa ln ¸n: - Xác định đợc tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu qua năm bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo âm đạo giúp cho vấn đề xây dựng chơng trình can thiệp có hiệu nhằm hạ thấp tỷ lệ lây lan - Đánh giá đợc tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu giai đoạn cấp tính mạn tính phơng pháp chẩn đoán kinh điển đại, áp dụng đợc labo có điều kiện - Xác định đợc tỷ lệ đề kháng kháng sinh vi khuẩn lậu qua năm, giúp cho bác sỹ lâm sàng lựa chọn kháng sinh thích hợp điều trị bệnh Lậu * Những đóng góp mới: - áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử đại vào phát tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu đối tợng bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đề xuất bổ sung kỹ thuật vào chẩn đoán nhằm nâng cao tỷ lệ phát bệnh, giai đoạn mạn tính - Lần kỹ thuật sinh học phân tử đợc áp dụng để giải trình tự gen gyrA parC tìm hiểu chế đề kháng ciprofloxacin chủng vi khuẩn lậu phân lập đợc Bố cục luận án Luận án gồm 118 trang đó: - Đặt vấn ®Ị: trang - Ch−¬ng I Tỉng quan 32 trang - Chơng II Đối tợng phơng pháp nghiên cứu 19 trang - Chơng III Kết nghiên cứu 34 trang - Chơng IV Bàn luận 28 trang - Kết luận kiến nghị trang Chơng 1: Tổng quan 1.1 Tình hình bệnh Lậu giới Theo thống kê WHO, hàng năm giới có 60 triệu ngời bị bệnh Lậu Riêng Mỹ hàng năm, có khoảng triệu ngời mắc, tỷ lệ phụ nữ có thai nhiễm vi khuẩn lậu 6% ë London (Anh), theo dâi 516 thai phơ, tû lƯ nhiƠm vi khn lËu lµ 0,4% Matsumoto (2008) cho biÕt, Nhật Bản: tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis tăng toàn giới, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu lại giảm, trừ nớc thuộc châu 1.2 Tình hình bệnh Lậu Việt Nam Sau ngày giải phóng miền Nam, bệnh hoa liễu nói chung bệnh Lậu nói riêng lan tràn khắp nơi Theo thống kê ngành Da liễu từ năm 1999 đến năm 2007 số bệnh nhân bị bệnh Lậu năm là: Năm 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Sè 6.747 6.375 5.581 5.699 6.740 6.409 5.233 5.526 5.491 BN Về tình hình bệnh Lậu Việt Nam, nhận thấy số lợng bệnh nhân mắc bệnh Lậu hầu nh không giảm khoảng mời năm qua Có lúc bệnh Lậu tởng chừng đà giảm nhng lại tăng năm 1.3 Vi khuÈn lËu Vi khuÈn lËu, Neisseria gonorrhoeae, thuéc hä Neisseriaceae, giống Neisseria Trong giống Neisseria, có loài gây bệnh, có loài hoại sinh, chúng khác biệt số tính chất sinh vật hoá học (lên men đờng glucose, không sinh hơi) Dựa vào tính chất này, ngời ta phân biệt vi khuẩn lậu với số Neisseria hoại sinh khác Trên tiêu nhuộm Gram, vi khuẩn lậu cầu khuẩn đứng thành đôi, hình hạt cà phê, hai mặt dẹt quay vào nhau, bắt mầu Gram (-), cã kÝch th−íc 0,6 μm x 0,8 μm, kho¶ng cách hai cầu khuẩn 1/5 chiều rộng Khi tế bào bạch cầu đa nhân trung tính, vi khuẩn lậu loại vi khuẩn độc chiếm tế bào (có loại vi khuẩn sống tế bào) Ngời ta gặp cặp, hai cặp, bốn cặp nhiều lòng bạch cầu đa nhân trung tính Vi khuẩn lậu khó nuôi cấy, khỏi thể, chúng dễ chết Sức đề kháng vi khuẩn lậu kém, dễ bị bất hoạt điều kiện ngoại cảnh Nuôi cấy vi khuẩn lậu môi trờng Thayer-Martin có chất tăng sinh Isovitalex chất ức chế V-C-N Nhiệt độ sinh trởng thích hợp 35-360C, độ ẩm > 70%, khÝ tr−êng CO2 tõ 3-10%, pH 7,3 Sau 24 nuôi cấy, đờng kính khuẩn lạc 0,5-1 mm, tròn, lồi, bờ khuẩn lạc đều, nhầy có màu xám, óng ánh nh hạt sơng 1.4 Plasmid Vi khuẩn lËu chøa mét plasmid tù trun (tiÕp hỵp), cã träng lợng phân tử 36 kb Các dẫn xuất lớn chút plasmid 36 kb đà đợc phân lập, cã chøa transposon tetM kh¸ng tetracyclin NhiỊu plasmid mang gen kh¸ng β-lactamase (kh¸ng penicilin) kh¸c cđa vi khn lËu đà đợc phân lập xác định đặc điểm Hai plasmid hay gặp loại có kích cỡ khoảng 5,3 7,2 kb Phần lớn vi khuẩn lậu chứa mét plasmid 4,2 kb (cryptic plasmid) nh−ng ch−a râ chøc ADN plasmid đà đợc giải trình tự hoàn toàn Đôi phân lập đợc vi khuÈn lËu kh«ng chøa plasmid 4,2 kb chÐp tù nhng chúng bình thờng đặc tính sinh học Plasmid có khả tự nhân lên, nên vi khuẩn có nhiều sao, chọn primer nhằm khuếch đại đoạn gen plasmid độ nhạy cao đoạn gen nằm nhiễm sắc thể Tuy nhiên bỏ sót chủng vi khuẩn lậu plasmid Nhng chủng vi khn lËu kh«ng cã plasmid chØ chiÕm mét tØ lƯ nhỏ có số nơi giới Nên nghiên cứu đà chọn primer HO1 HO3 hÃng Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản nhằm vào gen cppB plasmid pJD1 mà gen cppB lại ổn định plasmid pJD1 Các tác giả khác trªn thÕ giíi nghiªn cøu vỊ plasmid pJD1 đà khảng định có tới 96% số chủng vi khuẩn lậu chứa plasmid pJD1 1.5 Khả g©y bƯnh cđa vi khn lËu - ë ng−êi lín: vi khuẩn lậu gây viêm niệu đạo cho nam nữ Triệu chứng điển hình đái mủ, đái khó, chảy mủ niệu đạo, âm đạo, tử cung, vòi trứng, buồng trứng Có khoảng 1/5 số ngời triệu chứng điển hình - trẻ em: thờng biểu bệnh mắt lây vi khuẩn lậu từ mĐ thêi kú sinh con, phỉ biÕn nhÊt lµ chảy mủ kết mạc sau đẻ 1-7 ngày Nếu không điều trị kịp thời, dẫn tới mù loà - Nhiễm trùng lan tỏa: bệnh thờng gặp ngời bị bệnh Lậu nhng không đợc điều trị kịp thời, phác đồ Hầu hết nhiễm vi khuẩn lậu lan toả xảy phụ nữ Biểu bệnh nh: viêm khớp, viêm gan, viêm tim, viêm nội tâm mạc, viêm màng nÃo, nhiễm vi khuẩn lậu da 1.6 Các kỹ thuật chẩn đoán phòng xÐt nghiÖm - Kü thuËt nhuém soi - Kü thuËt nuôi cấy - Kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh: để phát kháng thể kháng vi khuẩn lậu thành phần thông qua phản ứng kết hợp bổ thể, hấp phụ miễn dịch liên quan tới enzyme - Kü tht sinh häc ph©n tư th−êng dïng * PCR: Năm 1985, nhà khoa học ngời Mỹ, Kary B Mullis đà phát triển phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) Nguyên lý phản ứng PCR hoµn toµn dùa theo sù chÐp cđa ADN tế bào, đó, ADN đợc nhân lên theo chế bán bảo tồn Từ phân tử ADN chuỗi kép ban đầu, chúng đợc tách làm hai chuỗi đơn, chuỗi đơn làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi ADN * Tách, tạo dòng gen: nhằm thu đợc lợng lớn trình tự ADN xác định Chính xác hơn, tạo dòng chọn lọc th viện gen, dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm, tức tập hợp ADN bắt nguồn từ tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vector tái tổ hợp cần tìm * Giải trình tự gen: trình xác định thứ tự nucleotide đoạn ADN 1.7 Nghiên cứu sinh học phân tử vi khuẩn lậu Vi khuẩn lậu gây bệnh ngời Trình tự gen nhiễm sắc thể chủng N gonorrhoeae FA1090 đà đợc giải số lợng nucleotide 2.153.922 (GenBank accession No NC 004969) Vi khuÈn lËu lµ mét vi khuẩn dễ bị chết môi trờng, nuôi cấy đòi hỏi điều kiện ngặt nghèo chÊt dinh d−ìng, khÝ tr−êng… C¸c kü tht sinh häc phân tử đà khắc phục đợc nhợc điểm kỹ thuật thông thờng kỹ thụât sinh học phân tử đợc sử dụng để phát trùc tiÕp sù cã mỈt cđa vËt liƯu di trun cđa vi khn lËu bƯnh phÈm th«ng qua trình khuếch đại vật liệu di truyền Các kỹ thuật nhạy nên cần có số lợng vi khuẩn phản ứng cho kết dơng tính Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng chẩn đoán bao gồm: kỹ thuật lai, khuếch đại acid nucleic, giải trình tự gen 1.8 Một số gen liên quan đến đề kháng vi khuẩn lậu Những thay đổi vị trí (locus) khác nh mtr penB gây tác dụng phụ Vị trí mtr định đề kháng nhiều kháng sinh chất sát khuẩn qua hệ thống bơm chủ động Đột biến vị trí penB, tác động tới porin, dẫn tới giảm tính thấm màng tế bào với kháng sinh a nớc hợp chất khác Vi khuẩn lậu có "gen giả" porA nhng không đợc biểu Tác động phối hợp đột biến penA tăng biểu mtr làm tăng MIC penicillin lên 120 lần Đề kháng qua trung gian nhiễm sắc thể liên quan tới biến đổi mtr penB làm giảm độ nhạy với penicillin Các tác giả giíi: Xiahong Su vµ Inga Lind; Tiffany R Shultz; U Chaudhry; Masatoshi Tanaka nghiên cứu đề kháng quinolon vi khuẩn lậu lại có chung nhận xét chủng vi khuẩn lậu đề kháng với quinolon có đột biến gen gyrA, gen parC số lợng đột biến tăng theo nồng độ MIC Vậy, gen định đề kháng vi khuÈn nh−: gen gyrA, parC, gyrB, parE, penA, penB, mtr gen nhiễm sắc thể plasmid dẫn tới đề kháng rõ rệt lâm sàng Do hạn chế thời gian, kinh tế, qua tham khảo nghiên cứu trớc tác giả giới phần lớn nghiên cứu đề cập đến gen gyrA parC, gen khác đợc đề cập nên đà chọn gen gyrA parC để nghiên cứu đề kháng vi khuẩn lậu với kháng sinh ciprofloxacin gen khác đợc đề cập Mặt khác muốn giành cho nghiên cứu vào dịp khác có điều kiện Gen gyrA có độ dài 2.751 nucleotid mà hoá 916 axít amin, vùng định đề kháng quinolon dài khoản 279 nucleotid mà hoá 93 axít amin Gen parC có độ dài 2.307 nucleotid mà hoá 768 axít amin, vùng định đề kháng quinolon dài khoản 255 nucleotid mà hoá 85 axít amin 1.9 Kháng kháng sinh vi khuẩn lậu 1.9.1 Trên giới Thông báo WHO (2008), cho biết tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại kháng sinh thuộc nhóm quinolon năm 2006 khu vực châu Thái Bình Dơng: Trung Quốc 99,6%; Hồng Kông 97,8%; Hàn Quốc 89,4%; NhËt B¶n 83,4%; ViƯt Nam 82,1%; Brunei 81,7%; Singapore 70%; Philippines 69%; Malaysia 62%; Australia 38,7%; New Zealand 13,7% vµ tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng tetracyclin mức độ cao: Singapore 76,8%; Hong Kong 48,9%; Trung Quèc 35,2%; Philippines 31%; New Zealand 25%; ViÖt Nam 16,2%; Australia 12% 1.9.2 Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn lậu Việt Nam Cũng giống nh tình hình kháng kháng sinh giới, tỷ lệ vi khuẩn lậu ngày kháng lại nhiều loại kháng sinh mà gia tăng mức độ đề kháng, đặc biệt với ciprofloxacin, nh thông báo Lê Thị Phơng năm 1996-2000 tỷ lệ 35,6% nhng đến năm 2006 theo thông báo Lê Văn Hng tỷ lệ 56,6% giảm nhạy cảm 25,5% nâng mức tổng kháng 82,1% 1.9.3 Ciprofloxacin kháng ciprofloxacin Kháng sinh ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon hệ thứ hai đợc đa thị trờng vào năm 1980 với liều uống 500 mg đà điều trị đợc bệnh Lậu cấp Nhng, bệnh nhân nớc ta bị bệnh LTQĐTD thờng dấu bệnh, khám, mà lại tự sử dụng kháng sinh nên đà làm lan truyền gia tăng chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh nói chung kháng với kháng sinh ciprofloxacin nói riêng - Công thức hóa học Ciprofloxacin: C17H18FN3O3 Hình 1.1 Công thức phân tử ciprofloxacin - Dợc lý chế tác dụng Hoạt động bình thờng: Enzyme DNA gyrase Gỡ xoắn ADN ADN nhân lên Tế bào vi khuẩn nhân lên Cơ chế tác ®éng cã quinolon: Quinolon phong bÕ DNA-gyrase lµm cho không hoạt động bình thờng đợc, dẫn tới vi khuẩn không nhân lên đợc (vi khuẩn nhạy với kháng sinh này) Gen gyrase kiểm soát cấu trúc không gian cđa protein Gyrase CÊu t¹o Gyrase gåm hai tiĨu phần GyrA GyrB gen gyrA gyrB quy định Tơng tự topoisomerase IV tham gia vào mở xoắn ADN Cấu tạo topoisomerase IV gồm hai tiểu phần ParC ParE gen parC parE quy định Khi enzyme DNA-gyrase bị thay đổi (do đột biến gen), không tơng tác với quinolon Vì vậy, vi khuẩn nhân lên bình thờng có mặt quinolon (vi khuẩn kháng quinolon) 1.10 Các nghiên cứu đột biến gen liên quan đến đề kháng U Chaudhry cộng (2002) nghiên cứu 63 chủng vi khuẩn lậu phân lập bệnh nhân Delhi, ấn Độ có chủng (6%) nhạy cảm với ciprofloxacin (MIC < 0,06 g/ml) Phân tích trình tự ADN gen gyrA parC cho thấy: tất chủng kháng ciprofloxacin (58 chủng) có đột biến đoạn gen gyrA vµ parC GyrA (Ser91 thµnh Phe, Asp-95 thµnh Asn, Val-120 thành Leu) Cũng vấn đề này, Xie P cộng (2003) cho biết: 20 chủng đề kháng 20 chủng nhạy cảm với kháng sinh nhóm quinolon tỉnh Wusu, Trung Quốc có đột biến ®iĨm ë Asp-95 cđa gen gyrA vµ Asp-86, Ser-87, Ser-88, Glu-91 gen parC Liên quan đến giá trị MIC số lợng đột biến, Xu J S cộng (2006) nghiên cứu 18 chủng kháng ciprofloxacin tỉnh Jiangsu, Trung Quốc phát đột biến gen gyrA parC kết luận chủng có MIC cao có nhiều điểm đột biến Qua nhiều nghiên cứu giới, tác giả có chung nhận xét rằng, đột biến gen gyrA parC có liên quan đến đề kháng vi khuẩn lậu với ciprofloxacin Chơng 2: Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tợng nghiên cứu Là bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung - Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân + Có triệu chứng lâm sàng: miệng sáo đỏ, sng, có mủ dịch tiết niệu đạo màu trắng đục, vàng xanh, tiểu thấy nóng buốt có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung, nóng rát tiểu + Đồng ý tham gia vào nghiên cứu - Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân Đang dùng thuốc kháng sinh thời điểm lấy bệnh phẩm ngày 2.2 Phơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phơng pháp Nghiên cứu đợc thực tất bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007 với số mẫu 5.091 bệnh nhân, để tôi: xác định tỷ lệ nhiễm vi 10 chơng 3: kết nghiên cøu 3.1 Tû lƯ nhiƠm vi khn lËu ë bƯnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007 B¶ng 3.1 Tû lƯ nhiƠm vi khn lËu tõ năm 2005 đến năm 2007 (n=5.091) Nhuộm soi Kết Nuôi cấy Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) 471 9,3 503 9,9 Dơng tính ¢m tÝnh 4.620 90,7 4.588 90,1 Tæng sè 5.091 100 5.091 100 0,29 Giá trị P 3.2 So sánh tỷ lƯ ph¸t hiƯn vi khn lËu cđa kü tht PCR, nhuộm soi nuôi cấy 3.2.1 Kết PCR xác định vi khuẩn lậu bệnh nhân Marker 10 Marker 400 bp 100 bp 390 bp H×nh 3.1 KÕt PCR xác định vi khuẩn lậu bệnh nh©n tõ giÕng 3-10 Thang ADN mÉu: 100 bp GiÕng 1: chứng âm Giếng 2: chứng dơng Giếng 10: dơng tính Giếng 3, 4, 6, 7, 9: âm tính 11 3.2.2 Kết phát vi khuÈn lËu cña kü thuËt PCR, nhuém soi, nuôi cấy Bảng 3.13 Kết phát vi khn lËu cđa kü tht PCR, nhm soi, vµ nuôi cấy (n=500) Kết Kỹ thuật Nhuộm soi Nuôi cÊy PCR D−¬ng tÝnh Sè BN % 53 10,6 65 13,0 141 28,2 ¢m tÝnh Sè BN % 447 89,4 435 87,0 359 71,8 3.2.3 Kết xét nghiệm tìm vi khuÈn lËu cña ba kü thuËt PCR, nhuém soi, nuôi cấy nhóm nhóm Nhóm 1: Bệnh nhân đợc chẩn đoán viêm niệu đạo, âm đạo cấp (cấp tính) Nhóm 2: Bệnh nhân đợc chẩn đoán hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo (mạn tính) Bảng 3.14 Tỷ lệ phát vi khuẩn lậu kỹ thuật PCR, nhuộm soi nuôi cấy ë nhãm (n=500) Nhuém soi Nu«i cÊy PCR Nhãm Số Dơng Dơng Dơng nghiên cứu BN % % % tÝnh tÝnh tÝnh Nhãm 86 50 58,1 57 66,3 80 93,0 Nhãm 414 0,7 1,9 61 14,7 3.3 Kết kháng kháng sinh vi khuẩn lậu năm 2005-2007 Bảng 3.21 So sánh mức độ đề kháng ba năm 2005-2006-2007 Kháng sinh Penicillin Ceftriaxon Ciprofloxacin Spectinomycin Tetracyclin Azithromycin Cefotaxim % đề kháng (R+I) 2005 (n=162) 2006 (n=212) 2007 (n=129) 61,7 54,2 41,9 0 80,9 82,1 89,1 0 9,9 16,5 37,5 5,6 1,9 0,8 1,2 0,9 3,1 12 3.4 ®ét biÕn gen liên quan đến kháng ciprofloxacin 3.4.1 Kết điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA 10 279 bp Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA Giếng 1: chứng âm; Giếng 2:chứng dơng, Giếng 3: thang ADN 100bp Giếng đến 10: kết dơng tính 3.4.2 Kết điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen parC 10 255 bp H×nh 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen parC Giếng 1: chứng âm; Giếng 2:chứng dơng, GiÕng 3: thang ADN 100bp GiÕng ®Õn 10: kÕt dơng tính 13 3.4.3 Kết giải trình tự nucleotid đoạn gen gyrA chứa đột biến Hình 3.4 Trình tự nucleotid đoạn gen gyrA chứa đột biến Hình 3.5 Trình tự nucleotid đoạn gen gyrA chứa đột biến 14 3.4.4 Kết giải trình tự nucleotid đoạn gen parC chứa đột biến Hình 3.6 Trình tự nucleotid đoạn gen parC chứa đột biến Hình 3.7 Trình tự nucleotid đoạn gen parC chứa đột biến 15 3.4.5 Phân tích trình tự đoạn ADN thờng xảy đột biến dẫn tới kháng ciprofloxacin Bảng 3.22 Trình tự đoạn ADN thờng xảy đột biến dẫn tới kháng ciprofloxacin theo MIC (n=71) Chñng GyrA ParC MIC (μg/ml) ATCC 49226 0,001-0,008 Ser-91 Asp-95 Asp-86 Ser-87 Glu-91 63 0,002 27 0,060 67 Phe Ala Asn 69 Phe Ala 73 Phe Ala Asn 21 1,5 Phe Ala 28 1,5 Phe Gly Asn 47 1,5 Phe Gly 75 1,5 Phe Ala 2 Phe Ala 20 Phe Gly 23 Phe Gly Arg 26 Phe Ala 39 Phe Ala Asn 45 Phe Ala Asn 56 Phe Ala 60 Phe Ala 62 Phe Ala 64 Phe Ala 15 Phe Ala Arg 33 Phe Ala Asn 34 Phe Ala Asn 36 Phe Ala Asn 37 Phe Gly Asn 40 Phe Ala Asn 41 Phe Ala Arg 11 Phe Gly Asn 12 Phe Ala Asn 13 Phe Ala Asn 46 Phe Ala Asn 54 Phe Ala Asn Phe Gly Asn Phe Ala Asn 17 Phe Ala Asn 19 Phe Ala Asn 24 Phe Ala Asn Ghi chú: Ô trống giống với chủng chuẩn 16 Chñng GyrA ParC MIC (μg/ml) ATCC 49226 0,001-0,008 Ser-91 Asp-95 Asp-86 Ser-87 Glu-91 42 Phe Ala Asn 43 Phe Ala Asn 66 Phe Ala Asn 12 Phe Ala Asn 32 12 Phe Ala Asn 38 12 Phe Ala Asn 49 12 Phe Ala Asn 51 12 Phe Ala Asn 53 12 Phe Gly Arg 55 12 Phe Ala Asn 61 12 Phe Ala Asn 68 12 Phe Ala Asn 71 12 Phe Ala Asn 30 16 Phe Ala Gln 32 Phe Asn Ile 32 Phe Gly Arg 32 Phe Asn Ile 10 32 Phe Asn Ile 16 32 Phe Gly Gln 18 32 Phe Gly Gln 22 32 Phe Gly Gln 25 32 Phe Gly Arg 29 32 Phe Asn Ile 35 32 Phe Gly Arg 44 32 Phe Gly Arg 48 32 Phe Gly Arg 52 32 Phe Asn Ile 57 32 Phe Gly Gln 58 32 Phe Gly Arg 59 32 Phe Ala Ile 65 32 Phe Ala Arg 70 32 Phe Gly Arg 72 32 Phe Ala Asn 74 32 Phe Asn Ile 14 32 Phe Ala Asn Ghi chú: Ô trống giống với chủng chuẩn 17 3.4.6 Số lợng đột biến gen gyrA parC theo mức độ kháng ciprofloxacin Bảng 3.23 Số lợng đột biến gen gyrA parC theo mức ®é kh¸ng ciprofloxacin (n=69) MIC (μg/ml) 1,5 12 16 32 Tỉng Sè chđng (n=69) 10 10 21 69 Tû lÖ (%) 4,3 5,8 14,5 10,1 7,2 11,6 14,5 1,4 30,4 100 Số lợng đột biến gyrA 2 2 2 2 18 Sè l−ỵng đột Tổng số đột biến biến parC gen 0-1 2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 3 3 3 6-9 24-27 3.4.7 Phân tích đột biến gen gyrA Bảng 3.24 Phân tích đột biến gen gyrA 69 chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin (n=69) Loại ®ét biÕn (n=69) Sè chđng (%) MIC trung b×nh (μg/ml) 69 (100) 14,4 Ser-91 → Phe Asp-95 → Ala 44 (63,8) 9,5 Asp-95 → Gly 19 (27,5) 20,2 Asp-95 → Asn (8,7) 32,0 3.4.8 Phân tích đột biến gen parC Bảng 3.25 Phân tích đột biến gen parC 69 chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin (n=69) Loại đột biến (n=69) Số chủng (%) MIC trung bình (g/ml) Không đột biến 11 (15,9%) 1,77 (4,3%) 4,33 Asp-86 → Asn Ser-87 → Asn 31 (44,9%) 10,24 Ser-87 → Arg 12 (17,4%) 23,00 Ser-87 → Ile (10,1%) 32,00 Glu-91 → Gln (7,2%) 28,80 18 3.4.9 Phối hợp đột biến gen Bảng 3.26 Phối hợp đột biến gen (n=44) Các chủng mang đột biến Ser91Phe Asp95Ala gen gyrA (n=44) Không kèm đột biến parC Kèm đột biến parC Số chủng (%) (20,5) 35 (79,5) MIC trung b×nh (μg/ml) 1,78 11,49 3.4.10 Mèi liên quan MIC đột biến Bảng 3.27: Mối liên quan MIC đột biến (n=71) MIC (g/ml) 0,002-0,060 1-2 1-2 3-32 Tỉng Sè chđng (%) (2,8) 11 (15,5) (8,5) 52 (73,2) 71 (100) Sè l−ỵng ®ét biÕn 3 Ch−¬ng 4: Bμn luËn 4.1 Tû lƯ nhiƠm vi khn lËu ë bƯnh nh©n có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007 Từ 2005 đến 2007, tổng số 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám Viện Da liễu Quốc Gia đợc thực xét nghiệm: nhuộm soi trực tiếp, nuôi cấy phân lập đà phát đợc 503 chủng vi khuẩn lậu chiếm tỷ lệ 9,9% Kết nghiên cứu thấp nghiên cứu Nguyễn Văn Huân cộng (1998) Quảng Ninh 17,12% tơng đơng với kết Diệp Xuân Thanh nghiên cứu Viện Da liễu Quốc Gia (1998), tỷ lệ 10,05% Sở dĩ có khác vỊ tû lƯ nhiƠm vi khn lËu lµ mÉu nghiên cứu lớn, thời gian nghiên cứu dài Tû lƯ nhiƠm vi khn lËu cao hay thÊp cßn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: bệnh nhân đà sử dơng kh¸ng sinh hay ch−a sư dơng kh¸ng sinh, kinh nghiệm kỹ xét nghiệm viên, chất lợng phòng xét nghiệm, trình độ hiểu biết bệnh tật bệnh nhân Theo nghiên cứu Creighton cộng (2003) Khoa Hoa liễu bệnh viƯn Hoµng gia Anh cho biÕt tû lƯ nhiƠm vi khuẩn lậu 18,8% Nghiên cứu Van der Pol (2001) t¹i Uganda tû lƯ nhiƠm vi khn lậu 3,4% Kết nghiên cứu thấp kết Creighton Anh, Adaskevich Belarus cao so với kết nghiên cứu tác giả khác giới nh Van der Pol Uganda 19 4.2 So sánh tû lƯ ph¸t hiƯn vi khn lËu cđa kü thuật: PCR, nhuộm soi nuôi cấy Các kỹ thuật sinh học phân tử đà đợc áp dụng rộng rÃi giới từ nhiều năm Đặc biệt, kể từ sau kỹ thuật PCR đời (nửa đầu năm 1980), sinh học phân tử đà có bớc tiến vợt bậc Ngời ta đà thao t¸c víi c¸c vËt liƯu di trun nh− ADN, ARN phòng thí nghiệm Thêm nữa, việc tổng hợp vật liệu di truyền với số lợng lớn đà không vấn đề khó khăn Nhiều dự án giải trình tự gen nhiều động vật, thực vật vi sinh vật đà đợc tiến hành Một công trình nghiên cứu lớn y sinh học "Dự án Gen ngời" ë ViƯt Nam, viƯc ¸p dơng c¸c kü tht sinh học phân tử lĩnh vực khoa học nói chung y sinh học nói riêng đợc triển khai vòng 20 năm Nhiều đề tài dự án nghiên cứu đà đợc triển khai nh»m ¸p dơng c¸c tiÕn bé cđa khoa häc vào nghiên cứu, sản xuất, chẩn đoán điều trị nghiên cứu phục vụ sản xuất thuốc, chế phẩm sinh học, vacxin đà đợc triển khai Trong lÜnh vùc Y häc PCR cã rÊt nhiỊu øng dơng việc xác định nguyên bệnh nhiễm trïng nh− Chlamydia ®−êng sinh dơc, phong, lao Trong tổng số 500 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đợc dùng đồng thời ba kỹ thuật nhuộm soi, nuôi cấy PCR Kỹ PCR phát có 141 bệnh nhân dơng tính chiếm tỷ lệ 28,2%, nuôi cấy phát có 65 bệnh nhân dơng tính chiếm tỷ lệ 13% nhuộm soi phát có 53 bệnh nhân dơng tính chiếm tỷ lệ 10,6% Trong số 65 bệnh nhân dơng tính kỹ thuật nuôi cấy thử đầy đủ tính chất sinh vật hóa học kỹ thuật PCR cho kết dơng tính với 64 bệnh nhân, bệnh nhân kỹ thuật PCR lại cho kết âm tính Mẫu đà đợc làm làm lại nhng kết PCR âm tính Điều giải thích ADN vi khuẩn không đợc tách triết tác dụng hóa chất, mồi, nên sản phẩm trình nhân gen, điện di, nên cho kết âm tính chủng vi khuẩn lậu plasmid pJD1 nên sản phẩm trình khuếch đại, điện di cho kết âm tính phù hợp với nhiều tác giả khác giới nghiên cứu loại plasmid pJD1 có chung nhận xét: plasmid pJD1 cã ë 96% sè chđng vi khn lËu Theo th«ng báo Gaydos cộng thuộc trờng Đại học Y Johns Hopkins trờng Đại học Công cộng vệ sinh Baltimore, Maryland, tác giả tiến hành xét nghiệm PCR dịch âm đạo cho 793 phụ nữ quân nhân lứa tuổi hoạt động tình dục mạnh đến khám phòng khám STD đà phát 3,3% số nữ quân nhân nhiễm vi khuẩn lậu, nuôi cấy phát 2,1% Boel Van Herk 20 phòng xét nghiệm vi sinh thuộc Bệnh viện Catharina, Veldhoven vµ Khoa Da liƠu ë Eindhoven, Hµ Lan cho biết: nghiên cứu 765 bệnh nhân nam nữ đợc lấy bệnh phẩm sinh dục hầu họng để xét nghiệm PCR chẩn đoán vi khuẩn lậu, có 229 bệnh phẩm đợc khẳng định dơng tính chiếm tỷ lệ 30% Để so sánh tỷ lệ phát hiƯn vi khn lËu cđa kü tht PCR, kü tht nhuộm soi kỹ thuật nuôi cấy, tiến hành đồng thời ba kỹ thuật 500 bệnh nhân đợc chia làm hai nhóm Nhóm nhóm bệnh nhân đợc chẩn đoán viêm niệu đạo, âm đạo cấp (cấp tính) tỷ lệ phát bệnh là: 93%, 58,1% 66,3% nhng không thấy có khác biệt nhiều ba kỹ thuật Sự khác biệt đặc biệt rõ nhóm 2: nhóm bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo (mạn tính) nhng kỹ thuật PCR phát đợc 61 (14,7%) bệnh nhân dơng tính kỹ thuật cổ điển nh nuôi cấy phát đợc 8(1,9%) nhuộm soi tỷ lệ phát lại thấp phát đợc (0,7%) bệnh nhân Nh vËy tû lƯ ph¸t hiƯn bƯnh b»ng kü tht PCR cho kết cao (gấp 20 lần kỹ thuật nhuộm soi lần kỹ thuật nuôi cấy) Vậy kỹ thuật PCR đợc khuyến cáo trờng hợp lậu mạn tính kỹ thuật khác không phát đợc mà bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng Chính vậy, chẩn đoán bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đợc chẩn đoán bệnh Lậu mạn tính cần làm xét nghiệm nhuộm soi làm thêm xét nghiệm PCR nghi ngờ Không nên lựa chọn đồng thời ba kỹ thuật chẩn đoán bệnh Lậu mạn gây nhiều phiền hà cho bệnh nhân tốn Nhng điều lại hạn chế nhà giám sát kháng kháng sinh muốn khoanh vùng cô lập chủng vi khuẩn lậu kháng thuốc để thông báo nớc quốc tế tình hình kháng kháng sinh chúng từ có biện pháp can thiệp hữu hiệu Với tình hình sử dụng kháng sinh tuỳ tiện không theo định điều trị nh kỹ thuật PCR kỹ thuật lý tởng đợc áp dụng để phát vi khuẩn lậu giai đoạn Tuy mẫu nghiên cứu với số lợng cha lớn nhng phần ®¸nh gi¸ ®óng vỊ tû lƯ nhiƠm vi khn lËu nớc ta bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo 4.3 Kháng kháng sinh vi khuẩn lậu từ năm 2005-2007 - Penicillin Từ nghiên cứu tác giả nớc với nghiên cứu mình, nhận thấy tỷ lệ vi khuẩn lậu đề kháng với penicillin giảm dần qua năm Có lẽ penicillin đợc sử dụng điều trị bệnh Lậu nhiễm khuẩn khác nên vi khuẩn lậu đà giảm tính 21 đề kháng với kháng sinh qua năm: 61,7% (2005), 54,2% (2006) 41,9% (2007) - Tetracyclin Tetracyclin thờng không đợc khuyến nghị để điều trị bệnh Lậu kháng sinh phải đợc dùng với nhiều liều vài ngày, làm tăng khả tuân thủ điều trị liều không Tuy nhiên, kháng sinh rẻ đợc sử dụng rộng rÃi, lĩnh vực y tế không quy Trong nghiên cứu tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại tetracyclin lại có xu hớng gia tăng: 9,88% năm 2005, năm 2006 16,51%, năm 2007 37,5% - Cephalosporin Tôi chọn cefotaxim vào nhóm bổ xung giá thành cefotaxim thấp nhiều so với ceftriaxon vµ cịng thc nhãm cephalosporin thÕ hƯ thø Dïng điều trị bệnh Lậu thấy kết tơng đối tốt, nhng gần đà xuất chủng giảm nhạy cảm với kháng sinh - Spectinomycin Kết nghiên cứu không thấy có chủng vi khuẩn lậu kháng lại kháng sinh spectinomycin Nh kháng sinh spectinomycin kháng sinh có tác dụng tốt điều trị vi khuẩn lậu Việt Nam víi liỊu sư dơng nhÊt g tiªm bắp - Azithromycin Azithromycin kháng sinh đợc WHO khuyến cáo phác đồ điều trị bệnh Lậu kết hợp với Chlamydia trachomatis Nghiên cứu năm qua cho thấy số chủng vi khuẩn lậu đà giảm nhạy cảm với azithromycin: 5,56% năm 2005, 1,89% năm 2006, 0,81% năm 2007 - Ciprofloxacin Ciprofloxacin kháng sinh đợc bác sỹ bệnh nhân tin dùng bệnh nhiễm trùng nói chung bệnh Lậu nói riêng Kết nghiên cứu tỷ lệ chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin: năm 2005 80,86%, năm 2006 82,07%, năm 2007 89,14%, cao thông báo Lê Thị Phơng năm 2001 tơng đơng với thông báo số nớc khu vực Vì ciprofloxacin không nên đa vào danh mục kháng sinh sử dụng điều trị bệnh Lậu Việt Nam Khi nghiên cứu kháng kháng sinh chủng vi khuẩn lậu phân lập đợc Viện Da liễu Quốc Gia, hiểu biết chế đề kháng chế di truyền đề kháng kháng sinh vi khuẩn đà giúp đợc nhiều cho thầy thuốc lâm sàng công tác điều trị Vi khuẩn lậu kháng kháng sinh chủ yếu đột biến nhiễm sắc thể đà làm xuất chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh quần thể vi khuẩn nhạy cảm, đặc biệt liều điều trị thấp, không đạt nồng độ tiêu 22 diệt vi khuẩn có mặt kháng sinh trở thành chất chọn lọc, giữ lại vi khuẩn đề kháng 4.4 Đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin Muốn xác định đợc điểm đột biến gen ta phải giải trình tự đoạn gen liên quan so sánh với đoạn gen gốc Hai phơng pháp xác định trình tự phơng pháp hóa học Maxam Gilbert (1977) phơng pháp kết thúc chuỗi Sanger cộng (1977) Dù khác nguyên tắc, hai phơng pháp có số điểm chung: hình thành tập hợp nhiều oligonucleotid có chiều dài khác nhau, oligonucleotid có xác xuất xuất phản ứng Các trình tự sau đợc phân tách dựa vào kích thớc oligonucleotid kỹ thuật điện di gel polyacrylamid có khả phân tách hai trình tù chØ c¸ch nucleotid Víi viƯc sư dơng kh¸ng sinh tïy tiƯn nh− hiƯn ë n−íc ta nh số nớc giới đà làm gia tăng tính kháng thuốc vi khuẩn lậu; nguy hại nhiều gen kháng kháng sinh khác đà đợc tìm thấy vi khuẩn lậu Mặc dï bƯnh LËu ë n−íc ta chiÕm mét tû lƯ tơng đối cao, nhng việc nghiên cứu cách có hệ thống đề kháng kháng sinh vi khuẩn lậu hạn chế Khoa Xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia thống kê hàng năm: mức độ đề kháng ciprofloxacin vi khuẩn lậu phân lập năm 2007 89,15% (MIC lên tới 32 g/ml) Việt Nam công trình nghiên cứu ®ét biÕn gen kh¸ng ciprofloxacin cđa vi khn lËu Khi nghiªn cøu 71 chđng vi khn lËu, cã chđng nhạy cảm với ciprofloxacin 69 chủng kháng ciprofloxacin, tiến hành giải trình tự Khoa Xét nghiệm-Viện bệnh truyền nhiễm Quốc Gia, Nhật Bản để xác định điểm đột biến liên quan đến đề kháng ciprofloxacin vi khuẩn lậu Kết nh sau: chủng nhạy cảm không thấy có điểm đột biến Phân tích 69 chủng đề kháng (MIC = 1-32 g/ml) nhận thấy: chủng đề kháng có thay đổi gen gyrA parC Các chủng đề kháng có đột biến Ser-91 thành Phe Ngoài ra, gen gyrA phát đột biến Asp-95 tất chủng kháng ciprofloxacin với kiểu đột biÕn lµ Asp-95 thµnh Ala (chiÕm 63,8%), Asp-95 thµnh Gly (chiếm 27,5%) Asp-95 thành Asn (chiếm 8,7%) Những đột biến gen gyrA parC dẫn đến thay đổi axit amin protein GyrA (đặc biệt Ser-91 Asp-95) protein ParC liên quan mật thiết với tính kháng ciprofloxacin Nghiên cứu tơng tự U Chaudhry cộng Về số lợng đột biến gen gyrA parC nghiên tôi: chủng đề kháng yếu (MIC g/ml) có đột biến gen gyrA có đột biến gen parC, chđng MIC ≥ μg/ml ®Ịu cã ®ét biÕn gen nói trên; nh mức độ kháng ciprofloxacin có liên quan đến số lợng đột biến điều 23 giống số nghiên cứu khác giới Về đột biến gen parC, nghiên cứu cho thấy: xuất đột biến kiểu đột biến có liên quan mật thiết ®Õn møc ®é ®Ị kh¸ng ciprofloxacin cđa vi khn lËu; cụ thể chủng có đột biến Asp-86 thành Asn có mức đề kháng thấp Những chủng mang đột biến Ser-87 thành Asn có mức đề trung bình Những chủng có mức đề kháng cao chủng mang đột biến Glu-91 thành Gln Ser-87 thành Ile; đột biến gen parC kèm với đột biến gen gyrA, đột biến đơn độc parC, đặc biệt thấy đột biến đơn mà không thấy đột biến kép parC nghiên cứu giống với nghiên cứu Tiffany R Shultz cộng Sydney, úc nhng lại khác với nghiên cứu khác codon 91 gyrA, đột biến Ser-91 thành Phe, tác giả thấy đột biến Ser-91 thành Tyr, thấy kiểu đột biến Ser-91 thành Phe Nh chủng mà nghiên cứu có nguồn gốc từ chủng chủng phổ biến cho khu vực Kết nghiên cứu đà chứng minh đề kháng vi khuẩn lậu với ciprofloxacin, thuốc mà đợc xem nh liệu pháp hàng đầu vào năm 1990, đà tăng lên nhanh chóng với mức MIC cao đáng báo động với đột biến vi khuẩn lậu Nếu giám sát liên tục kháng kháng sinh cđa vi khn lËu, víi khuynh h−íng ngµy cµng gia tăng chủng đa đề kháng lan truyền cộng đồng, thất bại điều trị tránh đợc, dẫn tới lây nhiễm lan tràn gây nhiều biến chứng làm ảnh hởng đến xà hội, kinh tế, gia đình giống nòi Kết ln Tû lƯ nhiƠm vi khn lËu ë bƯnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007 (n=5.091) Là 9,9% kỹ thuật nuôi cấy So s¸nh tû lƯ ph¸t hiƯn vi khn lËu cđa kỹ thuật PCR, nhuộm soi nuôi cấy(n=500) Kỹ thuật PCR cho kết cao (28,2%), đến kỹ thuật nuôi cấy (13,0%) kỹ thuật nhuộm soi (10,6%) Kh¸ng kh¸ng sinh cđa c¸c chđng vi khn lậu phân lập đợc Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007 (n=503) + Tỷ lệ kháng kháng sinh nhóm năm 2005-2006-2007: Ciprofloxacin 80,9% - 82,1% - 89,2% Penicillin lµ 35,2% - 31,1% - 37,2% Tetracyclin lµ 9,9% - 16,5% - 37,5% 24 100% sè chñng nhạy cảm với ceftriaxon spectinomycin + Tỷ lệ giảm nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ sung năm 2005-2006-2007: azithromycin lµ 5,6% - 1,9% - 0,8%; cefotaxim lµ 1,2% - 0,9% - 3,1% Đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin (n=71) - Đột biến gen kháng ciprofloxacin cđa vi khn lËu trªn gen gyrA: + 100% sè chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Ser-91 thành Phe + 63,8% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Asp-95 thành Ala - Đột biến gen kháng ciprofloxacin vi khuẩn lậu gen parC: + 15,9% số chủng kháng ciprofloxacin đột biến + 44,9% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Ser-87 thành Asn - Mối liên quan MIC đột biến: Các chủng nhạy cảm (MIC 0,002-0,060 g/ml) đột biến MIC cao thấy xuất nhiều đột biến gen gyrA parC Sự phối hợp đột biến parC có ảnh hởng đến kháng kháng sinh ciprofloxacin vi khuẩn lậu Khuyến cáo Phải tuyên truyền giáo dục y tế thờng xuyên phơng tiện thông tin đại chúng an toàn quan hệ tình dục Nên áp dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán trờng hợp lậu mạn, lậu đờng tiết niệu sinh dục trờng hợp đà thực xét nghiệm thông thờng không thấy Thờng xuyên giám sát kháng kháng sinh để thông báo nớc quốc tế tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn lậu từ có biện pháp khoanh vùng chủng đa kháng thuốc Giám sát gen kháng thuốc để phục vụ chiến lợc sử dụng kháng sinh hợp lý giai đoạn thĨ ... khám Vi? ??n Da liễu Quốc Gia từ năm 200 5- 2007 - So s¸nh tû lƯ ph¸t hiƯn vi khn lËu kỹ thuật: PCR, nhuộm soi nuôi cấy - Tìm hiểu kháng kháng sinh chủng vi khuẩn lậu phân lập đợc Vi? ??n Da liễu Quốc Gia. .. đợc Vi? ??n Da liễu Quốc Gia từ năm 200 5- 2007 (n=503) + Tỷ lệ kháng kháng sinh nhóm năm 200 5- 200 6-2 007: Ciprofloxacin 80,9% - 82,1% - 89,2% Penicillin lµ 35,2% - 31,1% - 37,2% Tetracyclin lµ 9,9% -. .. yếu tố kỹ thuật đảm bảo chất lợng, từ khẳng định kết kháng sinh đồ chủng vi khuẩn lậu phân lập đợc xác 9 + Kỹ thuật xác định MIC vi khuẩn lậu (E-test) Tiến hành: lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu hoà