Nghiên cứu phát hiện nguồn gen kháng bệnh bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa Detection of bacterial leaf blight resistance genes for rice breeding Phan Hữu Tôn Summary In order to develop varieties with durable resistance to the bacterial leaf blight, the avaiability of variable germplasm plays an important role. 120 Vietnamese local varieties were screened for resistance genes to Xanthomonas oryzae pv. oryzae using PCR technique and artificial innoculation. Eight varieties were identified containing Xa-7 effective gene. Accuracy of PCR method was confirmed by comparison with the results of artificial innoculation. 12 varieties identified by PCR containing xa-5 and Xa-7 showed strong resistance to all six pathotypes similar to IRBB5 and IRBB7 isogenic lines, No recombinations or other mutations were observed. Key words: Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, eaf blight bacteria, reistance genes, PCR technique 1. Đặt vấn đề Muốn chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá thành công thì việc có nguồn gen kháng phong phú đóng vai trò quan trọng. Để phát hiện nguồn gen kháng có nhiều phơng pháp khác nhau, trong đó phơng pháp truyền thống là sử dụng tập đoàn các dòng đẳng gen đem lây nhiễm với tập đoàn các chủng vi khuẩn bạc lá chuẩn đợc phân lập. Phơng pháp áp dụng chỉ thị phân tử AND (RFLP) hiện cũng đang đợc nhiều nhà khoa học quan tâm, nó có thể xác định đợc vị trí từng gen trên nhiễm sắc thể (NST) thông qua đoạn ADN dò đặc hiệu liên kết với gen đó với khoảng cách liên kết nhất định, từ đó xây dựng bản đồ di truyền cho các gen kháng. Một số gen đã đợc xác định bằng chỉ thị phân tử nh: Gen Xa-3 liên kết với RFLP ở locus XNpb181 trên NST số 11, khoảng cách liên kết là 2,3 cM, gen Xa-4 cũng liên kết với chỉ thị này nhng với khoảng cách liên kết là 1,7cM. Gen lặn xa- 5 liên kết với chỉ thị RG 556, RG 207 và R 2390 trên NST số 5 (Khush & Ogawa; 1991). Tuy nhiên, áp dụng phơng pháp chỉ thị phân tử RFLP mất nhiều thời gian, nhiều khi phải dùng đến phóng xạ, lợng ADN cần nhiều và tinh khiết, nên khó áp dụng rộng rãi. Để khắc phục, ngời ta đề xuất chuyển sang phơng pháp chọn lọc gián tiếp trên cơ sở nhân ADN bằng phơng pháp PCR, sau đó chạy điện di rồi xác định sự đa hình giữa kiểu gen kháng và nhiễm. Có rất nhiều mẫu dò liên kết với gen kháng bệnh đã xác định đợc trình tự ADN, nên việc thiết kế các đoạn mồi là đơn giản. Nghiên cứu này đợc tiến hành nhằm mục đích dự đoán khả năng chứa gen kháng của tập đoàn giống lúa địa phơng, đồng thời áp dụng phơng pháp nhân gen PCR để phát hiện gen kháng và khẳng định tính chính xác và khả năng ứng dụng của phơng pháp này trong chọn tạo giống kháng bệnh. 2. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu Ph ơng pháp nhân gen PCR ADN đợc chiết xuất theo phơng pháp cải tiến của Phan Hữu Tôn (2000). Nhân gen PCR, dung dịch mẫu phản ứng có dung tích 20àl gồm: nớc cất 13,3àl, 10X PCR buffer 2àl, dNTPs 2,5mM 1,6àl, primer 10pmol/àl 1àl, Tag polymerase 5units/àl 0,1àl và cuối cùng thêm vào 1àl dung dịch ADN nguyên bản. Nhân gen Xa-7 dùng 2 đoạn mồi là: P3 F 5'-CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT-3' và P3 R 5'-CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA-3'. Quy trình nhân gồm các bớc: 94 0 C trong 4 phút, nhân 34 chu kỳ: 94 0 C trong 1 phút tiếp theo là 56 0 C trong 1 phút và 72 0 C trong 2 phút, cuối cùng bớc kéo dài ở 72 0 C trong 8 phút, bảo quản ADN đợc nhân ở 4 0 C. Chạy điện di xác định đa hình Dùng gel agarose 2%, chạy điện di ở hiệu điện thế 50V,160mA trong 25 phút. Sau khi chạy xong, đem nhuộm bằng Ethilium bromide trong 10 phút rồi chiếu trên máy UV để xác đinh sự đa hình. Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn lây nhiễm và phơng pháp lây nhiễm nhân tạo theo Furuya và cộng sự (2002). Lây nhiễm nhân tạo Sử dụng 5 chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở miền Bắc Việt Nam là: HAU01043, HAU02020-3, HAU02021-1, HAU01030-1, HAU02040-1 lần lợt thuộc các chủng 1, 7, 5, 4 và 8 và một chủng của Nhật Bản B2C9 (s) lây nhiễm cho 120 giống lúa địa phơng thu thập ở miền Bắc Việt Nam, cắt 2 - 5 cm đầu lá lúa ở giai đoạn làm đòng, mỗi cây lây nhiễm 10 lá cho một chủng. Đánh giá khả năng chống bệnh bạc lá trên cơ sở đo chiều dài vết bệnh sau 20 ngày lây nhiễm: Chiều dài < 8cm, chống bệnh(R); từ 8 12 cm, nhiễm vừa (M); dài >12 cm, nhiễm (S) . Dự đoán khả năng chứa gen kháng của các giống lúa thông qua so sánh với phổ kháng nhiễm của 11 dòng đẳng gen (chứa đơn gen) trong cùng điều kiện và số chủng lây nhiễm. 3. Kết quả nghiên cứu 3.1. Dự đoán khả năng chứa gen kháng của các giống Sau khi lây nhiễm 6 chủng cho các dòng đẳng chứa đơn gen, thu đợc phổ chống nhiễm ở bảng 1 Bảng 1. Phản ứng của các dòng đẳng gen đối với 6 chủng vi khuẩn TT Giống Gen HAU 01043 HAU 02020-3 HAU 02021-2 HAU 01030-1 HAU 02040-1 B 2 C 9 (s) Tỷ lệ R/M/S 1 IR24 S S S S S S 6 S 2 IRBB1 Xa-1 S S S S S S 6S 3 IRBB2 Xa-2 S S S S S S 6S 4 IRBB3 Xa-3 R S S S S R 2R/4S 5 IRBB4 Xa-4 S R S S S R 2R/4S 6 IRBB5 xa-5 R R R R R R 6R 7 IRBB7 Xa-7 R R R R R R 6R 8 IRBB10 Xa-10 S S S S S S 6S 9 IRBB11 Xa-11 S S S S S R 6S 10 IRBB14 Xa-14 R R R S S M 3R/1M/2s 11 IRBB21 Xa-21 R R R R R R 6R Bảng 2. Phản ứng của 120 giống 6 chủng vi khuẩn lây nhiễm KHG Tên giống HAU 01043 HAU 02020-3 HAU 02021-2 HAU 01030-1 HAU 02040-1 B 2 C 9 (s) Tỷ lệ R/M/S 54 giống lúa nếp 10129-1 Nế p Thái lan M M M M M R 1R/5M 10129-2 Nế p Thái lan M S RMMM 1R/4M/1 S 10103 Nế p 352 R R R R R R 6R 10211 Lúa cẩm R R R R R R 6R 10203-1 Nế p Aham M M M M M R 1R/5M 10203-2 Nế p Aham S M S S S R 1R/4S/1M 10001 Nế p đ ị a p hơn g S MR M R R 3R/2M/1 S 10347 - M R R R R R 5R/1M 10114 Nế p tám M S S S S R 1M/5 S 10107 Cẩm tun thấ p câ y S S S S S M 5S/1M 10057 Lúa nế p RRR R RR 6R 10346 - M R R M R R 4R/2M 10342 - M S R S S S 1R/1M/4 S 10139 Nế p nơn g S S S S S S 6 S 10350 - R R R R R R 6R 10358 - M R R R R R 5R/1M 10118 Nế p q ua R S R S S R 3R/3 S 10100-1 Nế p khơ mú S S M S S S 1M/5 S 10100-3 Nế p khơ mú R M R M M S 2R/3M/1 S 10094 Cẩm lùn S S S S S S 6 S 10153 Nế p tròn S S S S S S 6 S 10355 - S S RMM S 1R/2M/3 S 10202-1 Nế p Patan g S S S S S S 6 S 10202-2 Nế p Patan g MMM S S S 3M/3 S 10078 Lúa nế p 6 M M R M M R 2R/4M 10352 - M S R S S M 1R/2M/3 S 10124 Nế p cẩm vỏ đỏ S S S S S S 6 S 10113 Nế p nơn g đ ị a p hơn g S S S S S S 6 S 10205-1 Nế p trắn g S M S S S M 2M/4 S 10351 - S S M S S M 2M/4 S 10132 Nế p cẩm 2 M R R R M R 4R/2M 10105 Nế p cẩm vỏ trắn g S S S S S S 6 S 10138 Nế p nơn g h ạ t tron g S S M S S S 1M/5 S 10067 Lúa nế p mèo S S S S S S 6 S 10151 Nế p cái rồn g S S M S S S 1M/5 S 10142-2 Lúa nế p cẩm S S S S S R 1R/5 S 10140 Nế p cẩm 3 S S S M S M 2M/4 S 10133-3 Lúa nế p nơn g M S M S S R 1R/2M/3 S 10344 - R S R S S R 3R/3 S 10354 - R M R S S R 3R/1M/2 S 10133-1 Lúa nế p nơn g S S S S S S 6 S 10147 Lúa tiết g à S MM M S R 1R/3M/2 S 10133-2 Lúa nế p nơn g R S S S S R 2R/4 S 10142-1 Lúa tẻ nơn g S S M S S S 1M/5 S 10155 Nế p lau S S S S S S 6 S 10208 Lúa nếp nơng S S M S S S 1M/5S 10095-1 Nế p be lanh1 S S S S S S 6 S 10095-2 Nế p be lanh2 S S S S S S 6 S 10071 Lúa nế p 10 S S S S S S 6 S 10058 Lúa nếp cẩm S S S M S S 1M/5S 10072 Lúa nếp địa phơng7 S S M S S S 1M/5S 10106-4 Nếp be lanh M S M S S S 2M/4S 10106-3 Nếp be lanh S S S S S S 6S 10106-1 Nếp be lanh S S S S S S 6S 66 giống lúa tẻ 10008 S.Queen S S M M S R 1R/3S/2M 10206 Lúa thơm S M M M M M 5M/1S 10009 M. Queen M M R R R M 3R/3M 10062-2 Lúa tẻ 1 R R R M R M 4R/2M 10085 Bao thai lùn R R R R R R 6R 10099-1 Tẻ ma cha1 M M R S S S 1R/2M/3S 10099-2 Tẻ ma cha 2 M S M S S S 2M/4S 10063-2 Lúa tẻ 2 R M R M M R 3R/3M 10197-1 Lúa khô S S S S S S 6S 10197-2 Lúa khô M M M M S S 4M/2S 10214-1 Lúa R38 M M R M M S 1R/4M/1S 10007 Takanari R R R M M R 4R/2M 10154 Bao thai R R R R R R 6R 10135 Bao thai địa phơng R R R R R R 6R 10120 Giống cũ 32 R R R M R R 5R/1M 10134-2 Lúa tiên u S S S S _ S 5S 10218 Khâu R S S S S R 2R/4S 10219 Khâu: bồ dàng R R R R R R 6R 10121 Giống DV108 M R _ R R R 4R/1M 10213 Lúa 36 M M R M M M 1R/5M 10222 Khâu: dâm S S S S S S 6S 10123 Tám thơm 1 M M R M M M 1R/5M 10224 Khâu: him R S M S S M 1R/2M/3S 10200 Lúa cự kha R S M S _ R 2R/2S/1M 10217 Khâu: non R S M S S S 1R/1M/4S 10149 Lúa kén R M M S S R 1R/2M/3S 10111 IR64 R R R R R R 6R 10063-1 Lúa tẻ 2 S S S S S S 6S 10122-1 Tẻ toàn tiếu R R R R R R 6R 10119 KM18 R R R R R R 6R 10087 Khang dân R R R R R R 6R 10122-2 Tẻ toàn tiếu M R R R R R 5R/1M 10196 Lúa tẻ R R R R R R 6R 10097 IR64 R R R R R R 6R 10215 Lúa kim cơng R R R R R R 6R C70 C70 R R R R R R 6R 10091 90-5 R R R R R R 6R 10096 Bắc thơm S S R S S R 2R/4S 10109 Tẻ tim tín M R R R R R 5R/1M 10102 T. Bai thơm S S R S S M 1R/1M/4S 10223 Khâu: doi S S M S S M 2M/4S 10065 Lúa tẻ 4 S M R M M S 1R/3M/2S 10086 Không tên M S S S S S 1M/5S 10073 Lúa nơng 1 S S S S S _ 5S 10108 Tẻ mèo vỏ tím S S S S S M 1M/5S 10220-1 Khâu: sét S S M S M R 1R/2M/3S 10216 Lúa khâu dai M M M S S M 4M/2S 10221-2 Khâu: luông M R R M R R 4R/2M 10130 Lúa nơng tẻ S S S S S S 6S 10134-1 Lúa tiên u S R R R R R 5R/1S 10137 Lúa nơng (tẻ) R S S S S S 1R/5S 10199-1 Lúa Achi S S S S S R 1R/5S 10199-2 Lúa Achi M S S S S S 1M/5S 10148 Lúa tiết gà S S S S S S 6S 10128 Lúa nơng 8 S S S S S S 6S 10141-2 Lúa tẻ nơng S S S S S M 1M/5S 10064 Lúa tẻ 3 S S S S S S 6S 10116-3 Tẻ mèo vỏ vàng S S S S S S 6S 10090 Thóc tẻ nơng S S S S S S 6S 10198-2 Lúa mùa trắng M S M S S S 2M/4S 10068-2 Bao thai nơng 2 S S M S S M 2M/4S 10066 Lúa nơng trũng M S M _ S S 2M/3S 10068-1 Bao thai nơng 1 M S R M S S 1R/2M/3S 10204-1 Lúa tro R M M S M M 1R/4M/1S 10204-3 Lúa tro S S M S S S 1M/5S 10059 Lúa tẻ M R R S R R 4R/1M/1S 32R/31 M/57S 29R/21 M/70S 67R/29 M/42S 25R/24M /71S 30R/16 M/74S 51R/19 M/50S Độc tính vừa Độc tính mạnh Độc tính nhẹ ấ Độc tính mạnh nhất Độc tính khá mạnh Độc tính tơng ố Trong số 120 giống lúa địa phơng đợc so sánh, có 24 giống nhiễm hoàn toàn với 6 chủng là: 10197-1, 10222, 10063-1,10130, 10148, 10128, 10064, 10116-3, 10090, 10139, 10094, 10153, 10202-1, 10124, 10113, 10105, 10067, 10133-1, 10155, 10095-1, 10095-2, 10071, 10106-3, 10106- 1, các giống này có phổ kháng nhiễm tơng tự nh IR24 và các dòng đẳng gen IRBB1, IRBB2, IRBB10, IRBB11. Do đó, các giống này bớc đầu đợc dự đoán có thể không chứa gen kháng nh IR24 hoặc chứa một trong số các gen kháng Xa-1, Xa-2, Xa-10 hoặc Xa-11. Có 3 giống có phổ kháng-nhiễm tơng tự với các dòng đẳng gen IRBB3, IRBB4 (2R/4S) là: 10133-2, 10218, 10096, dự đoán chúng có thể chứa gen kháng Xa-3 hoặc Xa-4. Có 1 giống có phổ kháng-nhiễm tơng tự với dòng đẳng gen IRBB14 (3R/1M/2S) là 10354, dự đoán giống này có khả năng chứa gen kháng Xa- 14. Có 4 giống nếp và 12 giống tẻ có phản ứng kháng hoàn toàn với tất cả 6 chủng vi khuẩn (6R), phổ kháng này rất giống với các dòng đẳng gen: IRBB5, IRBB7 và IRBB21, chứa lần lợt các gen xa-5, Xa-7 và Xa-21 là: 10103, 10211, 10057,10350,10085, 10154,10219,10111, 10122-1, 10119, 10087, 10196, 10215, 10091, 10134-1 và C70. Do vậy chúng tôi tạm thời dự đoán các giống này có khả năng chứa một trong số các gen kháng hữu hiệu là: xa-5, Xa-7 hoặc Xa-21 (bảng 2). Tuy nhiên, để khẳng định chính xác từng giống chứa gen nào thì cần thiết phải dùng đến phơng pháp nhân gen PCR, đồng thời cần thiết phải sử dụng số lợng chủng lây nhiễm nhiều hơn nữa. Nghiên cứu tính gây độc của từng chủng vi khuẩn dựa trên tỷ lệ kháng nhiễm đối với các dòng giống đánh giá cho thấy chủng có độc tính cao nhất là chủng HAU 01030-1 có tỷ lệ số kháng thấp nhất (25R/24M/71S), tiếp đến là chủng HAU02020-3 với tỷ lệ này là 29R/21M/70S. Chủng HAU02040-1 và HAU 01043 có độ độc tính tơng đơng lần lợt có tỷ lệ là 30R/16M/74S và 32R/31M/57S. Chủng ít có khả năng gây bệnh nhất là 2 chủng, một chủng nhập từ Nhật bản là B2C9 (s) có tỷ lệ này 67R/29M/42S và HAU02021-2 với tỷ lệ 51R/19M/50S. 3.2. Kiểm tra tính xác thực của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện gen Kỹ thuật PCR đã đợc áp dụng để xác định đợc 12 giống có chứa gen xa-5 trong số 145 giống lúa địa phơng mà tác giả thu thập đợc (Phan Hữu Tôn, 2000). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, để khẳng định độ chính xác của phơng pháp PCR và xác định liệu có khả năng xảy ra tái tổ hợp hay không, các giống lúa có chứa gen xa-5 đợc tiến hành lây nhiễm với 6 chủng vi khuẩn (bảng 3). Bảng 3. Phản ứng của các giống chứa gen xa-5 với 6 chủng vi khuẩn lây nhiễm, vụ Xuân 2004 (* cm) Tên giống HAU 01043 HAU 02020-3 HAU 02021-2 HAU 01030-1 HAU 02040-1 B 2 C 9 (s) IRBB5 0,9 * R 1,1 R 1,5 R 1,7 R 2,6 R 1,0 R Bầu hơng Hải Dơng 1,2 R 3,5 R 3,7 R 4,3 R 5,8 R 0,8 R Bla 2,3 R 1,9 R 5,4 R 5,3 R 1,5 R 0,6 R Nha trang 1,7 R 2,5 R 2,1 R 3,9 R 4,7 R 2,3 R Kòi a mé 2,0 R 3,6 R 5,7 R 4,6 R 2,8 R 1,5 R Cá nhân 4,5 R 4,1 R 8,1 M 5,8 R 6,3 R 5,4 R Kết quả đã cho thấy tất cả các giống lúa có chứa gen xa-5 (xác định bằng PCR) đều kháng hoàn toàn với 6 chủng tơng tự nh dòng đẳng gen IRBB5. Điều này chứng tỏ phơng pháp PCR hoàn toàn đáng tin cậy, đồng thời cả 6 giống đều không phát hiện thấy có xảy ra hiện tợng đột biến hoặc trao đổi chéo và tái tổ hợp. Ngoài ra, để phát hiện gen Xa-7 trong 120 giống lúa địa phơng nói trên, hai đoạn mồi đợc sử dụng là: P3 F 5'-CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT-3' P3 R 5'-CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA-3' 12 13 11 89 10 7 6 5 2 3 41 ảnh 1. Kết quả phát hiện gen Xa-7 Ghi chú Lane 1 (Đối chứng không chứa gen Xa-7) giống IR24 Lane 2 (Đối chứng Xa-7) Lane 5, 6, 9, 10, 11, 12 c#c gièng ch#a chứa gen Xa-7 Lane 3, 4, 7, 8, 13 không chứa gen Xa-7 Kết quả phát hiện thấy có 8 giống trong số 16 giống có phản ứng kháng hoàn toàn với 6 chủng có biểu hiện vệt băng sau điện di (ảnh 1) tơng tự nh IRBB7, trong đó có 3 giống nếp: 10103, 10057, 10350 và 5 giống tẻ là: 10085, 10111, 10122-1, 10119, 10134-1. Khả năng của 8 giống còn lại có thể chứa gen xa-5 hoặc Xa-21. Do đó phải tiến hành theo dõi một số các đặc điểm của 8 giống này về chiều cao cây, thời gian sinh trởng, năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất (bảng 4). Bảng 4. Một số đặc điểm nông sinh học các giống chứa gen Xa-7 KH Giống Tên giống Thời gian sinh trởng (ngày) Chiều cao câ y (cm) Số bông hữu hiệu /khóm Số hạt chắc/bông P 1000 hạt (g) Năng suất lý thuyết (tạ/ha) Năng suất thực thu (tạ/ha) Hệ số kinh tế 10103 Nếp 352 139 74,43,4 4,8 129,0 21,7 67,0 51,0 0,50 10057 Lúa Nếp 152 96,81,8 5,4 167,4 24,3 110,0 90,0 0,54 10350 Nếp Tạp Giao 154 90,22,3 3,8 287,4 25,0 136,5 75,0 0,54 10085 Bao Thai Lùn 134 85,22,3 5,4 118,8 20,0 64,0 45,0 0,55 10111 IR 64 127 87,62,7 6,4 124,2 26,0 103,5 57,5 0,43 10091 90-5 142 87,41,5 3,2 256,0 19,0 78,0 46,5 0,5 10134-1 Lúa Tiên u 132 78,04,5 2,6 201,2 18,0 47,0 43,5 0,54 10122-1 Tẻ Toàn Tiêu 103 90,04,15 4,2 184,6 20,0 77,5 36,5 0,36 Có 2 giống đợc xác định có gen Xa-7 nằm trong số các giống có triển vọng đã đợc chúng tôi xác định ở trên là: 10057 và 10350. Hai giống này có thể đa đi khảo nghiệm khu vực hoá, hoặc sử dụng làm nguồn vật liệu tốt cho các nhà chọn tạo giống chống bệnh bạc lá lúa. 4. Kết luận Dùng phơng pháp PCR để phát hiện gen chống bệnh hữu hiệu xa-5 và Xa-7 có độ chính xác cao, kết quả lây nhiễm nhân tạo phù hợp với kết quả phát hiện gen bằng PCR, không có hiện tợng tái tổ hợp xẩy ra. Điều tra 120 giống lúa địa phơng bằng PCR, phát hiện có 8 giống chứa gen Xa-7 các giống này đều kháng tất cả 6 chủng, 8 giống khác tuy kháng đợc tất cả các chủng tơng tự nh IRBB7 nhng bằng PCR không phát hiện thấy có chứa gen Xa-7, các giống này có thể chứa gen hữu hiệu khác xa-5 và Xa-21 hoặc xẩy ra tái tổ hợp, cần phải nghiên cứu tiếp theo. Các giống lúa địa phơng Việt Nam chứa nguồn gen chống bệnh hữu hiệu rất phong sử dụng trong chơng trình chọn tạo giống chống bệnh. Tài liệu tham khảo Khush GS. Bacalangco, E. Ogawa T. (1991). RGN 7: 121 122. Phan Huu Ton (2000). Application ò PCR-based markers to identify rice bacterial blight resistance genes, xa-5, Xa-13 and Xa-21 in Vietnamese germplasm collection. Tap ch KH Nông nghiệp (1) 9/2000, tr. 59 66. Naruto Furuya, Satoru Taura, Bui Trong Thuy, Masaru Matsumoto, Seint San Aye and Phan Huu Ton (2002). Isolation and Preervation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae from Vietnam in 2001 - 2002. . Nghiên cứu phát hiện nguồn gen kháng bệnh bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa Detection of bacterial leaf blight resistance genes for rice breeding Phan. 1. Đặt vấn đề Muốn chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá thành công thì việc có nguồn gen kháng phong phú đóng vai trò quan trọng. Để phát hiện nguồn gen kháng có nhiều phơng pháp khác. phơng pháp nhân gen PCR để phát hiện gen kháng và khẳng định tính chính xác và khả năng ứng dụng của phơng pháp này trong chọn tạo giống kháng bệnh. 2. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu Ph ơng