T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2 ( 46 ) Tập 2 / N¨m 2008 75 NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC THỰC VẬT CÂY CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA PHYLLANTHUS URINARIA L. MỌC HOANG TẠI THÁI NGUYÊN Ngô Đức Trọng - Phạm Văn Thỉnh (Trường ĐH Sư phạm - ĐH Thái Nguyên) 1. Đặt vấn đề Các loài thực vật thuộc chi Phyllanthus L. họ Thầu dầu phân bố hầu hết ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam có 44 loài, các loài được chú ý nhiều hơn cả là P. niruri L (chó đẻ thân xanh), P. amarus Schum (chó đẻ đắng = diệp hạ châu đắng), P. urinaria L. (chó đẻ răng cưa). Trên thế giới các loài này đã được Y học cổ truyền sử dụng từ lâu để chữa bệnh gan, bệnh thận, bệnh tiểu đường vv… [1-5]. Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) trong y học dân tộc được nhân dân dùng để chữa viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, chàm má, tưa lưỡi, rắn rết cắn, liều lượng không hạn chế [3,4]. Về mặt hoá học thực vật, từ cây chó đẻ răng cưa đã phân lập được một số chất có tác dụng sinh học cao như các flavonoit, các steroit, các tanin, các glycozit, gần đây người ta đã phân lập được 4 lignan mới có tác dụng chữa bệnh từ cây chó đẻ răng cưa Đài Loan. Ở Việt Nam, cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh từ lâu, nhưng các nghiên cứu hoá học thực vật thì mới chỉ bắt đầu từ vài năm gần đây, vì vậy chúng tôi chọn cây chó đẻ răng cưa mọc hoang tại huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên làm đối tượng nghiên cứu với mục đích hiểu rõ và tìm kiếm thêm các ứng dụng làm thuốc chữa bệnh của cây này tại địa phương. 2- Nguyên liệu và phương pháp. Nguyên liệu và điều chế các phần chiết. Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) được thu hái tại vùng giáp danh của huyện Đồng Hỷ với thành phố Thái Nguyên vào tháng 11 năm 2007. Mẫu cây được nhận dạng tại khoa Sinh trường ĐH Sư phạm thuộc ĐHTN. Mẫu cây gồm toàn bộ lá và thân (phần ở trên mặt đất), sau khi làm sạch được sấy khô ở nhiệt độ 60 o C đến khối lượng không đổi và nghiền thành bột. Mẫu thực vật được chiết bằng etanol 90 0 . Các dịch chiết được gom lại, cất đuổi bớt dung môi ở áp suất thấp, chiết lần lượt bằng n- hexan, etylaxetat, n-butanol. Các dung dịch n-hexan, etylaxetat và n- butanol thu được tiếp tục cất loại bỏ dung môi dưới áp suất thấp cho đến khi thu được ở dạng cao khô. Thiết bị tách và phân tích cấu trúc: Để phân lập các chất sử dụng phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ là silicagel Merck: 63- 200 nm, rửa giải bằng các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau. Để phân tích cấu trúc nhờ các phương pháp phổ UV, FT-IR, 1 H-NMR, 13 C-NMR, phổ DEPS, phổ COSY, phổ EI-MS. 3- Kết quả và thảo luận: 3.1- Phân tích định tính: Trên cơ sở dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [2] chúng tôi thu được kết quả thử định tính với các nhóm ch ất, kết quả ấy được chỉ ra ở bảng 1: T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2 ( 46 ) Tập 2 / N¨m 2008 76 Bảng 1: Phát hiện các nhóm chất trong cây chó đẻ răng cưa. STT Nhóm chất Thuốc thử đặc hiệu Hiện tượng Kết quả 1 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch ++ 2 Ancaloit Dragendorf Màu vàng da cam + 3 Steroit Liberman-Bourchard Màu xanh vàng ++ 4 Flavonoit Xianidin Từ hồng đến đỏ ++ 5 Polyfenol FeCl 3 Xanh thẫm +++ 6 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông ++ 7 Glycozit tim Kelle-Kiliani Không có hiện tượng gì - 8 Saponin Tạo bọt Bọt bền trong axit ++ Ghi chú: Dấu (+): Phản ứng dương tính, (++): Phản ứng dương tính rất rõ; (-): Không có. Như vậy có thể nhận thấy trong thực vật chó đẻ răng cưa có chứa ít nhất 7 nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học cao. 3.2- Các chất tinh khiết được phân lập. Chất PU-1: Từ cặn n-hexan, tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột với chất hấp thụ silicagel rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan – etylaxetat (9:1) thu được chất rắn kết tinh có nhiệt độ nóng chảy ở 139-141 0 C, R f =0,72 (trong hệ dung môi n-hexan – CHCl 3 85:15). Kí hiệu là PU-1. Bảng 2: Phổ 13 C-NMR của chất PU-1 và β-Sitosterol Ch ấ t PU - 1 β - Sitosterol [6] Ch ấ t PU - 1 β - Sitosterol [6] Vị trí C δ của 13 C (ppm) Vị trí C δ của 13 C (ppm) Vị trí C δ của 13 C (ppm) Vị trí C δ của 13 C (ppm) 1 37,2 1 37,2 16 28,3 16 28,2 2 31,7 2 31,6 17 56,2 17 56,1 3 71,8 3 71,7 18 11,9 18 11,9 4 42,3 4 42,3 19 19,4 19 19,4 5 140,8 5 140,7 20 36,2 20 36,1 6 121,7 6 121,7 21 18,8 21 18,9 7 31,9 7 31,9 22 33,9 22 34,0 8 31,9 8 31,9 23 26,1 23 26,1 9 50,1 9 50,1 24 45,8 24 45,8 10 36,5 10 36,5 25 29,2 25 29,2 11 21,1 11 21,2 26 19,1 26 19,8 12 39,8 12 39,8 27 19,4 27 19,5 13 42,3 13 42,3 28 23,1 28 23,08 14 56,8 14 56,7 29 11,9 29 12,0 15 24,3 15 24,3 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 13 12 17 16 21 22 24 28 29 26 27 19 18 HO 11 14 15 20 23 25 β-Sitosterol T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2 ( 46 ) Tập 2 / N¨m 2008 77 Chất PU-2 được tách từ cặn etylaxetat có R f = 0,8 (trong hệ dung môi clorofoc – etylaxetat (9:1). Nó là chất dầu sệt màu nâu. Phổ EI-MS cho biết chất PU-2 có pic M + = 126 suy ra khối lượng phân tử của PU-2 bằng 126 amu. Phổ IR và phổ NMR đều chỉ ra trong phân tử có nhóm cacbonyl ν max = 1700 cm -1 và độ chuyển dịch hoá học (cdhh) của cacbon cacbonyl: δ C- 1 =177,91 ppm và của hiđro liên kết với cacbon cacbonyl δ H =9,54ppm; Có các dao động đặc trưng cho dị vòng ở vùng 1620 cm -1 . Các nguyên tử cacbon chứa nhóm olefin và các nguyên tử hidro có độ cdhh tương ứng như sau: δ C-3 =124,31ppm và độ cdhh của hidro trong nhóm =CH với δ H = 7,48ppm (1H,d, J=3,7Hz); δ C-4 =109,62ppm, δ H = 6,60ppm (1H,d, J=3,6 Hz). Phổ DEPT cho thấy chất PU-2 có 2 nguyên tử cacbon bậc 4 với các độ cdhh bằng δ C-2 =162,14 ppm và δ C- 5 =151,70 ppm đó cũng là các nguyên tử cacbon tham gia tạo liên kết đôi; có một nhóm CH 2 với δ C-6 =55,89 ppm và độ cdhh của hidro trong nhóm CH 2 với δ H = 4,70 ppm, có 1 nhóm hydroxyl với vân rộng ν= 3280 cm -1 . (Phổ NMR của chất PU-2 xem bảng 3). Bảng 3: Phổ cộng hưởng từ 1 H-NMR và 13 C-NMR của các U2 và U3. Phổ NMR của U2 (ppm) Phổ NMR của U3(ppm) Vị trí cacbon 13 C-NMR 1 H-NMR Vị trí cacbon 13 C-NMR 1 H-NMR 1 177,91 9,54 1 120,48 - 2 162,13 - 2 108,73 7,09 3 124,33 7,48 3 145,40 - 4 109,62 6,60 4 137,98 - 5 151,70 - 5 145,40 - 6 55,89 4,50 6 108,73 7,09 - - - 7 167,46 - Từ các thông tin chỉ ra nhờ phổ IR, NMR, DEPT và EI-MS có thể quy kết được chất PU- 2 là 5- hydroxymetylfufural C 6 H 6 O 3 . Hiện nay chất 5- hidroxyfufural đã được phân lập từ một số cây thuốc dân gian khác như từ cây Địa hoàng, cây Trinh nữ hoàng cung nó có vai trò trong quá trình chuyển hoá chất trong cơ thể sinh vật, còn trong cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) lần đầu tiên được phân lập và nhận dạng cấu trúc phân tử. Chất PU-3 cũng được tách từ cặn etylaxetat, là chất rắn kết tinh, tinh thể hình kim màu vàng có nhiệt độ nóng chảy ở 249-250 o C. Phổ IR cho các vân hấp thụ đặc trưng cho nhóm cacboxyl ν = 1700 cm -1 , vân rất tù ở số sóng ν=2900-3300 cm -1 đặc trưng cho các nhóm OH của fenol. Phổ 1 H-NMR cho tín hiệu 7,09 ppm ứng với 2 proton ở các vị trí C-2 và C-6. Phổ 13 C- NMR cho thấy các độ cdhh ở các tín hiệu δ C-1 =120,48 ppm, δ C-2 = δ C-6 = 108,73 ppm, δ C-3 =δ C- 5 =145,40 ppm, δ C-4 =137,98 ppm và δ C-7 =167,46 ppm (số liệu về phổ NMR được chỉ ra ở bảng 3). Những dữ liệu về phổ của chất PU-3 hoàn toàn phù hợp với phổ của axit galic. Như vậy chất PU-3 được tách ra từ dịch chiết etylaxetat của cây chó đẻ răng cưa được nhận dạng là axit galic. Có thể coi đây là một đơn phân để tham gia vào việc tạo ra các tanin thuỷ phân và tham gia vào các chuyển hoá khác tạo ra các lignan trong cây chó đẻ răng cưa. 1 COOH OH HO OH O C H H 2 C HO O 1 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 7 Hidroxymetylfufural. Axit galic T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2 ( 46 ) Tập 2 / N¨m 2008 78 Chất PU-4. Từ cặn etylaxetat ngoài các chất PU-2 và PU-3 trình bày ở trên chúng tôi còn thu được một hỗn hợp có màu vàng, cho màu đỏ cam với phản ứng xianiđin, màu xanh đen với dung dịch FeCl 3 1% điều đó nói lên trong hỗn hợp này có flavonoit. Bằng phương pháp sắc kí cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi Toluen: Etylaxetat: Axitfomic (5:4:1) thu được 29mg chất rắn màu vàng (có R f =40 trong hệ dung môi trên), nóng chảy ở 276-278 o C. Phổ khối lượng EI-MS cho pic ion phân tử ở m/z =286 ứng với công thức C 15 H 10 O 6 . Phổ IR cho vân hấp thụ đặc trưng cho nhóm OH ở 3640 cm -1 , nhóm cacbonyl 1680 cm -1 và nối đôi ở 1600cm -1 Phổ UV của chất PU-4 có cực đại hấp thụ có λmax ở 265 nm và 365 nm phù hợp với các hợp chất flavonoit có nối đôi ở vị trí C 2 - C 3 . Các phổ IR và UV hoàn toàn phù hợp với các dữ kiện phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR trên bảng 4. Các tín hiệu δ=176,58 ppm là của cacbon cacbonyl ở C-4, δ= 147,03 ppm đặc trưng cho C-2 và δ=136,52 ppm là tín hiệu của C-3, đó là những nguyên tử cacbon chứa liên kết đôi nhưng C-2 liên kết với oxi ở vị trí số 1 còn C-3 liên kết với nhóm OH và nhóm C=O. Tín hiệu δ=157,78 ppm và 164,98 ppm tương ứng với độ chuyển dịch hoá học của C-5 và C-7 vòng A, còn δ=160,16 ppm là tín hiệu 13 C-NMR của C- 4 / của vòng B, 3 nhóm hiđroxyl còn lại sẽ liên kết vào các vị trí 5,7,4 / của vòng A và B. Tín hiệu cộng hưởng proton tại 8,15 ppm (dd, J=8,2 và 2,2) là của H-2 / và H-6 / và 7,01 ppm (dd, J=8,2 và 2,2) là tính hiệu của H-3 / và H-5 / , kết hợp với các thông tin phổ 13 C-NMR có thể khẳng định vòng B có 1 nhóm OH ở vị trí 4 / . Tín hiệu cộng hưởng ở 6,26 ppm (1H,d,J=2,1) và 6,52 ppm (1H,d,J=2,1) là tín hiệu của proton ở C-6 và C-8. Từ tất cả các thông tin về phổ EI-MS, NMR, IR, UV và các hằng số vật lý có thể quy kết chất PU-4 là Kampherol, chất có tác dụng sinh học quan trọng. Bảng 4: Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất PU-4 Vị trí cacbon 13 C-NMR (δ- ppm) 1 H-NMR (δ-ppm, J-Hz) Vị trí cacbon 13 C-NMR (δ-ppm) 1 H-NMR (δ-ppm, J-Hz) 2 147,03 10 104,15 3 136,52 1 / 123,32 4 176,58 2 / 130,44 8,15 (1H,dd, J=8,2; 2,2) 5 157,78 3 / 116,32 7,01(1H,dd, J=8,2;2,2) 6 99,17 6,26 (1H, d, J=2,1) 4 / 160,16 7 164,98 5 / 116,32 7,01(1H,dd, J=8,2; 2,2) 8 94,49 6,52 (1H, d, J=2,1) 6 / 130,44 8,15 (1H,dd, J=8,2; 2,2) 9 162,30 O O OH OH HO OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1/ 2/ 3/ 4/ 5/ 6/ Kampherol hay 3,5,7,4 / -tetrahidroxi flavon T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2 ( 46 ) Tập 2 / N¨m 2008 79 4. Kết luận Từ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa Phyllathus urinaria bằng các phản ứng định tính đã phát hiện có chứa các nhóm chất có hoạt tính sinh lý cao là đường khử, ancanloit, saponin, steroit, flavonoit, cumarin và các chất polyphenol khác. Đã phân lập và sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại xác định được cấu trúc của 4 chất có hoạt tính sinh học cao trong cây chó đẻ răng cưa: β-sitosterol, hidroxymetylfufural, axit galic và kampherol. Summary Chemical studies on the constituents of Phyllanthus urinaria L. growing wildly in Thai Nguyen province The n-hexan extract of the plant Phyllathus urinaria was isolatete β-sitosterol, and the ethylacetate extract of the plant Phyllathus urinaria were isolated 5-hidroxyfufural and acid gallic and kampherol. Tài liệu tham khảo [1]- Nguyễn Phương Dung và các cộng sự Tạp chí Y học thực hành 1996, số 11, tr.12-14. [2]- Nguyễn Văn Đàn (1997), Các phương pháp nghiên cứu cây thuốc, Nxb Y- Dược, TP Hồ Chí Minh [3]- Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam (1999). Nxb Y học Hà Nội. [4]- Đỗ Huy Bích và các cộng sự (2004), Cây thuốc và các động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nxb KH&KT Hà Nội . [5]- Syamasundar và các cộng sự. J. Ethnopharmacol. 1985, 14 (1). 41-44. [6]- Goat J.L., Akihisa T. Analysis of steroit frest ed., p.324. Chapman & Hall. London. NewYork- Tokyo- 1997. . 75 NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC THỰC VẬT CÂY CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA PHYLLANTHUS URINARIA L. MỌC HOANG TẠI THÁI NGUYÊN Ngô Đức Trọng - Phạm Văn Thỉnh (Trường ĐH Sư phạm - ĐH Thái Nguyên) 1. Đặt vấn đề Các loài. đã phân l p được 4 lignan mới có tác dụng chữa bệnh từ cây chó đẻ răng cưa Đài Loan. Ở Việt Nam, cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L. ) đã được sử dụng l m thuốc chữa bệnh từ l u, nhưng. nhưng các nghiên cứu hoá học thực vật thì mới chỉ bắt đầu từ vài năm gần đây, vì vậy chúng tôi chọn cây chó đẻ răng cưa mọc hoang tại huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên l m đối tượng nghiên cứu với