TCNCYH 23 (3) 2003 Bớc đầu khảo sát tần số phân bố alen của gen D13S317 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lơng Thị Yến Cục Kỹ thuật Hóa-Sinh Bộ Công an D13S317 là đoạn ADN đa hình có trình tự lặp lại 4 đôi bazơ nitơ nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 13. Locus này chứa 9 alen, có độ dài từ 242 đến 270bp. Ngời ta đã xác định đợc số đoạn lặp lại trong quần thể ngời là 7,8,9,10,11,12,13,14 và 15. Trong bài này, bằng kỹ thuật PCR và điện di trên bản gel polyacrylamide biến tính, chúng tôi đã xác định sơ bộ tần suất các allen của locus D13S317. I. Đặt vấn đề Ngày nay, việc nghiên cứu ứng dụng các đoạn lặp, đặc biệt là các đoạn lặp ngắn (STR) trong hệ gen ngời đã trở thành phổ biến trong việc xác định cá thể ngời, xác định huyết thống cha con, truy tìm ngời mất tích qua hài cốt, xây dựng tàng th gen tội phạm để phục vụ các yêu cầu của tố tụng hình sự và dân sự. Các đoạn lặp của hệ STR thờng có chiều dài 2-7 cặp bazơ [4]. ở mỗi cá thể khác nhau, số lợng đoạn lặp khác nhau, do vậy mà ngời ta coi đây là đặc điểm cơ bản để xác định sự khác biệt giữa ngời này với ngời khác [3]. Ưu điểm của các đoạn lặp lại ngắn là khá bền vững, có thể thực hiện nhân gen tổ hợp của các đoạn gen khác nhau trong cùng một phản ứng và phù hợp với các mẫu hình sự [2]. Gen D13S317 là gen có những đặc điểm nh vậy. Sử dụng kỹ thuật PCR và điện di chúng tôi đã xác định đợc các alen của gen D13S317 [1]. Mục tiêu nghiên cứu: - Nghiên cứu các điều kiện PCR tối u để nhân bội đoạn gen D13S317. - Sử dụng kỹ thuật điện di trên gel Polyacrylamide biến tính để xây dựng thang allen cho locus di truyền D13S317 - Khảo sát sơ bộ tần xuất allen của locus D13S17 ở một số ngời Việt Nam. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng Máu tơi đợc lấy trực tiếp từ những ngời khoẻ mạnh, không có quan hệ họ hàng huyết thống. Các cá thể này là ngời Việt đợc phân bố ở các vùng địa lý khác nhau. 2. Phơng pháp a. Tách chiết ADN Tiến hành tách theo phơng pháp dùng phenol và chloroform [5]. Sản phẩm ADN sau khi tách đợc xác định nồng độ bằng quang phổ kế, kết quả cho thấy: - Nồng độ tối thiểu: 10,5ng/àl - Nồng độ tối đa: 290,5ng/àl - Nồng độ trung bình: 150ng/àl 81 TCNCYH 23 (3) 2003 Độ tinh sạch trung bình tính bằng chỉ số OD trên 1,75; đảm bảo chất lợng cho các nghiên cứu tiếp theo. b. Phản ứng nhân gen (PCR) - Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu cho locus D13S317 do hãng Geneset Singapore Biotech cung cấp. - Taq-polymerase, 10X PCR buffer và dNTPs của hãng Pharmacia. - Hỗn hợp phản ứng PCR: 10X PCR Buffer : 2,5àl dNTPs : 2,5àl Mồi xuôi : 1,0àl Mồi ngợc : 1,0àl Taq : 0,2àl dH 2 O : 16,8àl ADN khuôn : 1,0àl - Thực hiện phản ứng nhân gen trên máy Geneamp-PCR System 9700 của hãng Perkin Elmer (Mỹ) hoặc máy Eppendorf (Mỹ). Chu trình nhiệt: 95 o - 5 phút x 1 chu kỳ 58 o - 1 phút 72 o - 1 phút x 35 chu kỳ 94 o - 1 phút 58 o - 1 phút x 1 chu kỳ 72 o - 10 phút 4 o c. Điện di và xác định alen * Kỹ thuật điện di: Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR đã đợc kiểm tra trên gel agaroza 2% sau đó đợc điện di trên gel polyacrylamide 6% sử dụng ure 7M. Băng ADN đợc phát hiện bằng phơng pháp nhuộm bạc của Bassam, 1991 [6]. Hình 1: Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agaroza 2% * Chọn lọc và xây dựng thang alen-xác định alen: - Đánh số alen theo quy ớc riêng : Dựa vào các alen quan sát đợc của các mẫu khác nhau trên bản điện di, chúng tôi chọn ra các mẫu mang các alen khác nhau và đánh số alen theo thứ tự từ dới lên trên (đánh số alen từ băng ADN có trọng lợng phân tử thấp nhất đến băng ADN có trọng lợng phân tử cao nhất). Việc đánh số ở đây chỉ mang tính quy ớc sao cho mỗi alen xác định đợc có ký hiệu riêng, vì đây là quá trình khảo sát ban đầu cha có thang alen chuẩn để so sánh. 82 TCNCYH 23 (3) 2003 - Xây dựng thang alen: Trong quá trình đánh số, chúng tôi đồng thời chọn ra những mẫu mang những alen khác nhau tập hợp lại để tạo thang alen. Thang alen đợc tạo bằng phơng pháp trộn mẫu. - Chuẩn thang alen: ký hiệu lại các alen đã khảo sát đợc theo quy ớc quốc tế. Alen của locus D13S317 đợc ký hiệu từ 7 đến 15 căn cứ vào số đoạn lặp của mỗi alen. Chúng tôi tiến hành chuẩn thang alen nh sau: lấy kết quả tần suất alen tính đợc so sánh với tần suất alen đã khảo sát bằng thang alen chuẩn theo tài liệu nghiên cứu ở một nhóm ngời Việt Nam sau đó ký hiệu lại các alen dựa vào tần suất tơng đơng. III. Kết quả 1. Kết quả chọn lọc alen và tạo thang alen Sử dụng các phơng pháp đã nêu, bớc đầu chúng tôi đã tạo đợc thang alen chuẩn cho locus D13S317. Thang alen này (ký hiệu LD) bao gồm 8 alen khác nhau (hình 2) đợc ký hiệu từ alen số 8 đến alen số 15 theo phơng pháp chuẩn alen đã nêu. Hình 2. Thang alen chuẩn của locus D13S317 với 8 alen khác nhau đợc phân tách bằng kỹ thuật điện trên gel PA biến tính. 2. Kết quả tính tần suất alen của locus D13S317 Kết quả khảo sát của chúng tôi Allen 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Số lợng 0 100 31 24 62 50 12 2 1 Tần suất % 0 35.46 10.99 8.51 21.98 17.73 4.25 0.7 0.35 Kết quả khảo sát của nớc ngoài đối với ngời Việt Nam Allen 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Tần suất % 0.3 29.5 16.6 12.4 23.0 15.2 2.8 0.3 0 Tổng số mẫu đợc khảo sát : 141 - Số cá thể đồng hợp tử : 29 - Số cá thể dị hợp tử : 112 83 TCNCYH 23 (3) 2003 - Số allen xác định đợc : 8allen ( ký hiệu từ allen số 8 đến allen số 15) - Allen có tần suất cao nhất là allen số 8 : 35,46% - Allen có tần suất nhỏ nhất là allen số 15 : 0.35% IV. Bàn luận Sử dụng kỹ thuật PCR và dùng đôi mồi đặc hiệu chúng tôi đã nhân bội đợc đoạn gen di truyền D13S317 có độ dài từ 242 đến 270 bp Sản phẩm PCR đợc điện di trên gel agaroza 2%. Kết quả điện di cho thấy điện di trên gel agarose các băng ADN hiện rất rõ nhng khả năng phân tách các đoạn lặp lại 4 bp không cao. [5] Sử dụng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide biến tính kết hợp với phơng pháp nhuộm bạc [6] là phơng pháp thích hợp để phân tách các đoạn ADN cách nhau 4 bp của đoạn gen D13S317. Sử dụng phơng pháp này chúng tôi đã chọn đợc 8 allen khác nhau để xây dựng thang allen chuẩn theo thang chuẩn quốc tế [7]. Kết quả khảo sát cho thấy ở gen D13S317 alen số 8 có tần suất cao nhất (35.46%),alen số 15 có tần suất thấp nhất (0.35%), cha thấy xuất hiện alen số 7. Tuy nhiên số liệu này cũng tơng đối phù hợp với số liệu khảo sát của các tác giả [7] khi khảo sát 16 gen hệ STR của quần thể ngời Việt. V. Kết luận 1. Đã lựa chọn đợc qui trình PCR tối u để nhân đoạn gen di truyền D13S317 2. Sử dụng sản phẩm PCR cùng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide biến tính xây dựng đợc thang alen cho locus di truyền D13S317. Thang alen tạo đợc gồm 8 alen khác nhau ký hiệu từ alen số 8 đến 15. 3. Đã khảo sát sơ bộ tần suất alen của locus D13S317 ở 141 mẫu ADN ngời Việt Nam dựa vào thang alen tạo đợc. Tần suất khảo sát thu đợc cao nhất ở alen số 8,alen số 7 cha thấy xuất hiện trong số mẫu đã khảo sát. Tài liệu tham khảo 1. Budowle B., Safantila A., Hochmeister M. N., and Comey C. T. (1994): The application of PCR to forensic science, The PCR. 244-256. 2. Hammond H. at al. (1994): Evaluation of 13 short tandem repeat loci for use in personal identification application, Am.J. Hum. Genet, 55: 175. 3. Lewontin R. C., Hartl D.L. (1991): Population genetics in forensic DNA typing", Science. 254: 1745-1750. 4. Lygo. J. E., Johnson. P. E. J et al. (1994): The validation of short tandem repeat (STR) loci for use in forensic casework. Int.J.Legal Med. 107: 77-89. 5. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989): Molecular cloning -Vol 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA. E10 - E12. 6. Westermeier R. (1997): Electrophoresis in Practice, VCH A Wiley company, Federal Republic of Germany. 287- 292 7. Technical manual (1999): Geneprint fluorescent STR systems, Promega. 2-7, 36 37. 84 TCNCYH 23 (3) 2003 Summary Primary determination of allele frequencies of D13S317 locus in Vietnamese population Repeated sequences in human genome especially short tandem repeat (STR) loci is used increasingly for forensic purpose including individualization, paternity testing, MIA (missing in action) casework and construction of criminal DNA profile. In comparison with the traditional methods, STR analysis has many advantages. STR loci consist of short repetitive sequence units of 2-7 base pair in length. The number of repetitive sequence units is usually different between individuals. This is a very important characteristic for individualization. Another advantages which makes STR loci become useful for forensic analysis is their stability under changing environmental conditions because of their short length. In addition, a PCR for multification of 2-3 STR loci of a DNA sample can be performed well in only one tube. D13S317 is a STR locus which located on the long hand of the chromosome No 13. The locus contains 9 alleles singed after their number of repeat units as 7, 8, 9, 10 ,11, 12, 13, 14, 15. In this report, PCR technique and denaturing polyacrylamide gel electrophoresis were applied for determination of allele frequencies of D13S317 locus. The data investigated among 141 Vietnamese DNA samples shows the highest frequency at allele No 8 (35.46%). Allele No 7 has not been observed. 85 . TCNCYH 23 (3) 2003 Bớc đầu khảo sát tần số phân bố alen của gen D13S317 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lơng Thị Yến Cục Kỹ thuật Hóa-Sinh Bộ Công an D13S317 là đoạn ADN đa hình. D13S317 alen số 8 có tần suất cao nhất (35.46%) ,alen số 15 có tần suất thấp nhất (0.35%), cha thấy xuất hiện alen số 7. Tuy nhiên số liệu này cũng tơng đối phù hợp với số liệu khảo sát của các. xây dựng đợc thang alen cho locus di truyền D13S317. Thang alen tạo đợc gồm 8 alen khác nhau ký hiệu từ alen số 8 đến 15. 3. Đã khảo sát sơ bộ tần suất alen của locus D13S317 ở 141 mẫu ADN