T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 1 NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG LÚA DT22 VÀ KHANG DÂN ĐỘT BIẾN (KDĐB) PHỤC VỤ CHO KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Phí Công guyên, guyễn Thuý Điệp, Kiều Thị Dung, Trần Minh Hoa, Trần Duy Dương, Đặng Trọng Lương SUMMARY Study on the plant regeneration of DT22 and mutant Khang dan (KDĐB) rice cultivars from matured embryo calli for rice transformation Two rice cultivars DT22 and KDĐB were used to induce calli and plant regeneration from matured embryo calli. Callus induction, callus proliferation and regeneration ratio were evaluated on MS (Murashige Skoog, 1962) and 6 (Chu et al, 1978) media supplemented with different concentrations of phytohormon. 6D supplemented with 2 mg/l 2,4D was the most effective on callus induction and callus proliferation of both DT22 and KDĐB cultivars. DT22 cultivar was highest regenerated on MS medium supplemented with 2 mg/l BAP (BL2 medium). Regeneration ratio equal to 74.1% and regenerated shoot were healthy and uniform. Healthy and uniform shoot were induced as 72.6% of regeneration ratio on MS medium supplemented with 2 mg/l BAP and 0.1 mg/l AA (A4 medium). Keywords: Rice, Callus, Plant regeneration. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Đã có rất nhiều loại mô khác nhau được dùng trong nghiên cứu tái sinh ở lúa (Bhaskaran và Smith, 1988). Tuy nhiên, các mô phôi thường được ứng dụng nhiều trong nuôi cấy in vitro nhờ có khả năng tái sinh cao của các callus được tạo thành (Maggioni và cs., 1989). Sự tái sinh từ callus đạt được từ rất lâu đối với các giống thuộc Japonica spp. (Nishi và cs., 1973). Tiềm năng tạo thành callus và sự tái sinh đã được nhiều báo cáo nhắc đến như một đặc điểm khác biệt và hiệu quả tái sinh ở các giống lúa Indica vẫn gặp những vấn đề khó khăn do đặc tính di truyền của chúng (Toki, 1997). Do vậy, các chiến lược nhằm cải thiện hiệu quả tái sinh ở lúa được tiến hành nhiều trong những thập kỷ qua (Kyozuka và cs., 1988; Raman và cs., 1999). Các giống lúa Japonica thường có khả năng tái sinh cao trong khi đó sự thành công của các giống lúa Indica vẫn còn hạn chế, đặc biệt là đối với nhóm 1 (Kyozuka và cs., 1988; Raman và cs., 1994). Khả năng tái sinh liên quan nhiều đến hiệu quả biến nạp. Vì vậy, để nâng cao hiệu quả của quá trình biến nạp gen vào lúa, chúng tôi tiến hành: “ghiên cứu tái sinh giống lúa DT22 và Khang dân đột biến (KDĐB) phục vụ cho kỹ thuật chuyển gen”. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 2 II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Giống lúa DT22 và giống lúa Khang dân đột biến (KDĐB) có nguồn gốc và xuất xứ từ Viện Di truyền Nông nghiệp. Nuôi cấy mô tái sinh sử dụng môi trường cơ bản MS (Murashige Skoog, 1962) và môi trường N6 (Chu và cs., 1978) bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng ở nồng độ khác nhau. 2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy mô tạo callus và tái sinh cây sử dụng phôi trưởng thành được kết hợp từ phương pháp của IRRI và phòng thí nghiệm Chọn giống cây trồng, Đại học Kyushu, Nhật Bản. 2.1. Khử trùng mẫu Sử dụng 2 hóa chất khử trùng hạt khác nhau là HgCl 2 1‰ trong 10 phút và NaClO 10% trong 2 lần x 20 phút. 2.2. Phát sinh và nhân callus - Môi trường N6D: N6 + 2 mg/l 2,4D + 3000 mg/l proline + 300 mg/l Casein + 3% đường + 0,3% phytagel). - Sau 10 ngày các callus được tách ra và chuyển vào các môi trường sau: + LD: Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) bổ sung 3% đường, 0,3% phytagel, 100 ml/l nước dừa và các loại vitamin, casein, + N6D: Môi trường N6 (Chu, 1978) bổ sung 3% đường, 0,3% phytagel và các loại vitamin, nước dừa, casesin, Công thức thí nghiệm 2,4D (mg/ml) Casein (mg/ml) Thiamin (mg/ml) Tryptophan (mg/ml) Proline (mg/ml) LD1 1,5 300 10 0 0 LD2 2 300 10 0 0 LD3 2 0 0 50 0 LD4 2 300 0 0 3000 LD5 2,5 300 10 0 0 LD6 2,5 0 0 50 0 LD7 2,5 500 0 0 500 LD8 3 300 10 0 0 Công thức thí nghiệm 2,4D (mg/ml) Casein (mg/ml) Tryptophan (mg/ml) Proline (mg/ml) Glutamin (mg/ml) Asparagin (mg/ml) Nước dừa (ml/l) N6D 2 300 0 3000 0 0 0 N6D1 1,5 0 0 0 100 100 100 N6D2 2,5 0 0 0 0 0 100 N6D3 3,0 0 100 0 0 0 0 N6D4 3,5 300 0 3000 0 0 0 2.3. Tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh Callus lúa được nuôi cấy trên môi trường nhân callus sau 4 tuần được cấy chuyển sang môi trường tái sinh và tạo chồi. Công thức thí nghiệm BAP (mg/ml) Kinetin (mg/ml) NAA (mg/ml) Công thức thí nghiệm BAP (mg/ml) Kinetin (mg/ml) NAA (mg/ml) T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 3 A1 2,0 1,0 0,1 BL5 3,5 0 0 A2 2,0 0 0,5 BL6 4,0 0 0 A3 2,5 0 0,5 K1 0 1,0 0 A4 2,0 0 0,1 K2 0 1,5 0 BL1 1,5 0 0 K3 0 2,0 0 BL2 2,0 0 0 K4 0 2,5 0 BL3 2,5 0 0 K5 0 3,0 0 BL4 3,0 0 0 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Kết quả vào mẫu nuôi cấy in vitro Trong thí nghiệm vào mẫu in vitro, chúng tôi sử dụng 2 hóa chất khử trùng hạt khác nhau là HgCl 2 và NaClO và đánh giá 2 chỉ tiêu là mức độ nhiễm và mức độ phát triển callus từ hạt trưởng thành. Kết quả ở Bảng 1 cho thấy phương pháp khử trùng bằng HgCl 2 cho tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với phương pháp khử trùng bằng NaClO (2,0 ± 0,5% ở KDĐB so với 9,0 ± 1,5%; 2,5 ± 0,5% ở DT22 so với 7,0 ± 5,0%) nhưng tỷ lệ tạo callus ở phương pháp này lại thấp hơn so với khi khử trùng bằng NaClO (65,0 ± 2,0% so với 77,0 ± 0,5% ở KDĐB; 74,0 ± 2,0% so với 86,0 ± 1,5% ở DT22. Sử dụng HgCl 2 để khử trùng mẫu cho tỷ lệ nhiễm thấp thích hợp khi thiết lập mẫu in vitro với số lượng mẫu nhỏ. Tuy nhiên, khi sử dụng số lượng mẫu lớn, chúng tôi khuyến cáo nên sử dụng NaClO với mục đích thân thiện hơn với môi trường. Bảng 1. Kết quả vào mẫu in vitro Hóa chất khử trùng KDĐB DT22 Số lượng mẫu Tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ tạo callus Số lượng mẫu Tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ tạo callus HgCl2 500 2,0 ± 0,5% 65,0 ± 2,0% 500 2,5 ± 0,5% 74,0 ± 2,0% NaClO 500 9,0 ± 1,5% 77,0 ± 0,5% 500 7,0 ± 5,0% 86,0 ± 1,5% 2. Đánh giá sự phát sinh và nhân callus Quá trình thiết lập mẫu nuôi cấy in vitro ban đầu sử dụng môi trường N6D (N6D: N6 + 2 mg/l 2,4D + 3000 mg/l proline + 300 mg/l casein + 3% đường + 0,3% phytagel). Môi trường N6 bổ sung 2 mg/l 2,4D thường được sử dụng trong nuôi cấy mô lúa và để tạo callus từ phôi trưởng thành. Tuy nhiên chúng tôi bổ sung thêm casein và proline nhằm tăng cường khả năng tạo callus và sử dụng phytagel thay vì sử dụng agar-agar. Callus được hình thành sau 10 ngày nuôi cấy in vitro được tách ra và tiến hành đánh giá khả năng nhân callus khi sử dụng các môi trường nhân callus khác nhau. Khả năng nhân callus được đánh giá và cho điểm theo thang (+); (++); (+++); (++++), căn cứ vào khả năng nhân callus tăng dần. Bảng 2. Cho điểm và đánh giá khả năng nhân callus trên nền môi trường MS Môi trường Giống LD1 LD2 LD3 LD4 LD5 LD6 LD7 LD8 T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 4 DT22 + ++ ++ +++ ++ ++ + ++ KDĐB + ++ ++ ++ ++ ++ + ++ Bảng 3. Cho điểm và đánh giá khả năng nhân callus trên nền môi trường 6 Môi trường Giống N6D N6D1 N6D2 N6D3 N6D4 DT22 ++++ ++ +++ ++ ++ KDĐB +++ ++ +++ ++ ++ Trong các nồng độ 2,4D được sử dụng ở cả 2 công thức môi trường, thì nồng độ 2 mg/l 2,4D cho khả năng tạo callus cao nhất ở cả 2 giống DT22 và KDĐB. Nồng độ này đã được sử dụng nhiều trong các thí nghiệm tạo callus. Điều đó gợi ý rằng, các giống lúa có khả năng tạo callus cao nhất khi nồng độ 2,4D ngoại sinh được bổ sung trong môi trường nuôi cấy là 2 mg/l. Do vậy, nồng độ 2 mg/l 2,4D có bổ sung các hợp chất như casein (300 mg/l) và proline (3000 mg/l) có thể áp dụng để tạo và nhân callus cho các thí nghiệm tạo callus phục vụ kỹ thuật tái sinh và chuyển gen. Ảnh 1. Mẫu lúa DT22 và KDĐB trên môi trường phát sinh và nhân callus Trong một số tài liệu, môi trường MS được cho là có hiệu quả cao hơn so với N6 để tạo callus (A.S.M.T. Bayawickrama và Toyoaki Anai, 2006). Nhưng kết quả thu được của chúng tôi chứng minh điều ngược lại. Trong mọi nồng độ 2,4D khác nhau, môi trường N6 cho kết quả tạo callus cao hơn so với MS tương ứng. Vì thế chúng tôi cho rằng các giống lúa khác nhau có thể có phản ứng khác nhau trong điều kiện dinh dưỡng có nhiều khác biệt. Việc sử dụng cả 2 loại môi trường để tạo callus ở lúa sẽ giúp các nhà khoa học tìm ra được môi trường thích hợp nhất trong công tác nghiên cứu này. 3. Kết quả tái sinh cây từ callus Trong các tổ hợp các chất điều hoà sinh trưởng được sử dụng, BAP và kinetin thuộc nhóm cytokinin được kết hợp hoặc không kết hợp với NAA thuộc nhóm auxin. Dựa vào đánh giá về mặt hình thái, BAP cho khả năng tạo chồi tái sinh ở các nồng độ khác nhau cao hơn so với kinetin. KDĐB KDĐB DT22 T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 5 Ảnh 2. Mẫu lúa tái sinh của giống DT22 và KDĐB Ở nồng độ BAP 2 mg/l khả năng tạo chồi và chất lượng các chồi được tạo thành tốt nhất. Ở môi trường BL2 (2 mg/l BAP), giống DT22 phản ứng tốt hơn so với giống KDĐB với hình thái cụm chồi xanh, khoẻ và đồng nhất. Tỷ lệ tạo chồi trung bình là 74,1% đối với giống DT22 và 66,1% đối với giống KDĐB. Đây cũng là môi trường cho tỷ lệ tạo chồi cao nhất so với các môi trường còn lại được sử dụng để tái sinh giống DT22. Với các tổ hợp môi trường có bổ sung thành phần kinetin thì ở nồng độ 2 mg/l kinetin khả năng tạo chồi và tỷ lệ tạo chồi cũng cao nhất trong cả 2 giống được nghiên cứu. Tuy nhiên, xét trên cả 2 tiêu chuNn là tỷ lệ tạo chồi và chất lượng chồi được tạo thành đều không cao bằng sử dụng môi trường với nồng độ 2 mg/lBAP. Tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt cao nhất là 58,4% đối với giống DT22 ở môi trường K3 (2 mg/l kinetin) (bảng 4). Trong khi đó, cũng với môi trường này, tỷ lệ tạo chồi của giống KDĐB chỉ đạt được là 53,7%. Chất lượng chồi tạo thành cũng không cao khi chồi thường bị xoăn, yếu và có tạo rễ. Vì vậy, trong tái sinh cây của 2 giống DT22 và KDĐB sử dụng môi trường tái sinh với chất kích thích sinh trưởng là BAP sẽ cho hiệu quả cao hơn môi trường có sử dụng kinetin. Sự khác biệt là đối với môi trường tái sinh A4 có bổ sung BAP 2 mg/l, giống KDĐB có khả năng tạo cụm chồi xanh, đồng nhất và khoẻ hơn khi trong môi trường có kết hợp với NAA nồng độ 0,1 mg/l. Do vậy, môi trường thích hợp để tái sinh giống DT22 là môi trường BL2 có bổ sung 2 mg/l BAP còn môi trường A4 có bổ sung 2 mg/l BAP và 0,1 mg/lNAA thích hợp để tái sinh giống KDĐB. Bảng 4. Đánh giá tỷ lệ tái sinh cây từ callus và hình thái chồi Môi trường Tỷ lệ tái sinh và tạo chồi (%) DT22 KDĐB (%) Hình thái chồi (%) Hình thái chồi A1 60,3 ± 3,2 Cụm chồi xanh, khoẻ 57,1 ± 1,8 Cụm chồi xanh, khoẻ A2 66,1 ± 2,6 Cụm chồi xanh, khoẻ, có tạo rễ 61,4 ± 2,7 Cụm chồi xanh, vừa phải, xuất hiện nhiều rễ A3 67,2 ± 3,0 Cụm chồi xanh, khoẻ, có tạo rễ 60,4 ± 2,8 Cụm chồi xanh, vừa phải, xuất hiện nhiều rễ A4 70,1 ± 1,8 Chồi xanh, khoẻ 72,6 ± 1,1 Cụm chồi xanh, đồng nhất, khoẻ BL1 68,3 ± 2,0 Chồi xanh, thẳng, sức sống trung bình 64,6 ± 1,5 Chồi xanh, thẳng, sức sống trung bình BL2 74,1 ± 2,5 Cụm chồi xanh, đồng nhất, 66,1 ± 3,1 Chồi xanh, thẳng, sức sống DT22 KDĐB T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6 khoẻ trung bình BL3 71,4 ± 3,3 Cụm chồi xanh, đồng nhất, khoẻ 65,8 ± 2,3 Chồi xanh, thẳng, sức sống trung bình BL4 69,9 ± 2,1 Chồi xanh, nhỏ, yếu 63,7 ± 1,9 Cụm chồi xanh, kích thước vừa, yếu BL5 66,4 ± 1,5 Chồi xanh, xoăn, yếu 61,8 ± 2,7 Chồi xanh, kích thước vừa, yếu BL6 64,2 ± 3,0 Chồi xanh, xoăn, yếu 60,3 ± 2,9 Chồi xanh, kích thước vừa, yếu K1 49,7 ± 3,0 Chồi xanh, ngắn, yếu 52,7 ± 2,3 Chồi xanh, xoăn, yếu K2 51,0 ± 2,2 Chồi xanh, ngắn, yếu 54,6 ± 1,2 Chồi xanh, ngắn, yếu K3 53,7 ± 1,4 Chồi xanh, dài, khoẻ 58,4 ± 1,6 Chồi xanh, dài, khoẻ K4 50,8 ± 2,2 Chồi xanh, ngắn, có rễ 54,1 ± 2,3 Chồi xanh, mảnh, yếu K5 49,1 ± 1,6 Chồi xanh, mảnh, xoắn, có rễ 52,2 ± 3,1 Chồi xanh, mảnh yếu, có rễ IV. KẾT LUẬN 1. Hiệu quả khử trùng tốt nhất đối với giống DT22 và KDĐB là sử dụng NaClO 10% trong thời gian 20 phút; 2. Môi trường tạo callus thích hợp cho 2 giống DT22 và KDĐB là: N6 + 2 mg/l 2,4D + 3000 mg/l proline + 300 mg/l casein + 3% đường + 0,3% phytagel 3. Môi trường tái sinh giống DT22: Môi trường cơ bản MS (đa lượng, vi lượng, vitamin) + 2 mg/l BAP + 100 mg/l nước dừa + 8 g/l agar + 30 g/l đường; 4. Môi trường tái sinh giống KDĐB: Môi trường cơ bản MS (đa lượng, vi lượng, vitamin) + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA + 100 mg/l nước dừa + 8 g/l agar + 30 g/l đường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Đỗ Hữu Ất, Bùi Huy Thuỷ, Trần Duy Quý, guyễn Minh Công, 2001. ″Cải tiến giống lúa thuần chất lượng nhập nội bằng phương pháp đột biến thực nghiệm”. Kết quả nghiên cứu khoa học (2000-2001). Viện Di Truyền Nông nghiệp, Bộ NN & PTNT. 2 A.S.M.T. Abayawickrama and Toyoaki Anai, 2006. Coparison of Regeneration Efficiency of Different Genotype of Indica Rice cultivars. Bull. Fac. Agr., Saga Univ. 92: 17-23. 3 Bhaskaran S, Smith RH., 1988. Enhanced somatic embryogenesis in Sorghum biocolor L. from shoot tip culture. In vitro Cell Dev. Biol. 24:65-70. 4 Hossain, M.A. and M. asreen., 1997. In vitro regeneration of six Indica rice cultivars. Bangladesh J. Biochem., 3: 95-98. 5 Kyozuka J, Otoo E, et al., 1988. Plant regeneration from protoplast of Indica rice: genotype differences in culture response. Theor. Appl. Genet. 76:887-890. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 7 6 Toki S., 1997. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation of rice. Pl. Mol. Biol. Rep. 15: 16-21. gười phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 8 . “ghiên cứu tái sinh giống lúa DT22 và Khang dân đột biến (KDĐB) phục vụ cho kỹ thuật chuyển gen . T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 2 II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 1 NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG LÚA DT22 VÀ KHANG DÂN ĐỘT BIẾN (KDĐB) PHỤC VỤ CHO KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Phí Công guyên, guyễn Thuý Điệp, Kiều Thị. NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Giống lúa DT22 và giống lúa Khang dân đột biến (KDĐB) có nguồn gốc và xuất xứ từ Viện Di truyền Nông nghiệp. Nuôi cấy mô tái sinh sử dụng môi trường cơ