Đang tải... (xem toàn văn)
Nối tiếp nội dung phần 1, phần 2 giáo trình Di truyền và chọn giống thủy sản trình bày các nội dung: Các phương pháp cải thiện di truyền cá, công nghệ di truyền trong thủy sản. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
CHƯƠNG V CÁC PH Ư Ơ N G PH ÁP C ẢI TH IỆN DI T R U Y Ề N CÁ Thuần hóa di nhập giống (domestication & introduction) 1.1 Thuần hóa 1.1.1 Khái niệm Khái niệm hóa khơng đơn để hoạt động ni giữ loài động vật hoang dại nhà hay trang trại, mà tiến trình q trình sinh trưởng, dinh dưỡng sinh sản cùa vật ni điều khiển người; q trình biến đổi khiến cho vật ni có đặc điểm khác biệt so với tổ tiên hoang dã (có thể cịn nữu hay tuyệt chủng) Như sinh vật hóa định nghĩa “loài vật biến đổi di truyền tác động trực tiếp người” Theo Liao Huang (2000), sinh vật hoá định nghĩa (i) cá thể có giá trị sử dụng ni với mục đích cụ thể, (ii) sinh sản điều kiện nuôi giữ hay sinh sản điều khiển bời người, (iii) có tập tính sống khác biệt so với tổ tiên, (iv) có biến đổi hình thái (kích cỡ, màu sắc) đặc điểm hồn tồn khơng có sinh vật hoang dã, (v) số cá thể khơng thể sống sót thiếu bảo vệ người Với định nghĩa trên, chi có vài lồi ni thủy sản xem hóa thí dụ trường hợp cá chép Cyprinus carpio, cá vàng Carassius auratus, hay cá rô phi đỏ Thường nuôi trồng thủy sản, thuật ngữ hóa đề cập đến tiên trình làm cho sinh vật thích nghi với điều kiện ni có khía cạnh quan tâm đến cải thiện tăng trưởng điều khiển sinh sản (Hassin et al., 1997) Khi trình sinh sản điều khiển người qua nhiều hệ, vật nuôi có biến đổi có ý nghĩa tập tính và/hoặc hình thái Điều khiển sinh sản cùa vật ni điều kiện nhân tạo nhằm mục đích phục vụ cho lợi ích người làm thực phẩm, hàng hóa, thú vui (sinh vật cảnh), giống ni tái tạo quần đàn Q trình điều khiển sinh sản thường chi giới hạn việc kích thích thành thục phóng thích sản phẩm sinh dục, điều khiển q trình phát triển phơi, ương ni cá bột đến hết giai đoạn biến thái M ột 82 hệ (đạt điều kiện nuôi) thành thục sinh dục sinh sản thành công điều kiện nuôi giữ, thi chu kỳ điều khiển sinh sản hoàn tất Điều kiện tất yếu để hóa thành cơng điều khiển sinh sản phải hoàn tất liên tục qua nhiều hệ (P —> F1 —* F2 —►F3) mà khơng có bổ sung cá thể có nguồn gốc hoang dã (Bilio, 2007) Trớ ngại quan trọng điều khiển sinh sản hóa xảy cận huyết mức độ cao, q trình hóa phải thực với chọn lọc để tạo dịng chùng với biếu tính trạng ổn định Như vậy, hóa ni trồng thủy sản tiến trình điều khiến vịng đời điều khiển sinh sàn vật nuôi điều kiện nuôi giữ biểu diễn Hinh 5.1 Tác động THUẦN HÓA chọn lọc Sinh vật tự nhiên sinh sản 4— »Hoạt động — ►Những cá thể có - ► nguồn bố mẹ nuôi giư - Thức ăn tư nhiên - Địch hại nuôi dưÕDg - Dê bị bệnh - Sốc biêu biên tơt t hẻ ^ Hình 5.1: Khái niệm hóa ni thủy sản (theo Liao Huang, 2000) 1.1.2 K ết hóa Theo số liệu thống kê FAO (1998) khoảng 465 lồi thủy sản ni thuộc 107 họ thành cơng việc hóa chi đạt số lồi cá chép, cá hồi, cá lồi cá trơn, cá rơ Phi tơm nước (trích Liao Huang, 2000) Thuần hóa thực điều kiện nuôi giữ, nơi mà môi trường sống có khác biệt lớn so với tự nhiên, dễ gây sốc làm sinh trưởng động vật hoang dã bị rối loạn Sự rối loạn có nhiều nguyên nhân cạnh tranh cá thể (mạnh yếu), điều kiện môi trường sống (không gian, thức ăn, chất lượng nước ) bảo vệ người kết tạo nên biến đổi tập tính sống chí biến đổi sinh lý hình thái Ánh hưởng q trình hóa quan sát sau hệ Các dịng cá hóa thường phát triển tốt dòng 83 tự nhiên mơi trường ni Thí dụ tốc độ tăng trưởng cá nheo Ictalurus punctatus tăng 3-6% sau hệ điều kiện ni giữ Dịng cá nheo Kansas hố sớm nhất, có tốc độ tăng trưởng nhanh tất dịng cá nheo có (Dunham ctv., 2001) Trong điều kiện ni, hình dạng cá thay đổi: tỉ lệ đầu nhỏ hom, chiều cao thân lớn hơn, số lượng xương giảm Ngồi ra, hố ảnh hường lớn đến tập tính sinh sản cá Cá măng Chanos chanos có nguồn gốc sinh sản nhân tạo thành thục khoảng 5-6 tuổi sớm hom so với tuổi thành thục cá tự nhiên 6-7 tuổi (trích Liao Huang, 2000) Mặc khác, chế độ dinh dưỡng cao sử dụng loại hormon kích thích sinh sản làm cho sinh sản loài cá ni khơng thể tính mùa vụ số lồi sinh sản nhiều lần năm Trong giai đoạn đầu tiến trình hóa, biến đổi tính trạng gây bời biến động mơi trường thích ứng sinh vật sở đê thực việc chọn lọc nhũng cá thể có biểu tốt Do đó, việc sử dụng dịng cá hóa dịng mang tính trạng mong muốn bước việc ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm cải thiện giống lồi cá ni 1.1.3 Ý nghĩa cùa q trình hóa Lợi ích hóa: Thuần hóa làm tăng sản lượng suất đối tượng nuôi nhờ biện pháp chọn lọc, lai tạo Bảng 5.1 cho thấy tổng sản lượng lồi cá hóa đứng đầu danh sách (có sản lượng 100.000 tấn) chiếm 2/3 tổng sản lượng nuôi trồng thủy sàn giới Điều khiển sinh sản chủ độnẹ sản xuất giống: phẩn lớn lồi cá ni khơng tự sinh sản điều kiện ni giữ điều khiển cho sinh sản nhiều kỹ thuật khác tiêm chất kích thích sinh sản, thay đổi chu kỳ sáng tối, thay đổi nhiệt độ, kỹ thuật cắt mắt tơm Tuy nhiên, chưa có bàng chứng rõ ràng mối liên hệ phương pháp kích thích sinh sản mức độ hóa Trong nhiều trường hợp, cá thành thục tốt điều kiện nuôi giữ, cần thiết phải kích thích sinh sản thụ tinh nhân tạo đặc biệt trường hợp cần sản xuất lượng lớn giống thời điểm định Kiểm soát vấn đề dịch bệnh: kỹ thuật chọn lọc, lai tạo tiến trình hóa cải thiện sức đề kháng bệnh vật ni tạo dịng vật ni kháng bệnh 84 Bảng 5.1: Sàn lượng cùa loài cá hóa giới, (theo Bilio, 2007) TT Lồi Tên khoa học Sản lượng Mơi Mức trường hoa F(B,M) e F(B) e F(B,M) e F e 00 F,B Cá mè trắng Cá trám cỏ Cá chép Cá mè hoa Cá rô phi Cá hồi Thái Bình Dương Hypophthalmichthys molitrix Ctenopharyngodon idella Cyprinus carpió Aristichthys nobilis Oreochromis niloticus 3.979.292 3.876.868 3.387.918 10 1.6 8 1.495.744 Salmo salar 1.244.637 M,F,B 00 Cá trôi đen (rohu) Cá trôi catla Cá trôi mrigal 10 Cá hồi vân 11 Cá nheo Mỹ 12 Cá hồi bạc 13 Cá vền 14 pirapatinga Cá chẽm châu 15 Âu Labeo rohita Catla catla Cirrhinus cirrosus Oncorhynchus mykiss Ictalurus punctatus Oncorhynchus kisutch Sparus aurata Piaractus mesopotamicus F 761.123 615.576 F 573 657 F 504.876 F,M,B 351.357 F 100.967 M,F 90.995 M(B,F) 87.636 F 00 00 Dicentrarchus labrax 49.103 M,B(F) >3 16 Cá đù đỏ Sciaenops ocellatus 46.072 M(B) 17 Cá chèm Lates calcarifer 29.899 B,M(F) 18 Cá mè vinh Barbonymus gonionotus 23.541 F,B 00 19 Cá trê phi Ciarías gariepinus 23.115 F 00 20 Cá hồi 21 Cá giị (bcrp) Tơm thè chân 2 trắng Salmo trutta Rachycentron canadum 22.183 F(M,B) 20.461 M >2 1.386.382 B,M(F) 00 23 Tôm sú Penaeus monodon Penaeus vannamei 24 Tôm xanh Macrobrachium rosenbergii e 00 00 >5 00 00 721.793 B,M(F) 5-10 194.159 F,B (M ) 00 56.806 B,M 25 Tôm nương Penaeus chinensis 26 Tơm he Penaeus oríentalis >200.000 00 27 Hàu Atlantic Crassostrea gigas 4.429.337 M,B 00 28 Vẹm xanh Mvtilus edulis 526.987 M 2 00 Argopecten irradians 450.000 29 Điệp Trong đó: F: nước n gọt; B: nước lợ; M: biển; e: xác lập quần đàn, 2,3 : so hệ hóa; oo; hóa 85 Những bất lợi hóa: Thuần hóa làm giảm đa dạng di truyền dẫn đến tượng cận huyết quần thể nguyên nhân chọn lọc tượng lạc dòng di truyền (random genetic driff) giới hạn kích cỡ quần thể Cá hồi chấm hồng Salvelinus /ontinalis cá hồi vân Oncorhyrtchus mykiss hóa có tỉ lệ nở tỉ lệ sống thấp, dễ mẫn cảm với mầm bệnh mức độ đa dạng di truyền thấp hom cá có nguồn gốc hoang dã (theo Liao Huang, 2000) Quần thể cá hóa với tính đa dạng di truyền thấp khả sinh sản tạo thành quần đàn lớn, chí lớn hon quần thể cá tự nhiên Sự thất cá hóa ngồi mơi trường gây ảnh hường xấu đến đa dạnp di truyền quần thể tự nhiên phần lớn biến dị di truyền bị q trình hóa; hình thành quần thể cạnh tranh với quần thể cá tự nhiên làm giảm số lượng thay đổi phân bố quần thể cá tự nhiên 1.1.4 Nhũng vấn đề cần lưu ỷ trước hóa Cả ỵếu tố sinh học môi trường cần phải xem xét trước tiến hành hóa đối tượng thủy sản Yếu tố sinh học: Trong giai đoạn đầu cùa tiến trình hóa yếu tố ảnh hưởng đến thay đổi tính trạng vật ni nhi thích nghi, sức sinh sản, ti lệ sống cần phải ý Để đánh giá đối tượng có thích hợp cho hóa nghề ni thủy sàn, thường người ta dựa vào đặc điểm: Tốc độ tăng trường nhanh Giá trị kinh tế cao Khả chống chịu sốc tốt Chu kỳ sống đom giản - Thích nghi tốt với thức ăn nhân tạo Duy trì đặc điểm di truyền trình hóa Yếu tố mơi trường: Sự biến động điều kiện môi trường tạo biến dị thay đổi biểu tính trạng Thường điêu kiện mơi trường thuận lợi, tính trạng tốt hình thành trì, ngược lại, điều kiện mơi trường bất lợi tạo tính trạng khơng mong muốn Do đó, cần chọn mơ hình nuôi phương tiện nuôi phù hợp: nuôi ao/lồng nuôi nhà, nuôi 86 đơn, nuôi ghép, nuôi thâm canh hay quảng canh Đôi yếu tố thủy văn (nhiệt độ, lượng mưa, độ mặn cùa nước ), vị trí địa lý phải xem xét việc kiểm sốt yếu tố thường khó tốn 1.1.5 Các bước tiến trình hóa Một tiến trình hóa thơng thường chia thành giai đoạn (Bilio, 2007): Bắt đằu hóa: làm cho sinh vật thích nghi với điều kiện ni giữ tiến hành q trình điều khiển sinh sản; Xác lập mục đích hóa: chọn lọc tính trạng muốn đạt loại trừ đặc điểm không phù hợp với mục đích hóa; Tạo dịng thuần: di truyền biểu tính trạng ổn định đáp ứng yêu cầu sản xuất giống Một đối tượng hóa thành cơng kết trình lâu dài với nghiên cứu bản, ứng dụng thu thập thông tin liên quan thực tế ni giữ lồi Vì vậy, tiến hành hóa, nghiên cứu cần thực trước tiên là: - Các đặc điểm sinh học đối tượng hóa mơi trường sống tự nhiên chúng như: vị trí sinh học lồi; chu kỳ sống (kích thước, tỉ lệ giới tính, mùa sinh sản); đặc điểm dinh dưỡng (tính ăn, nhu cầu dinh dưỡng); tập tính sống (vùng phân bố, cạnh tranh); tử vong (bệnh, địch hại) Khảo sát đặc điểm môi trường tự nhiên mà loài sinh Bống yếu tố thời tiết (nhiệt độ, lượng mưa, mùa vụ); chất lượng nước (pH, oxy hịa tan, độ mặn, COD, độ trong); tính chất vật lý (áp suất, dòng chảy); đặc điểm đáy điều kiện khí hậu Do mơi trường ao nuôi hệ sinh thái nhân tạo với yếu tố mơi trường gây hại cho đối tượng hóa, cần thiểt tiến hành nghiên cứu ngưỡng sinh lý (nhiệt độ, pH, oxy, độ mận), mật độ, khả chịu đựng sốc độc chất, khả kháng bệnh 1.1.6 Các phương thức áp dụng q trình hóa Chọn loài: loài cá địa đối tượng ưu tiên để hóa chúng dễ thích nghi với mơi trường địa phương, tốn 87 chi phí cho giai đoạn bắt đầu hóa, kiểm soát tác động bất lợi đến hệ sinh thái đa dạng sinh học tự nhiên Trong loài nhập nội phải thiết lập hệ thống kiểm soát chặt chẽ đánh giá tác động đến môi trường Chọn giai đoạn, giai đoạn bột đến giống thường dễ thích nghi với môi trường hom so với giai đoạn trưởng thành Kiểm sốt chế độ dinh dưỡng, hóa chọn cá thể có tốc độ tăng trường nhanh thơng qua thí nghiệm kiểm sốt thức ăn với loại thức ăn lượng cho ăn khác Chọn lựa hình thức ni: giai đoạn đầu hóa, đưa lồi khác khơng cạnh tranh vào nuôi môi trường đối tượng nghiên cứu nhằm tri chất lượng nước ổn định (như lồi cá ăn lọc, nhuyễn thể khống chế phát triển tảo), có chức nănệ lồi thị cho điều kiện mơi trưịmp hóa v ề mặt cân dinh dưỡng, đối tượng hóa phải lấy phần thức ăn từ nguồn thức ăn tự nhiên có mơi trường ni Với số lồi địi mơi trường nước có hàm lượng oxy hịa tan cao hình thức ni lồng, ni hệ thống nước d y hợp lý Điều khiển sinh sản nhân tạo: kích thích sinh sản nhân tạo hoạt động quan trọng tiến trình hóa Một số lồi có khả tự sinh sản điều kiện ni giữ có nhiều lồi sinh sản sử dụng kỹ thuật kích thích phù hợp Kỹ thiật sử dụng hiệu tiêm chất kích thích Sau tiêmchất kích thích, có lồi tự thải sản phẩm sinh dục (như cá chtp c carpió, cá vàng C:auratus, cá mè trắng H molitrix) m ơtsố lồi phải dùng biện pháp vl trứng, vuốt linh (như lồi iroig hụ Pangasiidae) phải giải phẫu cá-đực (họ cá trê Clariidae) Tuy nhiên, kỹ thuật có yếu điểm cá dễ bị sốc xây sát hoạt động bắt cá (tiêm, thăm trứng, vuốt trứng ) làm cho cá dễ m ẫrcảm với mầm bệnh 1.1.7 Những trở ngại q trình hóa đối tượng thùỊ sản Khó khăn sinh sản nhân tạo: nhiều lồi đẵ trở thành đối tượng nuôi phổ biến từ lâu, sinh sản nhân tạo thí chi thành cơng năm gần Ví dụ, thành cơng sinh sản nhân tạo cá trôi Ấn Độ, cá mè trắng vào năm 1960, tôm he Nhật p japonicus vào năm 1970 Cá chình châu Âu Anguilla anguilla cá chình Nhật A japónica đối tượng nuôi quan trọng sản xuất giống nhân tạo lồi chưa thành cơng Mậc dù việc kích thích sinh sản điều kiện ni giữ thực thành công, ương nuôi cá bột chưa hồn chỉnh Hiện tại, ương ni cá chình từ cá bột đến hết giai đoạn biến thái có kết lồi chình Nhật A japónica sản xuất giống để cung cấp cho thị trường chưa đạt Vì vậy, cá chình đối tượng điều khiển sinh sản Dinh dưỡng không p h ù hợp: nguồn cung cấp dinh dưỡng đối tượng hóa từ thức án nhân tạo Nhưng thức ăn có chất lượng tốt chất lượng thức ăn bị giảm trình bảo quản Trong tự nhiên, cá hồn tồn có hội lấy thức ăn tự nhiên để thỏa mãn nhu cầu dinh dưỡng Vì vậy, đối tuợng ni khơng lấy phần thức ăn tự nhiên có mơi trường ni dẫn đến số bệnh đo thiếu dinh dưỡng, làm giảm tốc độ tăng trưởng Thức ăn không phù hợp thường nguyên nhân gây tỉ lệ hao hụt cao giai đoạn cá bột Sự hình thành sản phẩm sinh dục liên quan chặt chẽ đến nguồn thức ăn cung cấp Vấn đề bệnh, mơ hình ni bán thâm canh, thâm canh, nguy xảy bệnh cao Bệnh xảy làm ảnh huờng xấu tăng trưởng, sinh sàn làm gián đoạn tiến trinh hóa Sốc (stress): tiến trình hóa, đối tượng ni dễ bị sốc mật độ khơng thích hợp, chịu tác động người nuôi nhốt, bắt giữ đặt biệt cá hoang dã làm rối loạn tăng trưởng, sinh sàn Khi bị sốc, hệ miễn dịch vật nuôi bị suy giảm, cá dễ mẫn cảm với mầm bệnh 1.2 Di nhập giống 1.2.1 Một sổ khái niệm Cá nhập nội: loài di chuyển khỏi vùng phân bố tự nhiên chúng Cá địa: lồi hình thành phân bố tự nhiên vùng sinh thái, địa lý định Di nhập giống: hoạt động người nhằm di chuyển lồi để ni giữ vùng ngồi vùng phân bố tự nhiên chúng (khơng chi từ quốc gia sang quốc gia khác mà cịn trường hợp di chuyển đến sơng, suối, ao, hồ mà trước khơng có phân bố cùa loài này) Hoạt động di nhập giống thường chì thực lần lồi nhập nội hình thành quần đàn vùng phân bố 89 1.2.2 Mục đích di nhập giống Việc di nhập hóa lồi cá, tơm thê giới kể đến việc di giống cá chép c carpió vào ni ao châu Âu vào thời kỳ La Mã cổ đại sau việc di nhập giốrg trờ nên phổ biến nhờ nhà truyền giáo Trung cổ (từ kỷ V đến XV) Cá nhóm sinh vật di nhập nhiều so với loài động vật thủy sản khác (624 lồi) nhón có nguy đe dọa cao (hơn 1200 lồi) Tuy nhiên, việc di giống lồi cá - tơm ngày tiếp tục diễn mạnh mẽ, kết số loài phân bố phạm vi tồn cầu trở thàn đối tượng :ủa nghề ni trồng thủy sản Phần lớn lồi cá, tơm du nhập với mục đích chủ định làm thực phẩm (51%), thể thao giải trí ( %), làm cảnh (21%), bổ sung cho khai thác (7%), kiểm soát sinh học cải tạo nâng cao chất lượng giống (Gozlan, 2008) Tuy nhiên, số giống lồi di nhập cách vơ tình có tác động bất lợi đến quần thể cá địa môi trường sinh thái tác động đến vùng khu trú, mang theo mầm bệnh, lai tạp giống ảnh hưởng đến nguồi gen cá địa Kết khảo sát 103 loài cá di nhập giã cho thấy hom Vi loài cá di nhập khơng có tác động lên hệ sinh thái chi có hom % lồi nhập nội có ảnh hưởng bất lợi đến mơi trường sinh thái (Gozlan, 2008) Có khác biệt giũa nước phát triển nước phát triển quan tâm cần >cem xét lựa chọn lồi cá tơm du nhập Các nước phát triển quan tâm nhiều đến vấn đề ảnh hưởng đến môi trường bảo tồn nguồn gen, nước phát triển mục tiêutăng suất, đảm bảo an ninh thực phẩm ý nhiều 1.2.3 Tác động cùa cá nhập nội Di nhập giống gây nên tác động bất lợi cho môi trường sinh thái cho khu hệ sinh vật địa Các tác động nÈy khó dự đốn trước bao gồm: Tác động đến m trường', lồi nhập nội làm bún đổi điều kiện mơi trường, làm thay đổi đặc điểm hệ sinhthái đe dọa tồn loài cá địa Cá chép c carpió rniột thí dụ, tập tính ăn đáy sục bùn để tìm mồi, thủy vực có cá chép sinh sống thường có độ thấp, hàm lượng BOD (tiêuhao oxy sinh học) tăng Độ giảm làm giảm phát triển phiêu sinh vật đồng nghĩa với suy giảm thức ăn tự nhiên lồi 90 địa Tơm hùm nước có tập tính đào hang làm tổ, gây thiệt hại nghiêm trọng cho bờ ao, đê đập ven sông Tác động cá dữ' Di nhập lồi cá gây thiệt hại nghiêm trọng cho quần thể cá địa cho hệ sinh thái Điều ghi nhận di nhập giống cá Nile perch Lates niloticus vào nuôi hồ Victoria châu Phi làm cho nhiều loài thuộc họ cá hoàng đế (Cichlidae) biến Nhiều loài cá biến di nhập giống cá hồi vào nuôi nhiều vùng giới có châu Mỹ Latin (Gozlan, 2008) Cạnh tranh' Cạnh tranh cá nhập nội cá địa vấn đề khó khăn thường đề cập đến di nhập giống Sự cạnh tranh xảy thức ăn, không gian sống, bãi đẻ tập tính sinh sàn (như làm tổ đẻ trứng) Như trường hợp di nhập cá rô phi vàn o niloticus làm biến số lồi cá rơ phi địa phương Khả phát triển quần đàn nhanh chóng cá rô phi đen o mossabicus dẫn đến gia tăng mật độ cá thể, làm giảm tăng trưởng kích thước cá thể Điều không chi làm giảm giá trị sử dụng làm thực phẩm cá rô phi mà cịn làm giảm số lượng lồi cá bàn địa có giá trị cao khơng cạnh tranh lại gia tăng mật độ cá rô phi Ở nước ta, cá rô phi đen o mossambicus nuôi rộng rãi nhiều nơi thập kỷ 1960-1970 Tuy nhiên, cá sinh sản sớm (3-4 tháng tuổi), chậm lớn, kích cỡ nhỏ tạp giao với cá rơ phi vằn o niìoticus lồi cá lớn nhanh, kích cỡ lớn, khơng người ni ưa thích chí mong muốn loại bỏ khỏi vực nước nuôi (Nguyễn Văn Tư, 2003) Lãy truyền bệnh Có nhiều chứng cho thấy bệnh ký sinh trùng lạ xuất theo sau việc di nhập giống Thông thường bệnh ký sinh trùng không gây thiệt hại loài nhập nội chúng sinh sống vùng phân bố nguyên thủy Tuy nhiên, sức đề kháng bệnh suy giảm lồi nhập nội di chuyển sang môi truờng làm cho cá dễ nhiễm bệnh lan truyền bệnh cho loài địa Dịch bệnh phát sinh di nhập giống ghi nhận trường hợp di nhập tôm cá hồi Ở nước ta, việc di nhập cá trôi Ấn Độ đà làm xuất thêm loài sán đơn chủ Dactylogyrus labei loài ký sinh trùng xứ thuộc Protozoa (1 loài), Monogenea (2 loài) Trematoda (1 loài) vốn chi ký sinh cá Rohu Ba loài sán đơn chủ Cichlidogyrus sclerosus, c tilapiae Gyrodactylus niloticus coi lồi sán đặc hữu cá rơ phi vằn, xuất nước ta sau di nhập giống cá rô phi vằn (Bùi Quang Tề, 2003) 91 nay, kỹ thuật RAPD, AFLP microsatellite ứng dụng cho mục đích này, kỹ thuật AFLP cho hiệu cao Việc định danh xác lồi, dịng hay lai khía cạnh quan trọng việc lựa chọn cá bố mẹ RFLP, RAPD, AFLP microsatellite công cụ đắc lực cho việc định danh phân loại Các tính trạng tăng trưởng sinh sản tính trạng số lượng điều khiển nhiều gen Xác định gen qui định tính trạng số lượng (QTL) quan trọng cần thiết cho nhà chọn giống Chi thị phân tử sử dụng để xác định QTL, việc chọn lựa bố mẹ sau sê tiến hành bàng phương pháp chọn lọc nhờ hỗ trợ chi thị phân tử (MAS marker assisted selection ) (Liu Cordes, 2004) Các nghiên cứu sau cho thấy ứng dụng cùa kỹ thuật phân tò đinh loại, nghiên cứu quần thể phả hệ 2.1 ửng dụng kỹ thuật Allozyme Kỹ thuật dựa đa hình (khác cấu trúc kích thước phân tử) nhóm enzyme có chức (gọi isozyme) mã hóa bời hay nhiều alen locus Kỹ thuật allozyme dùng nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể, phân tích mức độ cận huyết, xâm nhập gen sử dụng lập đồn gen (Liu & Cordes 2004) Ở Việt Nam, kỹ thuật dùng để quan sát đa dạng di truyền dòng cá chép Trung quốc, Bắc Việt Nam, Hungary chép vàng Indonesia ừong đánh giá dòng để chọn giống cá trắm cỏ Trong dòng cá trăm cỏ Viện Nghiên cứu Thủy sản I (Viện I), Nghệ An, Sơn La Trung Quốc quần đàn Sơn La có tỉ lệ phần trăm locus đa hình cao nhất, (chứng tỏ có đa dạng cao nhất) quần đàn Nghệ An Trung Ọuốc khơng có locus đa hình (Phạm Anh Tuấn, 2005) Allozyme dùng để nghiên cứu việc xâm nhập gen lồi Ví dụ, nghiên cứu Thái Lan cá trê vàng dựa chì thị cho thấy 12 tổng số 25 quần thể cá trê vàng (Clarias macrocephalus) tự nhiên có mang alen đặc trưng cá trê phi, chứng tỏ có xâm nhập gen trê phi (C gariepinus) vào cá trê vàng địa (Na-Nakom et a i, 2004) 2.2 K ỹ thuật phân tích đa hình khuếch đại ngẫu nhiên RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Nguyên lý RAPD đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên mồi đơn phổ biến, khơng mang tính đặc hiệu cho loài Các mồi đom thường ngăn, có 10 bp nhiệt độ gắn 132 mồi thấp (36 - 40°C) Do đó, nhiều đoạn DNA khuếch đại dễ dàng (Ví dụ, hình 6.2, nhiều băng vạch thể sản phẩm DNA khuếch đại số lồi cá lóc sử dụng đoạn mồi OPA3) Tuy nhiên, kết cùa RAPD thường không ổn định mà phụ thuộc nhiều yếu tố thành phần phản ứng PCR, đặc biệt thành phần Mg2' chất lượng DNA khn mẫu Mặc dù có số hạn chế, kỹ thuật RAPD lại đơn giản, tốn chi phí tính đa hình tương đối cao Vì vậy, kỹ thuật sử dụng phố biến, đặc biệt vào năm 1990 Ở Việt Nam, thị RADP dùng để phân tích tính đa hình quần đàn cá tra (3 quần đàn trại giống I quần đàn cá tự nhiên) Ket phân tích dựa 31 đoạn mồi cho thấy quần đàn có tính đa dạng di truyền cao đặc biệt quần đàn tự nhiên Đối với tơm sú thí nghiệm dùng cặp mồi để tính khoảng cách di truyền quần đàn Kết quà minh chứng có tương đồng cao quần đàn tôm sú miền Nam miền Trung Ở nghiên cứu khác cá tram cị cá trơi Ẩn Mirgal, kết phân tích chi thị isozyme RAPD cho thấy mức độ dị hợp trại cá giống thấp (ví dụ mức độ dị hợp dựa RAPD dao động khoảng 0,173 - 0,208) Nhóm nghiên cứu cho ràng đa dạng di truyền thấp lý giải thích chất lượng cá giống giảm (trích Phạm Anh Tuấn, 2005) M M lOOObp — r i — tlr iT Z L _ M 16 17 18 19 ; - ” ” 10 11 12 13 fe d 14 15 ì ;—5 «— — ' 21*22 23 24 2b 26 27 28 29 30 M lOOObp Hình 6.2: Đa dạng cùa lồi cá lóc sử dụng prim er OPA3 Giếng M: DNA ladder lOObp, 1-5: Channa striata, 6-10: c marulioides, 11-15: c lucius, 16-20: c gachua, 21-25: c micropeites, 26-30: c melasoma 2.3 Kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn - RFLP (Retrict Fragment Length Polymorphism) Tính đa hỉnh chiều dài phân đoạn DNA cắt giới hạn RFLP khác kích thước phân đoạn tạo cắt 133 DNA enzyme cắt giới hạn (ký hiệu RE, restriction enzyme), có thay đổi trình tự DNA mẫu vị trí nhận biết enzyme Các bước thực sau: đầu tiên, RE cắt DNA tổng số (DNA gen) cách ủ DNA tổng sổ với enzyme nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính enzyme Sản phẩm DNA sau bị cắt enzyme kiểm tra qua điện di gel agarose Tiếp theo, gel chứa DNA chuyển qua màng lai theo phương pháp Suthem blot Sự khác biệt trình tự vị trí cắt enzyme hai cá thể tạo phân đoạn cắt khác v ề sau, qui trình RFLP ban đầu cải tiến Người ta dùng kỹ thuật PCR thay cho kỹ thuật Southern blot, biết trinh tự đoạn DNA (ílankinẹ) nối với locus nghiên cứu, đoạn mồi thiết kế để khuếch đại vùng RFLP ứ n g dụng chủ yếu phương pháp RFLP phân tích đa dạng di truyền quần đàn Ví dụ, nghiên cứu cá tra, Quyền Đình Thi ctv (2005) dùng thị RAPD RFLP (đối với gen ti thể) để đánh giá đa dạng di truyền quần đàn cá trại giống so với cá tự nhiên Nhóm tác giả tìm số chi thị đặc trưng cho quần đàn khoảng cách di truyền đàn cá tương đối cao (0,22 - 0,39) Gần đây, kỹ thuật PCR-RFLP cịn dùng phân loại lồi hay phân biệt lai hai lồi Ví dụ, Mohindra et al (2007) dùng enzyme cắt giới hạn gen ND5/6 DNA ti thể (gọi phương pháp mtDNA-RLFP) loài cá trên: c batrachus, c macrocephalus c gariepinus Ở loài, enzyme cắt gen ND5/6 vị trí khác nhau, tạo nên kiểu gen riêng biệt cho loài Nhờ vậy, phân biệt lồi dễ dàng dựa vào xuất băng vạch (kết điện di sản phấm PCR-RFLP) đặc trưng cho loài (Mohindra et al., 2007) Trong phân biệt hai lai (lai “ngược” lai “xi”) với hai lồi cá trê bố mẹ c macrocephaỉus c gariepinus, người ta thực PCR-RFLP gen ti the (mtDNA) gen ừong nhân (nCDNA) Phương pháp nàỵ phân biệt hai lai với lai có kết RFLP gen ti thể giống với loài mẹ, RFLP gen ừong nhân, lai có băng vạch trung gian hai loài bố mẹ (Hashimoto et al., 2010) 2.4 K ỹ thuật phân tích đa hình độ dài đoạn khuếch đại - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật AFLP kỹ thuật kết hợp RFLP PCR Nguyên tắc thực sau: Bộ gene cắt với RE, tiếp theo, gắn 134 đoạn DNA bị cắt với đầu nối (adaptor) enzyme ligase Đoạn adaptor gồm phần: phần trình tự lõi phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Mồi cùa phản ứng PCR thiết kế dựa trình tự adaptor chứa trinh tự chọn lọc khoảng vài nucleotide Những phân đoạn DNA chứa trình tự adaptor trình tự nucleotide chọn lọc khuếch đại, trình tự chọn lọc làm giảm xuất sản phẩm PCR làm đơn giản trình phân tích Kỹ thuật AFLP ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền, xâm nhập gen, phân loại lồi, lập đồ gen, Ví dụ, Thái Lan, nghiên cứu dùng phương pháp AFLP đê lập đô gen cá trê vàng (Poompuang & Na-Nakom 2004) Họ dùng 47 tồ hợp đoạn mồi, tạo nên 79 kiểu gen đom bội, từ xây dụng đuợc đồ 134 gen, có 31 tổ hợp gen liên kết Những kết tiếp tục ứng dụng để tìm tính trạng số lượng liên kết, giúp cho việc chọn giống cá trê nhanh chóng hiệu cao hom so với phương pháp chọn lọc truyền thống 2.5 K ỹ thuật phân tích trình tự gen Kỹ thuật phân tích trình tự gen thực gen ti thể (mtDNA) phổ biến gen nhân Do nghiên cứu lâu nhiều đối tượng nên có nhiều loại đoạn mồi phổ biến thiết kế cho mtDNA, chúng dùng cho nhiều lồi với hệ thống phân loại khác Phân tích trình tự gen mtDNA (xem sồ gen mtDNA hình 6.3) thường áp dụng phân loại, tìm hiểu mối quan hệ di truyền loài (cây phân loại) Các gen thường sử dụng Cytochrome b, Cytochrome c subunit (ký hiệu COI C O X ), N A D II dehydrogenase subunit (N D ), Ví dụ, nghiên cứu trơn lồi cá lóc Malaysia (Abol-Munafi et aỉ., 2007), gen Cytochrome b khuếch đại nhờ cặp mồi phổ biến L I4841 and reverse H 15149 (Kocher et a i, 1989) có trình tự sau: L I4841 - ’: AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGATCAAA H I5149 - : AAACTGCACCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA 135 COX2 Lyằ ôy ND3 ATPasđ8 00X3 ATPase6 Hình 6.3: Các gen ty thể thường dùng đề phản loại cá • M 10 11 12 M 1;M 15 16 17 18 19 21 22 23 24 M * •* » ã ; f Hình 6.4: Vệt băng lồi lóc sử dụng gen Cytochrome b Giếng M: GeneRuler lOObp DNA ladder, 1-4: Channa striata, 5-8: c marulioides, 9-12: c lucius, 13-16: c gachua, 17-20: c micropeltes, 21-24: c melasoma Sau khuếch đại, sàn phẩm PCR thu có chiều dài ~ 400 bp (Hình 6.4) Đây chi phần gen Cytochrome b Sau đó, sản phẩm PCR giải trình tự Ket giải trình tự đoạn gen Cytochrome b thể hình 6.5 Trinh tự gen mẫu/loài nghiên cứu so sánh, phân tích nhờ vào chương trình phân tích trình tự gen MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013) Hình 6.5: Trình tự phần gen Cytochrome b cùa cá lóc 2.6 Kỹ thuật phân tích microsatellite Microsatellite đoạn DNA có trình tự số (thường từ - ) base lặp lặp lại nhiều lần số lần lặp lại từ vài đến hàng trăm lần Chỉ thị có mức độ đa dạng cao phân bố khắp nơi gen tất sinh vật Vì chúng dùng phổ biến nhiều nghiên cứu, đặc biệt nghiên cứu đa dạng di truyền Có nhicu phương pháp phân lập m icrosatcllitc phương pháp khuếch đại trực tiếp cùa đa hình (DALP: Direct amplification of length polymorphism), phương pháp microsatellite kết hợp ngẫu nhiên (RAHM: random hybridizing microsatellites) phương pháp microsatellite khuếch đại ngẫu nhiên (RAM: randomly amplified microsatellites) Sơ đồ theo phuơng pháp RAM thể hình 6.6 137 Hình 6.6: Microsatellite khuếch đại ngẫu nhiên dùng kỹ thuật phân lập R A M Ghi chú: (a) Đọan khuếch đại dùng cặp mồi móc, (b) Chuyển nạp gen mơi trường agar, (c) Chạy trình tự plasm id Các bước phân tích RAM (Hình 6.7 -6 ) sau: - Gen DNA PCR với cặp mồi móc - Chèn véctor vào sản phẩm PCR - Cấy khuẩn lạc - Ly trích plasmid (DNA có cấu trúc vịng) - Chạy trình tự - Thiết kế trình tự cặp mồi - Phân tích microsatellites / Hình 6.7: Ni cấy khẩn lạc cùa PCTB clones với microsatellite ('CAT)ó■ (Ghi chú: Điếm xanh chi cỉone dương điểm trắng chi clone âm) M " s l ó 11 H 16 1" 1S 1020:1 :ỉm 4361b- Hình 6.8: DNA vòng chạy cặp mồi PCTB Ghi chú: Giếng M: DNA kích thước chuẩn (Mix o f Ả DNA H ind III X I 74 DNA Hae III digest); giếng 1-24: DNA vòng m m - — M •/* ?p 27 u - — — ;*> * 33 ?4 y 36 37 38 > J -1 ' 44 J ; 4? 47 M Hình 6.9: DNA vịng có chèn với EcoRI Ghi chú: Giếng M: DNA kích thước chuẩn (Mix o f Ả DNA Hind III X I 74 DNA Hae III digest); giếng 1-47: DNA vòng 139 s 10 11 u m —► Ũ :: f l i c 1? 14 1.' 16 : r 23 24 M t •* I Ĩ •* f - — — //ỉ«/í Ố.70: Kệ/ báng DNA khuếch đại từ DNA vỏng Ghi chú: Giếng M: DNA kích thước chuẩn (Mix o f X DNA Hind III o X174 DNA Hae III digest); giếng 1-24: DNA vịng Ket phân tích trình tự để tìm microsatellite thê sau: 5’G TT G C G T A H H H H r a H H TGTTG ATTG ATGC ATG A GATCAAGGGAAACCTTGCTGCTCCAGTTGCTCTACTGTTTGA TAAAGAGGGTTTGTCGGCTCAGTCGATGTCACAACGCTGTA AAGTTGCTCACTTTCTTCACTGTCTGCCTTAAGAAAGAGAGT G AGTTG A A AA AC AGT AG ATT ATTG AT ACTTT AT ACGC AC AG AGAAGCCGTAGTCATCTTCCTCAGCCTTGTGGCGGACTTGA GGTCT ATG AG ACG AT GGGTTT ACT GCGG AG AG A ACAACAAC AACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACATCATCA TCATCATCATCATT C C A TG T3 ’ Ghi chú: Trình tự bơi xám trình tự anchor trình tự gạch nucleotides lặp lại, trình tự microsatellite ứ n g dụng thị microsatellite phân tích đa dạng di truyền thực rộng rãi nhiều đối tượng sinh vật, bao gồm loài động vật thủy sản giới Ở Việt Nam, số nghiên cứu điển hình như: nghiên cứu Quyền Đình Thi Phạm Anh Tuấn (2004) ước tính khoảng cách di truyền quần đàn tôm sú Kết cho thấy quần đàn tơm Nam có họ hàng gần với quần đàn tôm Trung khác với quần đàn tơm Singapore Tính đa hình quần đàn quần đàn cao, thể qua 83 kiểu gen 83 mẫu Giá trị thông tin đa hình PIC (polymorphic information content) >0,913 khoảng cách di truyền lớn >0,469 140 Một nghiên cứu khác thực cá tra Ha et al (2009) Nhóm nghiên cứu dùng thị microsatellite để so sánh mức độ đa dạng di truyền đàn cá tra trại giống với đàn cá tự nhiên Trong nghiên cứu này, kết chưa tìm cho thấy mức độ đa dạng di truyền đàn cá nghiên cứu tương đương nhau, chưa có dấu hiệu lai cận huyết xảy đàn cá trại giống Việc ứng dụng chì thị phân tử nói chung microsatellite nói riêng nghiên cứu thủy sản điều kiện nghiên cứu nước ta Song, với đầu tư phủ vào nghiên cứu ngày tăng, ứng dụng rộng rãi kỹ thuật này, chúng mang lại kết nhanh hiệu so với phương pháp đời trước allozym, RAPD, Bên cạnh đó, cần có kết hợp kỹ thuật di truyền cũ với kỹ thuật để thúc đẩy nhanh q trình thiện di truyền lồi ni có giá trị kinh tế cao Câu hỏi ơn tập 1- PCR gì? Nêu trình PCR? 2- Nêu kỹ thuật di truyền phân tử ứng dụng kỹ thuật này? Tài liệu tham khảo Abol-Munafi, A B., Ambak, M A., Ismail, p., Tam, B M., 2007 Molecular data from the cytochrome b for the phylogeny o f Channidae (Channa sp.) in Malaysia Biotechnology 6, 2 27 Bartlett, J M s and D Stirling, 2003 PCR Protocols Springer Science & Business Media Ha, H P., Nguyen T T T., Poompuang s., Na-Nakom Ư (2009) Microsatellites revealed no genetic differentiation between hatchery and contemporary wild populations of striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878) in Vietnam Aquaculture, 291, 154160 Hashimoto D T., Mendonỗa F F., Senhorini J A et al (2010) Identification o f hybrids between Neotropical fish Leporinus macrocephalus and Leporinus elongatus by PCR-RFLP and multiplex-PCR: Tools for genetic monitoring in aquaculture Aquaculture, 298, 346-349 14] Ivanova N V., Zemlak T s., Hanner R H., Hebert p D N (2007) Universal primer cocktails for fish DNA barcodirg Molecular Ecology Notes, 7, 544-548 Kocher T D., Thomas w K., Meyer A et al (1989) Dynamics o f mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers Proceedings o f the National Academy o f Sciences o f the United States o f America, 86, 6196-6200 Liu z J., Cordes JF (2004) DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics Aquaculture, ,1 37 Mohindra, V., R K Singh, M Palanichamy, A G Ponniih and K K Lai, 2007 Genetic identification o f three species of the genus Clarias using allozyme and mitochondrial DNA markers Journal o f Applied Ichthyology, 23, 104-109 Na-Nakom u , Kamonrat w , diversity o f walking catfish, Thailand and evidence o f introduced farmed C-gariepinus Ngamsiri T (2004) Genetic Clarias macrocephalus, in genetic introgression from Aquaculture, 240, 145-163 10 Phạm Anh Tuấn, 2005 ứ n g dụng sinh học phân tử nuôi trồng thủy sản Việt Nam: hịện trạng định hướng Kỷ yếu hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, 22-23/12/2004, Vũng Tàu 11 Poompuang s., Na-Nakom u (2004) A preliminary genetic map o f walking catfish (Clarias macrocephalus) Aquaculture, 232,105-203 12 Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết Phạm Anh Tuấn 2005 Sử dụng chi thị RADP mtDNA-RFLP để phân tích đa hình quần đàn cá tra (Pangasius hypophthalmus) ni Việt Nam Kỷ yếu hội thảo toàn quốc vế nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, 22-23/12/2004, Vũng Tàu 13.Tam ura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar s (2013) MEGA6: M olecular evolutionary genetics analysis version 6.0 Molecular Biology and Evolution, 30, 2725-2729 142 GIÁO TRÌNH DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG THỦY SẢN TS PH Ạ M T H A N H L IÊM , T S D Ư Ơ N G T H Ú Y YÊN V À TS BÙI M IN H T Â M Chịu trách nhiệm xuất bản: Giám đốc - Tổng biên tập: TS LÊ QUANG KHÔI Biên tập - Sửa in : Đặng Ngọc Phan Trình bày - bìa : Nguyễn Khánh Hà P h ạm Thị Anh Thư NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP 167/6 - Phương Mai - Đống Đa - Hà Nội ĐT: (04) 38523887 - 38521940 Fax: (04) 35760748 E-mail: nxbnn@vahoo.com.vn Website: nxbnongnghiep.com.vn CHI NHÁNH NXB NÔNG NGHIỆP 58 Nguyễn Bỉnh Khiêm Q.l, TP Hồ Chí Minh ĐT: (08) 38299521 - 38297157 Fax: (08) 39101036 E-mail: cnnxbnn@yahoo.com.vn 143 In 300 bản, khổ 16 X 24 cm Nhà in Thành Công 70 Bà Huyện Thanh Quan, quận 3, TP Hồ Chí Minh XNĐKXB so 1268-2015/CXBIPH/4-77/NN ngày 20/5/2015 QĐXB số: 023/QĐ CNNXBNN ngày 25/5/2015.ISBN: 978 604-60-2035-6 In xong nộp lưu chiểu quý 11/2015 144 ... 10X 2, 5 nl 25 mM JJ.1 mM 2, 5 ụ\ 10 pmol 0,5 nl 10 pmol 0,5 |il 2, 5 u 0 ,25 nl 20 ni 12, 75 nl Nồng độ cuối phản ứng IX 2, 5 mM 0 ,2 mM pmole pmole 0, 625 u 100 ng Ghi chú: Lượng nước cất thêm vào... động di nhập giống thường chì thực lần lồi nhập nội hình thành quần đàn vùng phân bố 89 1 .2. 2 Mục đích di nhập giống Việc di nhập hóa lồi cá, tơm thê giới kể đến việc di giống cá chép c carpió vào... điển hình phưcmg pháp chọn lọc (theo Falconer) A: Chọn lọc cá the B: Chọn lọc gia đình c, D: chọn lọc gia đình 3 .2 M ột số kết đạt phương pháp chọn lọc Có 20 0 hệ số di truyền xác định cho số