Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 1/2008 54 Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc BVTV trong rau bằng máy sắc ký khí, phục vụ kiểm soát nông sản an toàn Research on development of multi-residue analysis for pesticides by gas chromatography used in controling safe agroproducts Nguyễn Trường Thành, Đỗ Ngọc Hải Viện Bảo vệ thực vật Abstract Monitoring effectively and timely the pesticide residues in agro-products, especially in vegetables is urgent demand for serving production and business of safe vegetables. The subject deal with the methods to pesticide residue analysis presently and their capable application and building the multi-residue analysis methods in vegetables according with our country conditions. These methods can control residue of 20 pesticides used in our country including organochlorine, organophosphates, pyrethroids and others. The determination equipments of the methods are Gas Chromatography (GC). Recovery of these methods is mainly from 70 to 130%. I. Đặt vấn đề Trên thế giới, nhiều tác giả cũng đó đưa ra phương pháp xác định nhanh dư lượng thuốc BVTV trong rau , bao gồm phương pháp phân tích nhanh hoá học, phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp thử sinh học nhanh dựa trên enzim ChE, phương pháp ELISA được một số nước nghiên cứu và ứng dụng Tuy nhiên, các phương pháp này chủ yếu là định tính và chỉ cho một chất hoặc một nhóm chất nào đó [6, 7], không thể dùng chúng để kiểm tra xem nông sản có an toàn hay không. Trong các phương pháp phân tích chính xác (dựa trên các công cụ như sắc ký, quang phổ hấp thu nguyờn tử, ) phương pháp phân tích đơn dư lượng đó được phát triển mạnh nhằm kiểm tra dư lượng của một loại thuốc BVTV đó định trước trong nông sản. Tuy nhiên, để kiểm tra độ an toàn của sản phẩm, người ta không thể kiểm tra lần lượt từng chất, xét cả về thời gian và chi phí. Do vậy, việc nghiên cứu để kiểm tra từng nhóm và nhiều nhóm thuốc BVTV đó được nhiều nước tập trung nghiên cứu cùng với sự phát triển ngày càng nhanh của các công cụ phát hiện có độ tinh vi ngày càng cao như điện di mao quản, quang phổ UV/VIS , sắc ký khí GC, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, sắc ký lỏng siờu Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 1/2008 55 hạn, [2, 4, 8, 9, 10]. Hiện chưa có công bố nào ở nước ta về phân tích đa dư lượng đồng thời với nhiều nhóm thuốc. Và như vậy, việc nghiên cứu phương pháp phân tích đa dư lượng để có thể kiểm soát được nhiều thuốc có nguy cơ cao đang được sử dụng ở nước ta trong rau là cần thiết. II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu và cụng cụ nghiờn cứu: Cỏc loại chất chuẩn, dung môi, các hoá chất bổ trợ như Na 2 SO 4 , NaCl, ; các cột chiết SPE (dạng 500 mg); sản phẩm rau ăn lá, rau ăn quả khô; các máy sắc ký GC Agilent 6890 N. Phương pháp phân tích đa dư lượng + Đánh giá một số phương pháp phân tích đa dư lượng ở các nước bằng thử nghiệm và xác định khả năng ứng dụng thông qua hiệu suất thu hồi. + Xác định và lựa chọn phương pháp phân tích đa dư lượng phù hợp với điều kiện ở Việt Nam: - Sử dụng cỏc phương pháp chiết thụng dụng nhất trong phõn tớch: chiết lỏng-lỏng với dung môi có khả năng cao nhất tách các chất ra khỏi mẫu [1,5]. - Sử dụng phương pháp làm sạch bằng cột sắc ký hoặc chiết pha rắn (SPE) với cỏc hệ dung mụi giải hấp [8] - Lựa chọn cỏc detector, cột và cỏc thụng số cho chạy GC theo phương pháp thử nghiệm trực tiếp trên máy sao cho độ nhạy và khả năng tách giữa các chất được đảm bảo. - Đánh giá độ tin cậy của các phương pháp thông qua xác định hiệu suất thu hồi R [9]. III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 1. Đánh giá phương pháp phân tích đa dư lượng của một số nước Bảng 1. So sánh phương pháp phân tích đa dư lượng ở một số nước Phương pháp DFG (1987) [1] TACTRI (2002) [8] NIAST (2000) [4] MPHWS (1996)[13] Nước Đức Đài Loan Hàn Quốc Hà Lan Chiết Acetone, H 2 O Acetone Acetone Acetone Tỏch Lỏng – lỏng NaCl, CH 2 Cl 2 Lỏng – lỏng NaCl, Pertrelium ether, CH 2 Cl 2 Lỏng – lỏng NaCl, CH 2 Cl 2 Pertrelium ether, CH 2 Cl 2 Làm sạch Thẩm thấu qua Gel (GPC) Chiết pha rắn SPE (Florisil) 1 h ệ dung mụi Cột Florisil- 5 hệ dung mụi giải hấp Ly tõm 4000 vũng/ phỳt (2 phỳt) Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 1/2008 56 gi ả i h ấp (n-hexane/ CH 2 Cl 2 =1:5) (n - hexane, CH 2 Cl 2 , Actonitrile) Mỏy phõn tớch GC/ ECD - FPD GC/ ECD – FPD HPLC/ FL GC/ ECD – FPD - FID GC/ ECD - NPD - FID Nhúm chất Lân hữu cơ, Clo hữu cơ, thuốc chứa N và một số thuốc khác Lân hữu cơ, Clo hữu cơ, Pyrethroid, N-Methyl carbamate Lân hữu cơ, Clo hữu cơ, Pyrethroid, 1 số thuốc khỏc Lân hữu cơ, Clo hữu cơ, Pyrethroid, 1 số thuốc khỏc Ưu nhược Phải cú hệ thống GPC, chưa phân tích được nhóm Carbamate Do dựng 1 hệ dung mụi giải hấp , một số chất cú hiệu suất thu hồi thấp Dựng cột tỏch + nhiều hệ dung mụi giải hấp -> chi phớ lớn, phức tạp Một số chất nhóm clo hữu cơ có hiệu suất thu hồi thấp (<60%) Thử nghiệm trên thực tế (bảng 1) chúng tôi có những đánh giá sau về ưu nhược điểm của các phương pháp phân tích đa dư lượng mà một số tác giả đưa ra như sau: * Phương pháp của Hà Lan sẽ rất tối ưu để phát hiện các nhóm chất mà việc ly tâm không ảnh hưởng tới việc định lượng. Song để phân tích đa dư lượng nhằm kiểm soát hầu hết các thuốc BVTV, phương pháp này không bao quát được các nhóm thuốc clo hữu cơ. Chẳng hạn với DDT, theo kết quả thử nghiệm của chúng tôi, phương pháp này chỉ cho hiệu suất thu hồi dưới 50%. * Các phương pháp của Đức, Đài Loan, Hàn Quốc có bản chất gần nhau: Chiết lỏng-lỏng với pha nước và dung môi hữu cơ, làm sạch bằng cột tách và xác định hàm lượng thuốc bằng máy sắc ký. Phương pháp của Hàn Quốc có chi phí lớn và khá tốn thời gian do chiết qua cột sắc ký lớn. Cỏc phương pháp khác cũng cần cải tiến để số thuốc kiểm soát được nhiều hơn 2. Nghiên cứu phương pháp phân tích đa dư lượng trên rau Chọn các thuốc đại diện và xây dựng các đường chuẩn Về các loại thuốc BVTV, chúng tôi lấy 20 đại diện cho các thuốc sâu lân hữu cơ, clo hữu cơ, thuốc trừ bệnh, thuốc trừ nhện, kể cả thuốc cấm như BHC, DDT. Vỡ 20 thuốc lựa chọn trờn cú thời gian lưu rất gần nhau nên, sau khi kiểm tra thời gian lưu của chúng trên máy sắc ký, chúng tôi đó Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 1/2008 57 chia chỳng thành 3 nhúm, mỗi nhúm 6-8 chất sao cho mỗi nhúm cỏc chất cú thể tỏch nhau khỏ tốt trờn sắc ký đồ. Đường chuẩn trờn mỏy sắc ký được thiết lập theo từng nhóm chất, dựa trên việc phân tích mỗi chất ở các nồng độ khác nhau: 0,05; 0,1; 0,5; 1; 5 g/ mL. Đường hồi quy được lập cho mỗi chất (Bảng 2) Hiệu suất thu hồi được xác định cho mỗi chất bằng cách đưa chuẩn vào từng loại nông sản (rau ăn lá, rau ăn quả), thực hiện các bước phân tích đa dư lượng, xác định hàm lượng thuốc sau khi phân tích mẫu so với hàm lượng thuốc ban đầu. Vấn đề loại mẫu nụng sản ảnh hưởng không nhỏ đến quá trỡnh phõn tớch do sự tham gia và gõy nhiễu của các hoá chất hữu cơ trong nông sản. Vỡ vậy, với cõy rau chỳng tụi chọn hai loại đại diện cho rau ăn lá (cải xanh) và rau ăn quả (dưa chuột). Bảng 2. Các thuốc lựa chọn đại diện cho phân tích đa dư lượng trên rau STT Nhúm thuốc Tờn thuốc Loại thuốc 1 Clo hữu cơ Endosulfan Trừ sõu 2 BHC 3 DDT 4 Lân hữu cơ Fenitrothion 5 Methidathion 6 Diazinon 7 Malathion 8 Phosalone 9 Pyrethroid Cypermethrin Trừ sõu 10 Alpha-cypermethrin 11 Cyfluthrin 12 Lambdacyhalothrin 13 Fenvalerate 14 Fenpropathrin Trừ nhện 15 Pyridamizole Pyridaben 16 Fiproles Fipronil Trừ sõu 17 Triazole Hexaconazole Trừ bệnh 18 Propiconazole Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 1/2008 58 STT Nhúm thuốc Tờn thuốc Loại thuốc 19 Dicarboximide Iprodione 20 Aromatic Chlorothalonil 2.1. Nghiên cứu xác lập phương pháp phân tích đa dư lượng trên rau - Sau khi thử nghiệm các phương pháp của các nước, chúng tôi thấy về cơ bản nên dựa vào các phương pháp này song cần có những thay đổi để hạn chế những nhược điểm và sử dụng các ưu điểm của mỗi phương pháp như sau: + Sử dụng nước bổ sung như của Đức song đối với rau bổ sung ngay khi xay mẫu trong bỡnh xay đồng nhất mẫu, cũn đối với chè thỡ cho ngõm ngay vào nước sôi vừa tốn ít dung môi mà vẫn có lượng mẫu đại diện lớn. + Sử dụng chiết pha rắn SPE như của Đài Loan, vừa nhanh chóng, vừa tốn ít dung môi, an toàn hơn với môi trường so với sử dụng cột tách lớn. Chúng tôi sử dụng hệ dung môi rửa giải không theo kiểu 1 hệ như Đài Loan, cũng không theo kiểu 5 hệ như Hàn Quốc mà là 2 hệ là cơ bản đó giải hấp được các thuốc nêu trên: n-hexane/ CH 2 Cl 2 = 1/5 và n- hexane/CH 2 Cl 2 / CH 3 CN = 49,65:50:0.35. Lược đồ phân tích được trỡnh bày trong hỡnh 1. 2.2 Đánh giá hiệu quả của phương pháp VMRA1 Về khả năng định tính và định lượng: Trên rau cải xanh, theo 3 nhóm E1, E2, E3 mỗi chất chuẩn được cho vào mẫu sao cho hàm lượng đạt 0,1 ppm trước khi phân tích mẫu. Sử dụng đường chuẩn đó xõy dựng để xác định nồng độ chất chuẩn thu được sau khi phân tích, kết quả xác định hiệu suất thu hồi cho thấy: với việc áp dụng phương pháp VMRA1 trên rau cải xanh, cả 20 chất trên đều cho hiệu suất thu hồi cho phép: 65 – 130 % (19/20 chất đạt hiệu suất 70- 130%). Trên quả dưa chuột, áp dụng phương pháp VMRA1, đối với 20 chất chuẩn thí nghiệm, hiệu suất thu hồi đạt khá tốt: 64,4 – 144,6% (18/20 chất đạt hệ số thu hồi 70-130%). Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 1/2008 59 Hỡnh 1. Lược đồ phân tích đa dư lượng thuốc trên rau (VMRA1) Về khả năng phát hiện của phương pháp đối với các chất: Dựa vào phản ứng của píc của các chất chuẩn: Phản ứng của LOD = 2 x phản ứng của đường nền. Kết quả: LOD  0,05 ppm đối với tất cả 20 chất chuẩn thử nghiệm. Về thời gian và chi phí vật tư kỹ thuật: Về thời gian và chi phí cho 1 mẫu phân tích đa dư lượng là khoảng 4 – 6 giờ và 700 - 900 nghỡn đ (giá năm 2007). Quy trỡnh túm tắt phõn tớch đa dư lượng MRA đối với sản phẩm rau  Thiết lập đường chuẩn cho các thuốc trong phạm vi sử dụng (tạo 3 hỗn hợp E1, E2, E3 với nồng độ 0,05; 0,1; 0,5; 1 ppm).  Lấy mẫu rau ăn lá, ăn quả: Trên đồng ruộng, lấy mẫu rau theo hỡnh X hoặc S. Mẫu cú đơn vị nhỏ ( < 25 g): Lấy 0,5 kg (rau cải khụ); Cú đơn vị trung bỡnh ( 25 – 250 g): Lấy 1 kg (dưa chuột); Có đơn vị lớn ( > 250 g): Lấy 2 kg.  Xử lý mẫu: Mẫu rau được đem ngay về phũng phõn tớch, thỏi nhỏ 1-2 cm, lấy đại diện 200 g cho phân tích rau ăn lá hoặc 300 g cho rau ăn quả đ- ưa vào xay với nước (cho từng ít một để xay nhuyễn trong nước).  Chiết xuất và làm sạch mẫu và phõn tớch như sơ đồ 1 (VMRA1). kết luận Phương pháp phân tích đa dư lượng VMRA1 trên rau cải tiến từ các phương pháp đa dư lượng của các nước cho phù hợp với điều kiện phũng thớ nghiệm ở nước ta có thể sử dụng để kiểm soát dư lượng của 20 loại thuốc đang sử dụng phổ biến trên với hiệu suất thu hồi của hầu hết các thuốc đạt 70-130%; Thời gian và chi phí phân tích là chấp nhận được trong việc kiểm soát dư lượng thuốc BVTV trong sản phẩm rau. tài liệu tham khảo 1. DFG Deutsche Forschungemeinschaft (1987). Manual of Pesticide Residue Analysis. Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 1/2008 60 Pesticides Commission. VCH Publishers. 2. FAO/WHO (2000). Pesticide Residue in Food - Maximum Residue Limits . CODEX Alimentarius Commission 3. Ministry of Public Health, Welfare and Sport. (1996). Analytical Methods for Pesticide Residue in Foodstuffs. General inspectorate for health protection. Neitherland. 4. Oh B. Y. (2000). Pesticide Residue for Food Safety and Environment Protection. NIAST, Suwon, Korea. 5. Philip W. L. (2003). Handbook of Residue Analytical Methods for Agrochemicals. Dupont Crop Protection, USA. 6. TARI (1990). Rapid Bioassay of Pesticide Residues on Fruits and Vegetables (RBPR). TARI, Taichung, Taiwan, ROC. 7. Tổng cục Kỹ thuật , Bộ Cụng an (2004). Nghiờn cứu lựa chọn kỹ thuật thích ứng để kiểm tra nhanh dư lượng một số thuốc trừ sâu trên rau phục vụ tiêu dùng ở Hà Nội. Bỏo cỏo tại Sở Khoa học và Cụng nghệ Hà Nội 4/2005. 8. Tsai M.C. (2001). Multi-residues Analysis of Fruit and Vegetables. In “International Training Program of Safe Vegetable Production and Multi- residue Analytical Method of Pesticides”.TACTRI, Taiwan, China. 9. Winefordner J. D. (Editor) (1999). Chemical Analysis. Pesticide Residue in Food. A Wiley-interscience Publication. John Wiley & Sons. Inc. 10. Yeoh N. S. (2002). Pesticide Residue in Food. MRLs and Food Safety. Asean Agrochemical. Residues Worshop October 28-29, 2002. . Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 1/2008 54 Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc BVTV trong rau bằng máy sắc ký khí, phục vụ kiểm soát nông sản an toàn Research. ra phương pháp xác định nhanh dư lượng thuốc BVTV trong rau , bao gồm phương pháp phân tích nhanh hoá học, phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp thử sinh học nhanh dựa trên enzim ChE, phương. 500 mg); sản phẩm rau ăn lá, rau ăn quả khô; các máy sắc ký GC Agilent 6890 N. Phương pháp phân tích đa dư lượng + Đánh giá một số phương pháp phân tích đa dư lượng ở các nước bằng thử