1 SỬ DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ ĐỂ XÁC ĐỊNH NẤM Trần Thanh Trăng Phòng Nghiên cứu Bảo vệ Thực vật rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam TÓM TẮT ADN cung cấp rất nhiều các đặc điểm để xác định các loài nấm mà nhiều loài nấm không có đầy đủ các đặc điểm về hình thái học hoặc chỉ có các đặc điểm có thể phân biệt được ở một giai đoạn nhất định nào đó trong chu kỳ sống của chúng. Các phương pháp sử dụng kỹ thuật ADN rất khác nhau, hiện nay các kỹ thuật dựa vào sự biến động của phương pháp PCR rất phổ biến bởi tính nhạy của nó, khả năng xác định nhanh và chỉ cần sử dụng một lượng vật liệu đầu vào rất ít. Một số phương pháp phổ biến đã được áp dụng một cách rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau như xác định chất lượng thực phẩm, sinh thái rừng, con người, động vật và bệnh thực vật được mô tả. Phương pháp xác định cụ thể áp dụng cho các trường hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm số lượng mẫu và số lượng loài cần xác định. Tất cả các kỹ thuật sử dụng ADN đều phụ thuộc vào nguồn mẫu tiêu bản với những mô tả chi tiết về mặt hình thái nhằm khảng định sự chính xác và tin cậy của kỹ thuật ADN. Từ khoá: Kỹ thuật ADN, PCR, xác định trình tự chuỗi ADN GIỚI THIỆU Kỹ thuật phân tử (kỹ thuật ADN) là một công cụ rất quan trọng trong việc xác định nấm. Các kỹ thật này rất hữu ích, được sử dụng như là một công cụ để xác định nấm đặc biệt khi nó không sản sinh ra thể quả, hay bào tử, đó là các đặc điểm cơ bản để phân loại, mô tả loài bằng phương pháp hình thái học. Trong khi một số loài nấm có thể dễ dàng phân lập và có thể sản sinh ra các đặc điểm phân loại có thể sử dụng kính hiển vi để phân loại, một số loài khác lại rất khó để phân lập hoặc thậm chí khi đã phân lập được rồi nhưng không sản sinh ra các đặc điểm để phân loại. Nhu cầu xác định nấm bệnh nhanh như trong quá trình kiểm dịch tại các cửa cảng, áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, cũng có thể sử dụng kỹ thuật ADN. Việc xác định các loài nấm có liên quan đến thực vật sử dụng kỹ thuật ADN cũng có rất nhiều ứng dụng, như là xác định các loài nấm rễ có ích, kiểm soát sự hiện diện của nấm cộng sinh hoặc quản lý nuôi cấy sinh học và phát hiện, xác định sớm được các loài nấm gây bệnh trên các cây chủ, từ đó có chiến lược quản lý bệnh hại. Khái niệm cơ bản về ADN ADN (Deoxyribo Nucleic Acid) là một phân tử dài, cấu tạo bởi một số lượng lớn các Nucleotite, được gọi là các bazơ hoặc cặp bazơ (base paire - bp). Mỗi Nucleotite bao gồm một phân tử đường 5 Các-bon, Deoxyribose với một nhóm Phốt-phát gắn ở vị trí Các-bon 5 và một trong bốn bazơ gắn ở vị trí Các-bon 1 (hình 1). Bốn bazơ là Adenine, Guanine, Cytosine và Thymine, thường được viết tắt là A, G, C và T. Khi một chuỗi ADN được tổng hợp, nhóm Phốt-phát của một Nucleotite được gắn vào vị trí số 3 của nhóm Hydroxyl của Nucleotite sau trong chuỗi phản ứng. 2 Hình 1. Deoxyadenosine triphosphate (dATP) một trong 4 Deoxynucleotides (dNTPs) cần thiết để tổng hợp ADN (Watson và cs, 1998). ADN tồn tại trong tế bào dưới dạng sợi đôi, được gắn kết với nhau bởi các lực điện từ giữa các bazơ của sợi 1 và sợi 2. Guanine được gắn với Cytosine, Adenine được gắn với Thymine và các cặp này được gọi là “cặp bù”, sợi đôi này rất bền vững ở các điều kiện sinh lý của tế bào. Enzyme ADN là một loại enzyme, có chức năng tổng hợp ADN bằng việc copy chính xác một sợi ADN có sẵn. Tuy nhiên, chúng không tạo ra một chuỗi sợi mới giống hệt chuỗi ban đầu mà là một chuỗi sợi đối xứng ngược. Hai chuỗi sợi ADN được tách ra và một chuỗi đối xứng ngược được tạo ra bởi mỗi sợi bởi vậy sợi 1 là bản mẫu cho sợi mới thứ 2 và ngược lại. Chúng là thứ tự hoặc chuỗi của các bazơ A, C, G và T và đây chính là cơ sở cung cấp thông tin di truyền và được truyền từ tế bào này sang tế bào khác, từ thế hệ này sang thế hệ khác và việc xác định thứ tự các Nucleotite của chuỗi này được gọi là xác định trình tự ADN. Phương pháp Có rất nhiều phương pháp sử dụng kỹ thuật ADN để xác định nấm và sự lựa chọn phương pháp phù hợp nhất sẽ phụ thuộc vào số lượng mẫu và số lượng loài cần xác định. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp được sử dụng đều dựa trên cơ sở khớp thông tin giữa một loài nấm chưa biết với một loài nấm đã được xác định bằng các đặc điểm hình thái học từ các tiêu bản mẫu. Do vậy việc xác định các loài nấm phụ thuộc vào các loài nấm đã được xác định từ trước bởi các nhà phân loại học với các kỹ năng phù hợp, cơ bản. Các cơ sở dữ liệu về trình tự chuỗi ADN công cộng có thể được sử dụng như là một nguồn thông tin quan trọng. Các phương pháp sử dụng kỹ thuật ADN để xác định nấm bệnh bao gồm: (1) Southern blot, (2) các kỹ thuật dựa trên PCR (PCR-based) như: PCR-RFLP (PCR Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình các đoạn cắt giới hạn), T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism), và xác định trình tự chuỗi ADN (ADN sequencing). Bước đầu tiên cho tất cả các phương pháp trên là việc tách ADN và tinh sạch chúng, hiện nay có rất nhiều phương pháp và bộ kít được sử dụng để làm việc trên. Phương pháp Southern blot bao gồm việc gắn các ADN cần xác định vào một màng mỏng, sau đó tách các ADN đó ra và cho chúng gắn với một đoạn dò ADN (ADN-probe) đã được xác định (Goodwin và cs, 1989). Đoạn dò này là một đoạn ADN ngắn (khoảng 20 bp) và nó được thiết kế duy nhất cho một loài nấm. Bởi vì phương pháp này đòi hỏi phải có một số Bazơ: adenosine Đường, deoxyribose Nhóm phốt-phát 3 lượng rất lớn các đoạn dò do vậy phương pháp này không được sử dụng một cách rộng rãi và được thay thế bằng phương pháp PCR. Phương pháp PCR được phát triển từ những năm 1980 với việc sử dụng một loại enzyme từ một loài vi khuẩn chịu nhiệt (Thermus aquaticus) để tổng hợp ADN (Saiki và cs, 1988). Phương pháp PCR dùng để nhân một đoạn rất nhỏ ADN, có thể là 1 kbp hoặc nhỏ hơn, của bộ gen. Trong phản ứng PCR còn có thêm hai đoạn mồi (primer) là các đoạn oligonucleotite ngắn có chiều dài khoảng 20 bp, các đoạn này được gắn vào các đoạn ADN mẫu trong quá trình tổng hợp ADN. Ngoài ra còn có các chất hóa học khác cần thiết cho phản ứng PCR như các dNTPs, muối MgCl 2 , BSA (Bovine Serum Albumin) và chất đệm (PCR buffer). Quá trình nhân bản ADN bao gồm 3 bước cơ bản: Đầu tiên là tăng nhiệt trong phản ứng (khoảng 95 o C) để tách đôi hai sợi ADN mẫu; sau đó giảm nhiệt độ trong phản ứng (khoảng 55 o C), lúc này các đoạn mồi sẽ gắn vào các đầu của mỗi sợi ADN mẫu; cuối cùng, nhiệt độ phản ứng tiếp tục được tăng lên (khoảng 72 o C) để các enzyme xúc tác cùng với các primer và các chất hoá học khác trong phản ứng tổng hợp kéo dài sợi ADN. Ba bước tăng và giảm nhiệt này được lặp lại 30 - 40 chu kỳ. Trong 30 chu kỳ, giả sử đạt hiệu suất là 100% thì sẽ có 230 (hay 109) bản copy của chuỗi ADN được tổng hợp, với số lượng ADN đó đủ để quan sát trên bản gel khi được nhuộm màu (bằng chất Ethidium bromide). Sử dụng phương pháp PCR để xác định nấm, đòi hỏi phải sử dụng cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho từng loài nấm, với cặp mồi này, trong quá trình phản ứng chỉ khuyếch đại ADN từ loài nấm cần xác định. Các cặp mồi đặc hiệu có thể được thiết kế cho các gen đặc hiệu như calmodulin (Mulè và cs, 2004) hay cho sản phẩm của các chuỗi trình tự chưa biết như RAPD (random amplified polymorphic ADN) hay AFLP (amplified fragment length polymorphism) (Schmidt và cs, 2004; Vos và cs, 1995). Các primer cũng có thể được thiết kế cho vùng có một đoạn copy như calmodulin (Mulè và cs, 2004) hay cho vùng có nhiều đoạn copy như rADN ITS (ribosomal ADN internal transcribed spacers) với mục đích tăng tính nhạy (Flowers và cs, 2003). Trong mỗi phản ứng cần phải sử dụng mẫu đối chứng (cả dương tính và âm tính) để tăng độ tin cậy (Hoorfar và cs, 2004). Sử dụng phương pháp mồi đặc hiệu PCR có thể thích ứng với nhiều loại thiết bị, cho phép chạy nhiều mẫu một lúc. Việc ứng dụng phương pháp này bao gồm việc phát hiện và xác định được sớm các loài nấm bệnh, sẽ kiểm soát được sự lan rộng sinh học của bệnh và kiểm soát được sự di chuyển của các mầm bệnh từ vùng này sang vùng khác. Phương pháp PCR-RFLP được bắt đầu với sản phẩm PCR, sử dụng các mồi đặc hiệu có phổ kết hợp rộng như ITS1-F và ITS-4, các cặp mồi này sẽ khuyếch đại ADN của hầu hết các loài nấm, trong khi đó không khuyếch đại ADN của thực vật, động vật hoặc vi khuẩn. Sản phẩm PCR được cắt bằng các enzyme giới hạn, các enzyme này cắt các đoạn ADN ở các điểm nhận biết đặc hiệu tuỳ thuộc vào từng loại enzyme. Ví dụ, vùng nhận biết của enzyme Hea III là GGCC. Cắt một sản phẩm PCR có kích thước 1 kbp bằng enzyme giới hạn có vùng nhận biết là 4 bp sẽ thành 2-8 đoạn với các kích cỡ nhỏ hơn và sẽ tạo ra phân đoạn đặc hiệu khi chúng được điện di trên bản gel agarose hay poly-acrylamide (hình 2). Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về nấm rễ (ectomycorrhiza) bởi vì nó phù hợp với các mẫu chứa chỉ 1 loại nấm. Cắt với 2 hoặc 3 enzyme giới hạn khác nhau có thể phân biệt được hầu hết các loài nấm. Trong khi rất nhiều loài nấm có thể phân biệt được bằng phương pháp này, một số chi như Tomentella và Cortinarius có rất nhiều loài với các phân đoạn đặc hiệu rất giống nhau, do đó rất khó hoặc không thể phân biệt được. PCR-RFLP cũng được sử dụng để xác định nấm bệnh (Rolshausen và cs, 2004) tuy nhiên sự hiện diện của nhiều loài nấm trong cùng một mẫu sẽ làm cho sự phân biệt nấm bằng phương pháp này không được chính xác. 4 T-RFLP là phương pháp được biến đổi từ phương pháp PCR-RFLP, sử dụng một mồi huỳnh quang (fluorescent) và một bản gel chuỗi để đạt được độ nhạy tốt hơn và kích cỡ các phân đoạn chính xác. Phương pháp này chủ yếu được sử dụng trong nghiên cứu ectomycorrhiza (Dickie và cs, 2002). Cả hai phương pháp PCR-RFLP và T-RFLP đều yêu cầu sự thiết lập cơ sở dữ liệu tham khảo về kích cỡ các phân đoạn đặc hiệu từ các loài nấm đã được xác định với các mẫu tiêu bản. Càng có nhiều các dữ liệu tham khảo, khả năng khớp giữa các mẫu càng lớn và giảm được các lỗi về xác định tên nấm không đúng. Các phân đoạn đặc hiệu của loài nấm cần xác định phải khớp chính xác 100% với loài nấm đã biết, nếu chỉ khớp một phần thì cả 2 phương pháp PCR-RFLP và T-RFLP đều không cung cấp thông tin hữu ích trong xác định loài. Hình 2. Sản phẩm PCR – RFLP trên bản gel agarose. Làn 1: thang ADN, 200bp. Các làn 2 đến 14: sản phẩm PCR-RFLP được cắt bởi enzyme Taq I. Phương pháp xác định trình tự chuỗi ADN (ADN sequencing) thường được bắt đầu với một sản phẩm PCR, sản phẩm này cung cấp đầy đủ ADN mẫu cho phản ứng xác định trình tự chuỗi, mặc dù phương pháp này có thể sử dụng các phân đoạn ADN được tách dòng từ Plasmid hoặc Bacteriophage. Phản ứng xác định trình tự chuỗi ADN rất giống với phản ứng PCR, mặc dù chỉ có một mồi được sử dụng trong mỗi phản ứng, bên cạnh đó trong mỗi phản ứng còn dùng đến các Deoxynucleotite và di- Deoxynucleotite (ddNTPs). Những ddNTPs này được đánh dấu với một trong bốn chất nhuộm màu huỳnh quang, đại diện mỗi màu sẽ tương ứng với một trong bốn bazơ A, G, C và T. Sự phát triển của chuỗi này sẽ bị dừng lại khi một ddNTP không kết hợp với phân tử tổng hợp mới, bởi vì ddNTP không có phân tử ôxy, phân tử cần thiết cho sự gắn kết mới. Bởi vậy sản phẩm cuối cùng sẽ là một chuỗi các phân đoạn ADN có kích cỡ từ 20 bp đến n bp, trong đó n là độ dài của sản phẩm PCR được sử dụng như bản mẫu, mỗi phân đoạn chỉ được đánh dấu huỳnh quang một lần. Sản phẩm của phản ứng được điện di trên một bản gel acrylamide dài, có độ phân giải cao hoặc các mao dẫn để tách các phân đoạn ADN với với các độ dài khác nhau, chênh nhau chỉ một phân tử bazơ. Khi các phân đoạn ADN di chuyển, chạy qua một máy quét, các phân đoạn sẽ di chuyển từ các phân đoạn ngắn hơn cho đến dài hơn, các đuôi nhuộm huỳnh quang sẽ được nhận biết và được chuyển đổi thành các bazơ A, C, G và T thông qua phần mềm chuyên biệt, và được thể hiện trên màn hình máy tính như hình 3. 5 Hình 3. Sản phẩm của phản ứng xác định trình tự chuỗi với chất nhuộm màu huỳnh quang được điện di trên bản gel có độ hòa tan cao và được chuyển hóa thành các bazơ trên computer Đối với việc xác định nấm, chuỗi trình tự ADN của một loài nấm chưa biết sẽ được tìm kiếm và so sánh sự giống nhau với các chuỗi trình tự ADN của loài nấm đã biết tên trên các cơ sở dữ liệu công cộng sẵn có như Genbank. Nếu các chuỗi trình tự không giống nhau đến 100%, đủ để khẳng định tên loài, có thể sử dụng phương pháp phân tích tiến hóa loài - phylogenetic analysis (Bruns và cs, 1998; Glen và cs, 2002). Bằng phương pháp này có thể xác định loài hoặc chi của nấm trên cơ sở dữ liệu tham khảo. Phương pháp xác định này có thể được áp dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt phù hợp cho xác định một số lượng lớn các mẫu. Tuy nhiên không phải tất cả các loài nấm cần xác định đều có trên cơ sở dữ liệu tham khảo công cộng. Đôi khi có nhiều loài nấm cùng xuất hiện trong một mẫu, đặc biệt là các mẫu gỗ, rễ cây đã bị mục hoàn toàn, thì có thể sử dụng phương pháp tách dòng từ sản phẩm PCR trước khi chạy phản ứng xác định trình tự chuỗi (Trăng, 2007b). Ứng dụng trong xác định bệnh rỗng ruột, thối rễ Keo tai tượng Acacia mangium và bệnh mục gỗ Bạch đàn Eucalyptus obliqua Có rất nhiều loài nấm gây bệnh liên quan đến bệnh rỗng ruột và thối rễ Keo tai tượng Acacia mangium cũng như bệnh mục gỗ Bạch đàn Eucalyptus obliqua. Hiện nay, phương pháp phù hợp nhất để phát hiện và xác định các loài nấm gây bệnh này là phương pháp PCR và phương pháp xác định trình tự chuỗi ADN (Glen và cs, 2002; Trăng, 2007a), bên cạnh đó, trong các mẫu đã bị mục hoàn toàn, hoặc ở giai đoạn trung bình, cần thiết phải tách dòng (cloning) nấm từ sản phẩm PCR trước khi chạy phản ứng xác định trình tự chuỗi để đạt được kết quả tốt nhất (Trăng, 2007b) bởi vì các loại mồi đặc hiệu cho từng loài nấm bệnh mới chỉ được phát triển với số lượng rất hạn chế trong số rất nhiều loài nấm bệnh gây bệnh rỗng ruột và bệnh thối rễ (Lim và cs, 2005; Suhara và cs, 2005). Trong khi đó đã có rất nhiều chuỗi trình tự ADN của các loài nấm gây bệnh phổ biến cho cả Keo tai tượng và Bạch đàn E. obliqua như Ganoderma spp., Phellinus spp., Postia spp., Fomitopsis spp. trên các cơ sở dữ liệu công cộng (như Genbank). Tuy nhiên cũng có rất nhiều loài nấm gây bệnh hiện chưa có chuỗi trình tự ADN trên cơ sở dữ liệu công cộng, do vậy xu hướng ưu tiên hiện nay là phải thiết lập các cơ sở dữ liệu cơ sở hay dữ liệu cá nhân (private database) với đầy đủ các thông tin mô tả về loài với các đặc điểm hình thái học. Sự phân loại của các loài nấm lớn có liên quan đến các 6 loại bệnh rỗng ruột, thối rễ, thối gốc là điều cần thiết và các chuỗi trình tự ADN có thể được sử dụng như một công cụ hữu ích trong giải quyết vấn đề này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bruns, T. D., Szaro, T. M., Gardes, M., Cullings, K. W., Pan, J. J., Taylor, D. L., Horton, T. R., Kretzer, A., Garbelotto, M. and Li, Y, 1998. A sequence database for the identification of ectomycorrhizal basidiomycetes by phylogenetic analysis. Molecular Ecology, 7: 257-272. Dickie I. A., Xu B. and Koide R. T, 2002. Vertical niche differentiation of ectomycorrhizal hyphae in soil as shown by T-RFLP analysis. New Phytologist, 156: 527-535. Flowers, J., Hartman, J. and Vaillancourt, L, 2003. Detection of latent Sphaeropsis sapinea infections in Austrian pine tissues using nested-polymerase chain reaction. Phytopathology, 93 (12): 1471-1477. Glen, M., Tommerup, I. C., Bougher, N. L. and O’Brien, P. A, 2002. Are Sebacinaceae common and widespread ectomycorrhizal associates of Eucalyptus species in Australian forests? Mycorrhiza 12: 243-247. Goodwin, P. H., Kirkpatrick, B. C. and Duniway, J. M, 1989. Cloned DNA probes for identification of Phytophthora parasitica. Phytopathology, 79: 716-721. Hoorfar J, Cook N, Malorny B, Wagner M, De Medici D, Abdulmawjood A, Fach P, 2004. Diagnostic PCR: Making internal amplification control mandatory. Letters In: Applied Microbiology, 38: 79-80. Lim, Y. W., Yeung, Y. C. A., Sturrock, R., Leal, I. & Breuil, C, 2005. Differentiating the two closely related species, Phellinus weirii and P. sulphurascens. Forest Pathology, 35: 305-314. Mulè, G., Susca, A., Stea, G., and Moretti, A, 2004. Specific detection of the toxigenic species Fusarium proliferatum and F. oxysporum from asparagus plants using primers based on calmodulin gene sequences. FEMS Microbiology Letters, 230: 235-240. Rolshausen, P. E., Trouillas, F. and Gubler, W. D, 2004. Identification of Eutypa lata by PCR-RFLP. Plant Disease, 88: 925-929. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. and Erlich, H. A, 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239: 487-491. Schmidt, H., Taniwaki, M. H., Vogel, R. F. & Niessen, L, 2004. Utilization of AFLP markers for PCR-based identification of Aspergillus carbonarius and indication of its presence in green coffee samples. Journal of Applied Microbiology, 97: 899-909. Trần Thanh Trăng, 2007a. Resistance screening to fungal diseases for plantation Eucalypts in Vietnam; Molecular tools to assist fungal detection and identification. MSc thesis, University of Tasmania, Australia. Trần Thanh Trăng, 2007b. Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện và xác định nấm gây bệnh mục gỗ Bạch đàn Eucalyptus obliqua L. Her. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 19: 59-64. Suhara, H., Maekawa, N., Kubayashi, T. & Kondo, R, 2005. Specific detection of a basidiomycete, Phlebia brevispora associated with butt rot of Chamaecyparis obtusa, by PCR-based analysis. Journal of Wood Science, 51: 83-88. 7 Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Lee, T. van de, Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. and Zabeau, M, 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23: 4407-4414. Watson. J. D, Gilman M. and Witkowski M, 1998. Recombinant DNA. W. H. Freeman and Company, New York, USA. THE USE OF MOLECULAR TECHNIQUES TO IDENTIFY FUNGI Tran Thanh Trang Forest Plant Protection Research Division Forest Science Institute of Vietnam SUMMARY DNA provides some characters of fungal identification where a lot of fungal species have inadequate morphological characters or only possess distinguishing characters in a particular stage of their life cycle. Methods of using DNA technique are varied, and the variations of PCR based techniques are popular today because of their sensitivity, speed and using of only very small throughput. Some popular methods are described that have been applied widely in many areas including food, forest ecology, human, animal and plant pathology. The specific method used for particular application will depend on some factors, including number of samples and candidate species. All of the DNA based techniques depend on herbarium resources with detail morphological descriptions to verify the DNA technique. Keywords: DNA technique, DNA sequencing, PCR . khoá: Kỹ thuật ADN, PCR, xác định trình tự chuỗi ADN GIỚI THIỆU Kỹ thuật phân tử (kỹ thuật ADN) là một công cụ rất quan trọng trong việc xác định nấm. Các kỹ thật này rất hữu ích, được sử dụng. 1 SỬ DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ ĐỂ XÁC ĐỊNH NẤM Trần Thanh Trăng Phòng Nghiên cứu Bảo vệ Thực vật rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam TÓM TẮT ADN cung cấp rất nhiều các đặc điểm để xác định. điểm để phân loại. Nhu cầu xác định nấm bệnh nhanh như trong quá trình kiểm dịch tại các cửa cảng, áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, cũng có thể sử dụng kỹ thuật ADN. Việc xác định các