Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 138 ẢNH HƢỞNG CỦA NƢỚC DỪA GIÀ TỚI QUÁ TRÌNH PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA PHÔI VÔ TÍNH LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS AMABILIS) Trịnh Thị Lan Anh (1) , Dương Tấn Nhựt (2) (1) Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. HCM; (2) Viện Sinh Học Tây Nguyên ABSTRACT Phalaenopsis amabilis is one of many commercial valuable orchids as cut flowers and potted plants with great economic importance all over the world which rely on their colors, species and specific characteristics. Considerable difficulties have been encountered in the clonal propagation of this orchid due to the characteristics ununiform and the limitted plantlets number. This study was performed in order to establish embryogenic morphological of Phalaenopsis amabilis. The in vitro leaves emerging from the flower stalk nodes were used for protocorm-like bodies (PLBs) induction. These PLBs were used for the embryos induction. The embryos were used as the sample to study morphological of Phalaenopsis amabilis. About 1360 mg embryos (1335.4 embryos), 3050 mg PLBs (311.9 PLBs) and 2650 mg shoots (50.9 shoots) were harvested from 100 mg embryos on 30 ml MS medium supplemented with 2 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, 30% (v/v) old coconut water, 1 g/l activated charcoal, 30 g/l sucrose and 9 g/l agar after 12 culture weeks of. Results indicated that old coconut water 30% (v/v) is suitable for embryogenesis, PLBs and shoot development, conversely. Keywords: nước dừa già, nước dừa non, Phalaenopsis amabilis, phát sinh hình thái, PLB (Protocorm-like body), tăng sinh phôi. MỞ ĐẦU Trong nuôi cấy in vitro thực vật từ năm 1941, nƣớc dừa đã đƣợc sử dụng để nuôi cấy phôi Datura metel L. và năm 1949 nuôi cấy mô Daucus carota. Các nghiên cứu sau đó trên hoa lan cho thấy nƣớc dừa rất thích hợp cho đối tƣợng này. Nƣớc dừa đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy mô lan giúp phôi tăng trƣởng và nảy mầm (Hegarty,1955; Niimoto and Sagawa, 1961). Theo kết quả phân tích thành phần nƣớc dừa của Tulecke và cộng sự trong nƣớc dừa có các amino acid, acid hữu cơ, đƣờng sucrose, glucose, fructose…, các hợp chất có hoạt tính auxin, cytokinin dạng glycoside với thành phần và hàm lƣợng rất cân đối. Trong đó hàm lƣợng các chất này có trong nƣớc dừa non cao hơn so với nƣớc dừa già. Do đó, từ trƣớc đến nay nƣớc dừa non thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô lan. Tuy nhiên, giá thành của nƣớc dừa non thƣờng cao gấp nhiều lần so với nƣớc dừa già, do vậy chí phí giá thành cây giống nuôi cấy in vitro cao hơn. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nƣớc dừa già, xác định nồng độ thích hợp nhất cho việc nhân nhanh phôi vô tính, PLB và cây con lan Hồ điệp nhằm làm giảm giá thành sản xuất cây giống, tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính với quy mô lớn. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Vật liệu Đối tƣợng nghiên cứu là cây P. amabilis. Phát hoa của các cây trƣởng thành 5 – 6 tuổi, khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh, cho hoa đẹp trồng trong nhà kính. Chọn những phát hoa không già, khi hoa chƣa nở. Chọn các phần phát hoa mang chồi, khoảng nốt thứ ba từ dƣới lên, hai nốt phần gốc thƣờng không tạo chồi đƣợc bỏ đi, phần phía trên mang hoa cũng không sử dụng đƣợc. Phần phát hoa sử dụng làm nguồn mẫu cấy ban đầu thƣờng chỉ mang từ 4 – 6 nốt. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 139 Hình 1. Nguồn vật liệu phôi vô tính lan Hồ điệp đƣợc sử dụng cho thí nghiệm nuôi cấy. Lá thu đƣợc sau hai tháng nuôi cấy phát hoa đƣợc dùng làm nguyên liệu để tái sinh PLB. Các lá (dài 2 cm) của các chồi in vitro này đƣợc cắt thành 6 mảnh. Cách cắt mẫu nhƣ sau: tiến hành cắt một đƣờng giữa gân lá chia lá thành hai phần theo chiều dọc. Tiếp tục cắt theo chiều ngang vuông góc với gân lá tạo các lát cắt hình vuông. Mẫu cấy đƣợc cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 10 mg/l BA; 30 g/l sucrose; 20% (v/v) nƣớc dừa non; 9 g/l agar. Các PLB tái sinh từ mô lá in vitro đƣợc cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung 0,1 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 20% (v/v) nƣớc dừa non; 30 g/l sucrose; 1 g/l than hoạt tính; 9 g/l agar cho sự tái sinh mô sẹo. Cấy chuyền các mô sẹo này sang môi trƣờng MS có bổ sung 2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 20% (v/v) nƣớc dừa non; 1 g/l than hoạt tính; 9 g/l agar cho sự phát sinh phôi vô tính (Dƣơng Tấn Nhựt và cộng sự., 2009). Các phôi thu đƣợc có dạng xốp, màu vàng nhạt đƣợc dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm trong nghiên cứu này (Hình 1). Phƣơng pháp Môi trường nuôi cấy Trong các nghiệm thức thí nghiệm, môi trƣờng căn bản đƣợc sử dụng là môi trƣờng MS (Murashige and Skoog, 1962). Ngoài môi trƣờng nuôi cấy khoáng đa lƣợng, vi lƣợng và vitamin còn bổ sung thêm các thành phần sau: 0,5 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 30 g/l sucrose; 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; pH = 5,8 đƣợc hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 o C, 1 atm trong 25 phút. Tùy từng thí nghiệm, nƣớc dừa già sẽ đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau. Bố trí thí nghiệm Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nƣớc dừa già (nƣớc dừa đƣợc lấy từ những quả dừa có cơm dày khoảng 0,5 - 1 cm) đến khả năng phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp. Các mẫu phôi có trọng lƣợng tƣơi trung bình 0,1 g và chứa khoảng 158,9 phôi/mẫu cấy đƣợc cấy vào các bình có chứa 30 ml môi trƣờng MS bổ sung nƣớc dừa già với nồng độ khác nhau (v/v) kết hợp với 0,5 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 30 g/l sucrose, 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính. Điều kiện nuôi cấy - Thời gian chiếu sáng : 10 giờ/ngày - Cƣờng độ ánh sáng : 2.500 – 3.000 lux - Nhiệt độ : 25 ± 2 o C - Độ ẩm trung bình : 75 – 80% KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hƣởng của nƣớc dừa già lên sự phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp sau 12 tuần nuôi cấy Sau 12 tuần nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thu nhận kết quả ở các nghiệm thức thí nghiệm và trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa già tới khả năng phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp sau 12 tuần nuôi cấy. NT % nƣớc dừa già (v/v) Phôi PLB Chồi SL TLT (g) SL TLT (g) SL TLT (g) A0 0 – – – – – – A1 10 235,3 0,64 80,2 1,40 6,4 0,13 Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 140 A2 20 405,7 0,92 110,4 1,56 23,2 1,25 A3 30 1335,4 1,36 311,9 3,05 50,9 2,65 A4 40 – – – – – – * Ghi chú: NT: Nghiệm thức, TLT: Trọng lƣợng tƣơi, SL: Số lƣợng, – : không có Ở nghiệm thức A0 (đối chứng) và nghiệm thức A (40% nƣớc dừa) chỉ sau 4 tuần nuôi cấy mẫu cấy bắt đầu vàng dần, tăng trƣởng kém, một số mẫu hóa nâu rồi chết. Ở các nghiệm thức A1 (10% nƣớc dừa), nghiệm thức A2 (20% nƣớc dừa), nghiệm thức A3 (30% nƣớc dừa) mẫu cấy tăng trƣởng tốt. Hầu hết các phôi không bị hóa nâu, tốc độ tăng sinh tỷ lệ thuận với thời gian nuôi cấy. Thời gian đầu sau khi nuôi cấy phôi tăng sinh chậm, đến tuần thứ 4 tốc độ tăng sinh bắt đầu gia tăng và đến tuần thứ 8 phôi tiếp tục tăng sinh mạnh, một số các phôi xuất hiện trƣớc (các phôi nằm phía trên) bắt đầu biệt hóa tạo cấu trúc PLB, các PLB gia tăng kích thƣớc và khối lƣợng và phát triển thành cây con hoàn chỉnh. Còn các phôi mới tiếp tục đƣợc tạo ra thƣờng là phần mẫu cấy tiếp xúc với môi trƣờng thạch. Đến thời điểm này trên các mẫu cấy đã có sự khác biệt rõ rệt về hình thái và cấu trúc. Đến tuần thứ 12, mẫu cấy xuất hiện cả ba dạng cấu trúc là: phôi, PLB và chồi với số lƣợng lớn. Đặc biệt, kết quả thí nghiệm cho thấy việc bổ sung 30% nƣớc dừa già (v/v) cho hệ số nhân giống cao nhất, với số lƣơng phôi sau 12 tuần nuôi cấy nhiều gấp 8,4 lần so với mẫu cấy ban đầu, tạo ra 311,4 PLB/mẫu cấy và 50,9 chồi/mẫu cấy. Nƣớc dừa là dạng phôi nhũ lỏng có chứa nhiều thành phần có nồng độ khác nhau, ngƣời ta đã chứng minh đƣợc trong nƣớc dừa có chứa zeatin (Letham, 1974). Cấu trúc của zeatin gần giống với kinetin nhƣng hoạt tính cao hơn khoảng 10 lần. Zeatin có trong nƣớc dừa là một loại cytokinin, chất này làm tăng hoạt động phân chia tế bào trong điều kiện có auxin, giúp gia tăng kích thƣớc tế bào và tổng hợp protein. Đồng thời trong nƣớc dừa có chứa nhiều thành phần dinh dƣỡng chƣa xác định, các thành phần dinh dƣỡng bổ sung này sẽ giúp thúc đẩy sự tăng trƣởng của tế bào. Theo phân tích thành phần dinh dƣỡng của tổ chức y tế thế giới (WHO) thì trong nƣớc dừa có chứa protein, hydratecarbon, calcium, sắt và một số vitamine nhƣ thiamine, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đƣờng. Mặc dù protein trong nƣớc dừa đã bị loại bỏ do sự kết tủa trong quá trình lƣu giữ lâu dài, nhƣng các thành phần đa dạng khác của nƣớc dừa đã cho thấy vai trò quan trọng của chúng trong việc kích thích sự tăng trƣởng và nhân số lƣợng tế bào. Theo Vũ Văn Vụ (1993), nƣớc dừa có chứa khá nhiều hợp chất nitrogen dạng khử nhƣ các acid amine, ngoài ra trong nƣớc dừa còn chứa các hormone sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinine. Trong nghiên cứu này, việc bổ sung nƣớc dừa đã làm thay đổi nồng độ và loại cytokinin trong môi trƣờng nuôi cấy. Bổ sung nƣớc dừa kích thích phôi tăng sinh, tạo nhiều phôi mới, các phôi xuất hiện trƣớc sẽ định hƣớng phát triển thành PLB, các PLB gia tăng kích thƣớc và có màu đậm dần sau đó phát triển thành chồi. Nghiên cứu này cho thấy nƣớc dừa già cũng có tác dụng tích cực lên quá trình phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp. Khi bổ sung nƣớc dừa già với các nồng độ từ 10 đến 30% (v/v), thì khả năng tăng sinh phôi, khả năng biệt hóa thành PLB và khả năng phát triển chồi của mẫu cấy tăng dần (hình 2). Trong đó, nồng độ nƣớc dừa già là 30% (v/v) cho kết quả tăng sinh phôi, biệt hóa PLB và phát triển chồi tối ƣu nhất, kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ nghiên cứu về sự tăng sinh phôi lan Hồ điệp của Trịnh Thị Hƣơng và cộng sự (2009). Tuy nhiên khi tăng nồng độ nƣớc dừa già lên 40% (v/v) thì kết quả lại ngƣợc lại, mẫu cấy kém phát triển ngay từ giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, sau đó mẫu cấy hóa nâu và chết dần. Điều này cho thấy khi gia tăng nồng độ nƣớc dừa đồng nghĩa với việc tăng thêm các hormone sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinine lên cao vƣợt quá nhu cầu cần thiết của phôi không thích hợp cho mẫu cấy phát triển, thậm chí còn gây tác dụng xấu lên mẫu cấy khiến mẫu cấy hóa nâu và chết dần. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 141 Hình 2. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa già lên khả năng phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp sau 12 tuần nuôi cấy [A0, A1, A2, A3, A4 tƣơng ứng với nồng độ nƣớc dừa già là 0%; 10%; 20%; 30%; 40% (v/v)]. Trong nuôi cấy mô lan, nƣớc dừa rất thích hợp là nguồn dinh dƣỡng dồi dào, cung cấp đạm và carbohydrate (sucrose, glucose, fructose,…). Ngoài ra, nƣớc dừa còn chứa một số chất điều hòa sinh trƣởng, đƣợc biết đến nhiều nhất là zeatin (Arditti, 1992). Các nghiên cứu về nuôi cấy mô lan cho thấy mô cấy tăng sinh nhanh trên môi trƣờng bổ sung nƣớc dừa. Ở quả dừa non hàm lƣợng các chất có hoạt tính sinh học trong nƣớc dừa non hơn cao hơn so với trong nƣớc của quả dừa già. Do vậy, khi nuôi cấy mô lan thƣờng sử dụng nƣớc dừa non để bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên, mục tiêu của nhân giống vô tính, ngoài gia tăng hệ số nhân giống, cây giống đồng nhất về mặt di truyền có chất lƣợng cao, thì giá thành cũng là điều đáng quan tâm. Vì thế, trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng nƣớc dừa già cũng thích hợp cho nuôi cấy mô lan từ đó có thể sử dụng nƣớc dừa già thay thế cho nƣớc dừa non nhằm giảm chi phí sản xuất cây giống in vitro. KẾT LUẬN Sau 12 tuần nuôi cấy phôi lan Hồ điệp trên môi trƣờng MS có bổ sung 2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 30 g/l surose, nếu bổ sung từ 10% đến 30% nƣớc dừa (v/v) thì mẫu cấy phôi tăng sinh, biệt hóa PLB và phát triển chồi, trong đó, việc bổ sung 30% (v/v) nƣớc dừa già ở nghiệm thức A3 cho kết quả tăng sinh phôi, biệt hóa PLB và phát triển chồi tối ƣu nhất. Các phôi này dạng xốp có màu vàng nhạt, thƣờng xuất hiện ở phần mẫu cấy tiếp xúc với môi trƣờng thạch, các PLB và chồi nằm phía trên của mẫu cấy. TÀI LIỆU THAM KHẢO Arditti (1992) Fundamentals of orchid biology – Jonh Wiley and Sons Inc. New York, U.S.A. Dƣơng Tấn Nhựt, Hồng Ngọc Trâm, Nguyễn Phúc Huy và Đinh Văn Khiêm, 2009. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa và sucrose lên sự tăng sinh mô sẹo và sự hình thành phôi vô tính ở loài lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis). Tạp chí Sinh học, 31(1), p. 77-84. Hegarty C.P. (1955) Observation on the germination of the orchid seed, Arm. Orchid. Soc. Bull, 24, p. 457-464. Letham D.S. (1974) Regulation of cell division in plant tissue. XX. The cytokinin of coconut-milk. Physiol. Plant, 27: 66-70. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 142 Murashige T. and Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant, 15, p. 473-497. Niimoto D.H. and Sagawa Y. (1961) Ovule development in Dendrobium, Arm. Orch. Soc. Bull, 49, p. 372-373. Trịnh Thị Hƣơng, Trịnh Thị Lan Anh, Huỳnh Kim Thùy My, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Thuý Hằng, Nguyễn Minh Nhật, Đặng Xuân Thành, Dƣơng Tấn Nhựt. Ảnh hƣởng của một số dịch chiết có nguồn gốc thực vật và thời gian cấy chuyền tới quá trình nhân nhanh phôi vô tính lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.), (2009) Hội nghị CNSH toàn quốc – khu vực phía Nam năm 2009. Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lý thực vật ứng dụng. NXB Giáo Dục. . trường và Công nghệ sinh học năm 2011 138 ẢNH HƢỞNG CỦA NƢỚC DỪA GIÀ TỚI QUÁ TRÌNH PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA PHÔI VÔ TÍNH LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS AMABILIS) Trịnh Thị Lan Anh (1) , Dương. trong bảng 1. Bảng 1. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa già tới khả năng phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp sau 12 tuần nuôi cấy. NT % nƣớc dừa già (v/v) Phôi PLB Chồi SL TLT (g) SL TLT. đậm dần sau đó phát triển thành chồi. Nghiên cứu này cho thấy nƣớc dừa già cũng có tác dụng tích cực lên quá trình phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp. Khi bổ sung nƣớc dừa già với các nồng