Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ở ngô
Bộ Giáo dục và Đào tạo Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam Viện Công nghệ Sinh học ******** Phạm thị lý thu Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non v xác định phơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô Chuyên ngành : Sinh lý học thực vật Mã số : 62.42.30.05 Tóm tắt luận án tiến sĩ sinh học Hà Nội-2007 Công trình đợc hoàn thành tại: - Viện Công nghệ Sinh học, VAST - Viện Di truyền Nông nghiệp, VAAS Ngời hớng dẫn khoa học: PGS. TS. Lê Huy Hàm PGS. TS. Đỗ Năng Vịnh Phản biện 1: GS. TS. Ngô Hữu Tình, Viện Nghiên cứu Ngô Phản biện 2: GS. TSKH. Trần Đình Long, Hội Giống cây trồng Việt Nam Phản biện 3: PGS. TS. Vũ Đức Quang, Viện Di truyền Nông nghiệp Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc, họp tại Viện Công nghệ Sinh học vào hồi 09 giờ 00 ngày 26 tháng 09 năm 2007 Có thể tìm hiểu luận án tại th viện: - Th viện Quốc gia - Th viện Viện Công nghệ Sinh học Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt & CS và cộng sự 2,4- D Dichlorophenoxy acetic acid Act1 Rice actin promoter: đoạn gen khởi động tách từ cây lúa AS Acetosyringone BAP 6-Benzylaminopurine bar / pat Phosphinothricin acetyltransferase gene = gen mã hoá phosphinothricin acetyltransferase bp base pair = cặp bazơ CaMV35S Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter: đoạn gen khởi động tách từ virus khảm xúp lơ CTAB Cetyltrimeethylammonium bromide EC Embryogenic callus = mô sẹo phôi hoá EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit EPSPS Gen tổng hợp 3-enolpyruvylshikimate-5-phos-phate kháng glyphosate Et-Br Ethidium bromide gfp Green fluorescent protein: gen chỉ thị mã hoá cho protein phát huỳnh quang màu xanh GMC Genetic Modification Crop =Cây trồng chuyển gen gus - Glucuronidase gene = gen mã hoá -glucuronidase IAA 3-Indolyl acrylic acid ISAAA International Service for the Acquisition of the AgriBiotech Applications = Tổ chức Dịch vụ Quốc tế về tập hợp các ứng dụng Công nghệ Sinh học trong Nông nghiệp nptII Neomycin phosphotransferase II gene = Gen mã hoá neomycin PCR Polymerase Chain Reaction PPT Phosphinothricin STF Tần số chuyển gen bền vững T-ADN Transfer-DNA = ADN chuyển Ti-plasmid Tumor inducing plasmid= plasmit gây khối u thực vật TE Biểu hiện gen tạm thời Ubi Maize ubiquitin promoter: đoạn gen khởi động tách từ cây ngô X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Lê Huy Hàm - Viện trởng, và PGS. TS. Đỗ Năng Vịnh - Phó Viện trởng Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, là những ngời thầy đã tận tình hớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành bản luận án này! Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Phòng Quản lí tổng hợp và cô Ngô Bích Liên - Chuyên viên phụ trách đào tạo Viện Công nghệ Sinh học, đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, mọi thủ tục cần thiết trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án! Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS. Hinrich Harling, Trởng Bộ phận R&D của Công ty Giống cây trồng KWS (CHLB Đức), TS. Reinhard Nehls, Giám đốc điều hành Trung tâm nghiên cứu Planta; TS. Hong Wang, TS. Josef Kraus, bà Magritta Wolter và các bạn đồng nghiệp Barbara Sellig, Heike Lehmann đã hỗ trợ nhiệt tình và cho tôi những lời khuyên, ý kiến đóng góp rất bổ ích để tôi có thể hoàn thành bản luận án này! Trong thời gian qua, tôi đã nhận đợc sự giúp đỡ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cán bộ, các bạn đồng nghiệp Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật và Viện Di truyền Nông nghiệp. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả ngời thân trong gia đình đã luôn luôn bên tôi, quan tâm và tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cám ơn sự động viên, khích lệ của các đồng nghiệp và bạn bè đã giành cho tôi. H Nội, ngy 28 tháng 09 năm 2007 Phạm Thị Lý Thu Những công bố của tác giả có liên quan đến luận án 1. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003), Đánh giá khả năng sinh trởng, phát triển và tái sinh cây từ phôi non hai dòng ngô nhập nội HR8 và HR9 trong điều kiện Việt Nam, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 9/2003, tr. 1154-1156. 2. Phạm Thị Lý Thu, Phạm Minh Thợi, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003), ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng và tuổi phôi đến khả năng tái sinh cây từ phôi non dòng ngô nhập nội HR8, HR9, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, 3/2003, tr. 39-43. 3. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2005), ảnh hởng của một số yếu tố đến hiệu quả chuyển gen ở ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens", Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 10/2005, 28-31. 4. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2006), Hoàn thiện quy trình chuyển gen ở ngô bằng súng bắn gen, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 8/2006, 31-35. 5. Lê Huy Hàm, Phạm Thị Lý Thu, Nguyễn Thị Khánh Vân, Đỗ Năng Vịnh, (2006), Một số thành tựu và ứng dụng của công nghệ sinh học trong chọn tạo giống ngô ở Việt Nam, Kỷ yếu Hội nghị tổng kết khoa học và công nghệ nông nghiệp 2001-2005 (Bộ Nông nghiêp & PTNT, Viện Khoa học Nông nghiệp VN), Nhà Xuất bản Nông nghiệp, tr.34-47. 1 Mở đầu 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây ngô là một trong ba cây trồng quan trọng nhất đợc sử dụng làm thức ăn cho ngời và gia súc. ở Việt Nam, ngô là cây lơng thực chính, đứng thứ hai sau lúa. Trong thời gian qua, công tác chọn tạo giống ngô đã có những chuyển biến hết sức tích cực, nhng nhìn chung công nghệ sinh học vẫn cha đợc áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực này, đặc biệt là việc tạo ra các giống ngô có đặc tính mới bằng kỹ thuật di truyền. Trong hàng loạt các yêu cầu cần phải có để tạo đợc giống cây trồng chuyển gen nói chung và cây ngô chuyển gen nói riêng thì việc xây dựng quy trình biến nạp hiệu quả cao là một trong những đòi hỏi cần thiết (Vasil & CS., 1992). Một yếu tố khác có ảnh hởng rõ rệt đến quá trình chuyển gen vào cây ngô là tần số tái sinh cây thấp. Chỉ có một số ít dòng ngô có khả năng tái sinh tốt nh A188, H99, Pa91, hầu hết các dòng ngô khác không có khả năng này. Mặt khác, các dòng ngô có khả năng tái sinh cao lại không mang các đặc tính nông học quý và thờng có nguồn gốc ôn đới (Amrstrong & Green, 1985), rất khó thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới nh ở nớc ta, vì vậy cần phải có những nghiên cứu để thích ứng các quy trình tái sinh trong điều kiện của Việt Nam. Có thể nói rằng, những hạn chế làm giảm khả năng ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống ngô ở nớc ta là: i) Cha có hệ thống tái sinh hiệu quả sử dụng cho chuyển gen; ii) Cha có nguồn gen và các vật liệu sử dụng cho chuyển gen; iii) Cha có cán bộ lành nghề trong lĩnh vực tạo cây trồng chuyển gen. Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta cần phải làm chủ đợc công nghệ ADN tái tổ hợp, xây dựng hệ thống chuyển gen và đánh giá biểu hiện của gen chuyển. Xuất phát từ những đòi hỏi thực tiễn của hớng nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô. 2. Mục đích nghiên cứu 2 Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào để xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non, tạo nguồn nguyên liệu cho quá trình biến nạp gen ở ngô. Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào phôi ngô non sử dụng súng bắn gen và vi khuẩn A. tumefaciens. Trên cơ sở đó, xác định đợc phơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô, góp phần phát triển lĩnh vực chọn tạo giống ngô bằng công nghệ sinh học. 3. Nội dung nghiên cứu Xây dựng và hoàn thiện hệ thống tái sinh cây từ phôi ngô non. Nâng cao hiệu quả tái sinh của các dòng ngô Việt Nam bằng phơng pháp lai hữu tính kết hợp tái sinh in vitro. Cải tiến và hoàn thiện quy trình chuyển gen ở ngô bằng súng bắn gen. Tạo dòng ngô chuyển gen. Xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen ở ngô thông qua A. tumefaciens. Tạo dòng ngô chuyển gen 4. Những đóng góp mới của luận án Bản luận án này có những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn nh sau: 1. Đã xây dựng và hoàn thiện quy trình tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non ở ngô có hiệu quả cao. Đây là quy trình tái sinh cây từ phôi non đầu tiên đợc nghiên cứu khá đầy đủ và tối u hoá, có thể áp dụng để tái sinh các dòng ngô khác nhau trong điều kiện Việt Nam. 2. Tạo đợc 5 dòng ngô có khả năng tái sinh cao từ vật liệu nhập nội và trong nớc, thích ứng tốt trong điều kiện Việt Nam, có thể sử dụng làm nguồn mẫu ban đầu cho các nghiên cứu biến nạp di truyền trong điều kiện nớc ta. 3. Lần đầu tiên trong điều kiện Việt Nam đã nghiên cứu và hoàn thiện quy trình chuyển gen vào ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và súng bắn gen. Các quy trình này sẽ là những quy trình kỹ thuật nền về chuyển gen vào cây trồng nói chung và chuyển các gen mang các đặc tính có giá trị vào cây ngô nói riêng, góp phần đ a công nghệ tạo cây chuyển gen thành một công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống truyền 3 thống, đồng thời nâng cao năng lực tiếp cận các lĩnh vực khoa học hiện đại trong tạo giống cây trồng. 4. Các dòng ngô chuyển gen tạo ra đã và đang đợc đánh giá nhằm mục đích sử dụng làm nguồn vật liệu cho việc chọn tạo các giống ngô mang đặc tính mới có giá trị kinh tế cao. 5. Bố cục của luận án Luận án gồm 146 trang, 36 bảng và 36 hình. Mở đầu (4 trang) Chơng 1. Tổng quan tài liệu (40 trang) Chơng 2. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu (14 trang) Chơng 3. Kết quả và thảo luận (65 trang) Kết luận và đề nghị (2 trang) Tài liệu tham khảo (25 tài liệu tiếng Việt và 182 tài liệu tiếng Anh) Phụ lục (2 trang) Chơng 1. Tổng quan ti liệu 1.1. Hệ thống nuôi cấy tế bào và tái sinh in vitro ở cây ngô Một số hệ thống nuôi cấy in vitro đã đợc nghiên cứu khá đầy đủ và có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sinh học cũng nh trong cải tạo giống ngô bao gồm: 1.1.1. Nuôi cấy phôi hợp tử 1.1.1.1. Nuôi cấy phôi non Nuôi cấy phôi non nhằm tạo nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu gây đột biến, chọn dòng vô tính, nuôi cấy tế bào trần, chuyển gen và phân lập gen. Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy phôi non phụ thuộc vào: kiểu gen, tuổi phôi, thành phần môi trờng và điều kiện nuôi cấy. 1.1.1.2. Nuôi cấy phôi trởng thành Nuôi cấy phôi trởng thành có nhiều u điểm hơn so với nuôi cấy phôi non: phôi dễ tách, có thể có số lợng lớn và luôn chủ động về nguồn vật liệu ban đầu. 1.1.2. Nuôi cấy bao phấn 4 Trong số các cây trồng quan trọng thì ngô thuộc loại cây rất khó ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn. Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy bao phấn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu gen, môi trờng nuôi cấy, các biện pháp kỹ thuật tác động nhằm tăng phản ứng của bao phấn đối với môi trờng nuôi cấy, điều kiện sinh trởng của cây cho bao phấn. 1.1.3. Nuôi cấy hạt phấn tách rời Tơng tự kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy hạt phấn tách rời cũng gặp các khó khăn nh: sự hình thành cấu trúc phôi phụ thuộc vào kiểu gen, tần suất xuất hiện phôi thấp. Ngoài ra, hệ thống nuôi cấy này đòi hỏi kỹ thuật tách hạt phấn, thao tác vô trùng. 1.1.4. Nuôi cấy tế bào trần Việc nghiên cứu thành công quy trình nuôi cấy tế bào trần ở cây ngô có ý nghĩa rất lớn cho công tác chọn tạo giống. Hai yếu tố quyết định đến sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần là kiểu gen và thời gian nuôi cấy dịch huyền phù tế bào. 1.1.5. Nuôi cấy noãn Nuôi cấy noãn cha thụ tinh là một trong những hớng nghiên cứu để tạo dòng thuần. Phản ứng tạo mô sẹo của noãn ngoài phụ thuộc vào kiểu gen còn phụ thuộc vào điều kiện sinh trởng của cây mẹ, yếu tố sinh thái vùng, môi trờng và kỹ thuật nuôi cấy. 1.1.6. Nuôi cấy mô phân sinh chồi đỉnh Hệ thống nuôi cấy này có u điểm là ít phụ thuộc vào kiểu gen, thao tác tách mô phân sinh nhanh và đơn giản hơn so với việc tách phôi non. Mô phân sinh chồi đỉnh là hệ thống nuôi cấy và tái sinh tiềm năng đối với các nghiên cứu biến nạp di truyền ở cây ngô. 1.2. Hệ thống tái sinh hiệu quả sử dụng cho biến nạp di truyền ở cây ngô Phôi hợp tử non là hệ thống tế bào đích lý tởng cho các nghiên cứu chuyển gen ở ngô. 1.2.1. Sự phát triển của phôi hợp tử in vitro và các yếu tố ảnh hởng Phát sinh hình thái các giai đoạn phát triển của phôi trong điều kiện in vitro cũng tơng tự với quá trình phát triển của phôi ở trong cây. Mùa vụ đã ảnh hởng đến sự phát triển của các tế bào tiền phôi. Thành phần môi 5 trờng nuôi cấy cũng rất quan trọng đối với sự phát triển của phôi. Việc xác định đúng vị trí đặt phôi trên môi trờng nuôi cấy là rất cần thiết. Kiểu gen có ảnh hởng nhiều đến sự phát triển của phôi. 1.2.2. Hình thái và các dạng mô sẹo tạo thành trong nuôi cấy phôi non Hầu hết các dòng ngô đều có khả năng tạo mô sẹo dạng I từ phôi non nuôi cấy. Mô sẹo dạng II thờng đợc sử dụng trong nuôi cấy tế bào huyền phù, chỉ đợc hình thành và áp dụng trong chuyển gen ở các dòng ngô mô hình. 1.2.3. Các yếu tố chính ảnh hởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non Bao gồm các yếu tố sau: kiểu gen, kích thớc phôi, môi trờng nuôi cấy: chất điều hoà sinh trởng, đờng, axit amin, chất tạo giá thể 1.3. Các phơng pháp chuyển gen ở thực vật 1.3.1.Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 1.3.1.1. Hệ thống chuyển gen in vitro Hệ thống chuyển gen in vitro đòi hỏi phải có đợc sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của A. tumefaciens và khả năng tái sinh của tế bào thực vật sau khi lây nhiễm với vi khuẩn. 1.3.1.2. Hệ thống chuyển gen in vivo Phơng pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua công đoạn nuôi cấy mô và tái sinh sau biến nạp. 1.3.2.Chuyển gen trực tiếp Phơng pháp chuyển gen trực tiếp đợc áp dụng với nhiều kỹ thuật nh: Biến nạp bằng súng bắn gen Biến nạp bằng hoá chất Biến nạp bằng xung điện 1.3.3. Các phơng pháp chuyển gen khác Phơng pháp vi tiêm, vĩ tiêm, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm, silicon carbide, agrolistic. 1.4. Nghiên cứu chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 6 Đối với phơng pháp chuyển gen nhờ A. tumefaciens thì tần số biến nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn và thực vật. Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn: chủng, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, hoạt tính của gen vir, loại vectơ, khả năng xâm nhiễm. Các yếu tố liên quan đến thực vật gồm: loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô, khả năng phân bào của tế bào đích, môi trờng nuôi cấy. Cây ngô, một loài cây trồng khó tính trong chuyển gen thông qua Agrobacterium, tần số chuyển gen đã đợc cải thiện bằng việc tối u hoá một số yếu tố: thành phần môi trờng, điều kiện nuôi cộng sinh và phục hồi Mặc dù vậy, các công trình chuyển gen thành công ở ngô vẫn bị giới hạn bởi việc sử dụng vật liệu là dòng ngô A188 hoặc dòng lai trong đó dòng A188 là bố hoặc mẹ. 1.5. Nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen vào cây một lá mầm Nhìn chung, ở các cây một lá mầm, do thiếu hệ thống nuôi cấy tế bào có khả năng phôi hoá vì thế mà sau quá trình bắn gen các tế bào bị tổn thơng nặng, làm giảm khả năng tái sinh cây, cây tái sinh thờng bất thụ và mất hoạt tính của gen chuyển nạp. Hơn nữa, các cây tái sinh thờng có độ kết hạt thấp, già hoá sớm, cây còi cọc. Cây ngô chuyển gen hữu thụ cũng đã nhận đợc bằng phơng pháp bắn gen, với tần số chuyển gen vào phôi non dòng A188 đạt trung bình 1%. Ngoài ra, các nghiên cứu cho thấy có khá nhiều dòng ngô chọn lọc đã đợc chuyển gen bằng phơng pháp này, phôi non là dạng mô đích thích hợp nhất cho chuyển gen bằng súng bắn gen. 1.6. Một số đặc tính đã đợc cải thiện ở cây ngô bằng kỹ thuật di truyền Kỹ thuật di truyền đợc áp dụng đối với một số cây ngũ cốc quan trọng và đã thu đợc những kết quả rất khả quan. Nhiều gen quy định các đặc tính quan trọng đã chuyển vào các loài cây ngũ cốc. Hầu hết các dòng chuyển gen này đợc trồng khảo nghiệm ngoài đồng ruộng, nhiều giống đã đợc thơng mại hoá. Đối với cây ngô, một số đặc tính đã đ ợc cải thiện, bao gồm: Kháng thuốc diệt cỏ; Kháng sâu bệnh; Chịu lạnh; Chín sớm; và cải thiện chất lợng hạt [...]... tumefaciens Trên cơ sở kết quả thu đợc của những nghiên cứu tạo dòng ngô chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen giữa phơng pháp biến nạp bằng súng bắn gen và A tumefaciens đã đợc so sánh nhằm xác định đợc phơng pháp chuyển gen thích hợp vào phôi non ở cây ngô (bảng 3.28) Bảng 3.28 So sánh hiệu quả chuyển gen vào phôi non dòng ngô HR8 bằng phơng pháp súng bắn gen và thông qua A tumefaciens Phơng pháp áp Số... tạo ra bằng phơng pháp lai hữu tính kết hợp tái sinh in vitro 3.3 Xây dựng v hon thiện quy trình chuyển gen ở ngô bằng súng bắn gen 3.3.1 .Xây dựng quy trình chuyển gen bằng súng bắn gen Nhằm mục đích xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen vào ngô sử dụng súng bắn gen, chúng tôi đã nghiên cứu và tối u hoá một số yếu tố chính ảnh hởng tới biểu hiện gen tạm thời và khả năng tái sinh của mẫu mô sau... 1 2 3 4 Hình 3.31 Biểu hiện của gen gus ở chồi (1) và rễ cây ngô tái sinh (2) từ phôi non đã đợc chuyển gen; chồi (3) và rễ (4) cây ngô tái sinh từ phôi non không đợc chuyển gen trong dung dịch X-Gluc 3.4.4.2 Phân tích PCR Tách chiết ADN tổng số từ lá non của 80 dòng ngô HR8 chuyển gen tái sinh và tiến hành phân tích PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu T5, T6; T7, T8, và T9, T10 đã đợc thiết kế để có... tumefaciens 3.4.1 Xây dựng quy trình biến nạp gen thông qua A tumefaciens Để xây dựng đợc quy trình chuyển gen vào phôi ngô non nhờ vi khuẩn A tumefaciens, chúng tôi đã nghiên cứu một số yếu tố chính ảnh hởng đến 17 biểu hiện gen tạm thời và hiệu quả xâm nhiễm của vi khuẩn vào phôi non dòng ngô HR8 3.4.1.1 Lựa chọn chủng A tumefaciens và vectơ thích hợp cho biến nạp gen ở ngô Trong nghiên cứu này chúng tôi... cách từ 13 màng nổ tới mô đích có ảnh hởng rõ rệt tới tần số biểu hiện gen tạm thời Biểu hiện gen tạm thời đạt giá trị cao nhất khi bắn ở khoảng cách 9 cm với áp lực bắn 1350 psi (đạt 53,2 đốm xanh /phôi) 3.3.1.3 Xác định đoạn gen khởi động thích hợp cho biến nạp vào phôi ngô non bằng súng bắn gen Phôi non tiền nuôi cấy 5 ngày đợc chuyển gen bởi các plasmid mang đoạn gen khởi động khác nhau: Act1; Ubi và. .. suất thẩm thấu 5 giờ trớc và 20 giờ sau khi bắn gen (đạt 113,4 đốm xanh /phôi (hình 3.17.B) 3.3.2 Quy trình biến nạp bằng súng bắn gen Trên cơ sở nghiên cứu các yếu tố chính ảnh hởng đến biểu hiện gen tạm thời và khả năng tái sinh của mô chuyển gen, chúng tôi đã xây dựng và hoàn thiện đợc quy trình biến nạp gen vào phôi ngô non bằng súng bắn gen nh sau: Chuẩn bị mẫu mô đích: Phôi non (1-2 mm) tiền nuôi... phôi hoá và 71 cây tái sinh trên môi trờng chọn lọc (có bổ sung 5 mg/l PPT) Các cây tái sinh đợc chuyển ra đất trồng, sau đó thu mẫu lá để tiến hành các phân tích sinh học phân tử 3.3.4 Phân tích các dòng ngô chuyển gen 3.3.4.1 Phân tích PCR ADN tổng số đợc tách chiết từ lá non của 71 cây dòng ngô HR8 tái sinh đã đợc chuyển gen Để xác định sự có mặt của các gen chuyển nạp trong hệ gen của các cây ngô. .. tái sinh cao 23 2 Đã tạo ra 5 dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh tốt bằng phơng pháp lai hữu tính kết hợp với tái sinh in vitro Cảm ứng tái sinh đã đợc truyền từ dòng ngô tái sinh cao (HR8) sang 5 dòng ngô Việt Nam, tạo ra các dòng BC2FN: GAB, GA35, GCA8, GH35 và GCH8 Các dòng ngô BC2FN này có khả năng tái sinh tốt, thích ứng với điều kiện tự nhiên Việt Nam 3 Quy trình chuyển gen vào phôi non. .. nạp gen cao nhất Đã tạo đợc 12 dòng ngô HR8 mang gen nptII có khả năng kháng kanamycin, thu nhận hạt ngô chuyển gen thế hệ R1 5 Đã xác định đợc phơng pháp biến nạp gen thông qua A tumefaciens vào phôi ngô non có hiệu quả hơn so với phơng pháp bắn gen cả về lý thuyết và thực tiễn Phơng pháp này sẽ đợc áp dụng để chuyển các gen có giá trị kinh tế vào các dòng/giống ngô Đề nghị 1 Tiếp tục nghiên cứu các... với cây chuyển gen trong điều kiện nhà kính Chơng 3 Kết quả v thảo luận 3.1 Xây dựng v hon thiện hệ thống tái sinh từ phôi non 3.1.1 Đánh giá khả năng sinh trởng và phát triển của 2 dòng ngô nhập nội HR8, HR9 trong điều kiện Việt Nam Kết quả đánh giá sinh trởng, phát triển của dòng ngô HR8 và HR9 qua các thời vụ trồng ở Việt Nam cho thấy, vụ đông là thời vụ thích hợp nhất cho cả 2 dòng ngô HR8 và HR9 . xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô. 2. Mục đích nghiên cứu 2 Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào để xây dựng hệ thống tái sinh từ. đó, xác định đợc phơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô, góp phần phát triển lĩnh vực chọn tạo giống ngô bằng công nghệ sinh học. 3. Nội dung nghiên cứu Xây dựng và hoàn thiện hệ thống tái sinh. và Đào tạo Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam Viện Công nghệ Sinh học ******** Phạm thị lý thu Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non v xác định phơng pháp chuyển