24/6 PHN NG TRUNG HA VIRUT PRRS TRÊN NUÔI CẤ Y TẾ BÀ O VÀ Ƣ́ NG DỤ NG Trầ n Thị Thanh Hà 1 , Ken Inui 2 , Phm Th Nga 1 , Đng Xuân Sinh 1 , Trnh Quang Đi 1 , Trương Anh Đứ c 1 v Nguyn Vit Không 1 . TM TT. Trung hò a virut vớ i huyế t thanh trên nuôi cấ y tế bà o cho phé p đá nh giá được mứ c huyế t thanh lợ n miễ n dịch trung hò a đượ c virut PRRS có nguồ n gố c khá c nhau , sơ bộ đá nh giá khả năng miễ n dịch dịch thể bả o hộ . Trong nghiên cứ u nà y chú ng tôi đã thiế t lậ p phương php trung ha virut (VNT) PRRS trên tế bà o Marc145, bướ c đầ u sử dụ ng đá nh giá hiệ u giá trung hò a củ a lợ n là nh bệ nh triệ u chứ ng tạ i thự c địa có so sá nh vớ i phương phá p chẩ n đoá n ELISA và IPMA . Khc vi kt qu ELISA v IPMA, VNT cho thấ y huyế t thanh lợ n nhiễ m PRRS chủ ng Việ t Nam chỉ trung hò a virut phân lậ p nộ i địa, không trung hò a cá c virut c ngun gc Châu Âu v Bc M. VNT tỏ ra là phương phá p chiế m ưu thế hơn ELISA và IPMA trong đá nh giá đá p ng min dch ca lợ n khá ng chủ ng địa phương. Từ khóa: Virut PRRS, Trung hòa, T bo Marc145, Huyt thanh. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ. Hội chng ri loạn sinh sn v hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Resiratory Syndrome - PRRS) gây thiệt hại ln đi vi ngnh chăn nuôi lợn ở Việt nam v trên th gii . Hng năm, tại M ưc tính thiệt hại do bệnh PRRS gây ra ở mc 720 triệu đô la Mỹ . Ở Việt nam, thiệt hại kinh t do PRRS gây ra chưa được ưc tính, tuy nhiên trong những năm gần đây hng loạt cc trại lợn đã phi tiêu huỷ do hội chng ri loạn sinh sn v hô hấp. Bệnh được xp vào nhóm cc bệnh nguy hiểm trong danh mục cc bệnh ca Tổ chc thú y th gii (OIE). Cho đn nay, lợn l động vật duy nhất mc hội chng ri loạn hô hấp v sinh sn [7,8,9,11]. Việc khng ch dch bệnh đang gặp nhiều kh khăn do chưa c loại vacxin no c thể bo hộ đn lợn hon ton phng chng được hội chng ri loạn hô hấp v sinh sn. Để khẳng đnh c hay không khng thể trung ha sau khi tiêm phng vacxin hoặc sau khi con vật nhim bệnh, chúng tôi s dụng phương php trung ha huyt thanh. 1 Phương php ny được Morrison v cs mô t năm 1992, so vi phương php IPMA khng thể, phương php trung ho khng thể đi vi vi rút PRRS l phương php tiê u chuẩn dùng để pht hiện sự xuất hiện khng thể chậm. Phương php ny được Yoon v cs ci tin năm 1994 bằng cch pha loãng vi rú t trong huyt thanh thường , lm tăng độ nhạ y ca phn ng , cho phép pht hiện khng thể trung ho sm khong 11 ngy sau khi gây nhim ; đng thời, c thể thấy sự khc biệt khi sử dụng cc chng vi rú t c độ tương đng khc nhau . Sự khc nhau ny không quan st được khi dùng phương php IFAT. Phương php trung ha virut thường chỉ p dụng được ở những phng thí nghiệm c đ điều kiện nuôi cấy t bo, ít được sử dụng thường quy trong chẩn đon . Tuy nhiên, phương php ny c thể dùng cho những vi rú t PRRS phân lập được c tính khng nguyên khc nhau, đng thời l phương php ti ưu xc đnh độ di min dch ca cơ thể lợn đi vi vi rú t PRRS [7]. Ở Việt Nam, do điều kiện cơ sở vật chất phng thí nghiệm chưa cho phép thực hiện việc công cường độc vì th n c thể được thay th bằng phương php trung ha virut trên t bào. II. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Nội dung. - Nuôi cấy t boMarc145 - Chuẩn độ virut PRRS - Thit lập phương php trung ha virut PRRS trên môi trường t bo Marc145 - Áp dụng phương php trung ha virut đi vi một s mẫu từ thực đa 2.2. Nguyên liệu. 1 Viện Thú y, 2. Chuyên gia FAO tại Việt nam 25/6 - T bo Marc145 c ngun gc từ c - Môi trường MEM, Huyt thanh bo thai bê củ a hã ng Gibco - 3 chng Virut PRRS: 0196 (chng phân lập tại thực đa ); Chng Châu âu phân lập lại từ vacxin Amervac do bộ môn Hó a sinh - Miễ n dịch- Bệ nh lý và chủ ng Bắ c Mỹ (chng MLV) do chuyên gia FAO cung cấ p. - Chai nuôi cấy, đĩa nuôi cấy củ a hã ng Corning. - Huyt thanh âm chuẩ n và dương chuẩ n do chuyên gia FAO cung cấ p Má y li tâm , t lạnh, safety cabinate và má y mó c khá c trong phò ng thí nghiệ m. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu : 2.3.1.Nuôi cấy t bo Marc145 Phương phá p nuôi cấ y tế bà o đượ c thự c hiệ n theo quy trình ca CSIRO , Úc (The commonwealth Scientific and Industrial Reseach Organisation) 2.3.2. Gây nhim virut PRRS trên t bo Marc145 (được thực hiện theo hưng dẫn ca OIE trong chương 2.08.07) 2.3.3. Xác đnh sự có mt của virut PRRS bằng phản ứng RT-PCR Đây l phương php thường quy tại bộ môn Ha sinh- Min dch -Bệnh lý, Viện thú y, phn ng được tin hnh theo cc bưc như sau: (1) Tch chit RNA bằng phương php Trizol (2) Tổng hợp cDNA bằng phương php sử dụng Random primer (3) PCR sử dụng cặp mi đặc hiệu được thit k để pht hiện vi rú t PRRS 2.3.4. Chuẩn độ virut Phương phá p nà y đượ c thự c hiệ n theo quy trình ca OIE , và tính TCID50 theo phương php Read Muench [1] Âm tính: Nu ở độ pha loãng đ t bo pht triển bình thường, không c bệnh tích t bo (Ging đi chng t bo) Dương tính: Nu ở độ pha loãng đ xuất hiện bệnh tích trên t bo (ging đi chng virut) 2.3.4. Thit lập phương pháp trung hòa virut trên môi trường t bo (theo hướng dẫn của OIE trong chương 2.08.07 và Virology methods manual) [1,2,3,7,8] III. KẾT QU NGHIÊN CU 3.1. Kết quả nuôi cấy tế bào Để c t bo ở trạng thi đang pht triển v ph đy 100% sau 1; 2 ngy thì lượng t bo khi cấy chuyển cần 5x10 5 t bo /ml; 2x10 5 t bo/ml. Vi mật độ v tình trạng pht triển ca t bo như trên, cc thí nghiệm về gây nhim vi rú t , nhân ging vi rú t, chuẩn độ v phn ng trung ha đều đạt kt qu tt. 3.2. Kết quả gây nhiễm virut PRRS trên tế bào Marc145 Qua gây nhim virut PRRS trên t bo Marc145 cho thấy tùy từng chng m thời gian xuất hiện bệnh tích t bo khc nhau v biểu hiện bệnh bin ca t bo cũng khc nhau. Bệnh tích điển hình l t bo co cụm hình chùm nho hoặc t bo b ph hy hon ton 3.3. Xác định sự có mặt của virut PRRS bằng phản ứng RT-PCR Sau khi nhân ging 03 chng vi rú t sẽ sử dụng trong nghiên cu , để khẳng đnh lại sự c mặt ca cc chng vi rú t ny, chúng tôi đã sử dụng phương php RT-PCR. vớ i cặ p mồ i F2R2 c trình tự: Fwd: 5’ATGTTGGGGAAATGCTTGACC3’ v Rev: 5’GTTCCGCTGAAACTCTGGTTA3’ Kt qu cho thấ y c 3 chng vi rú t PRRS sau khi được nhân lên trên t bo Marc 145 đều cho kt qu PCR dương tính . Chng tỏ việc gây nhim vi rú t P RRS v nhân ging vi rú t thnh công. 3.4. Kết quả chuẩn độ các chủng virut PRRS 26/6 Trong nghiên cu ny chúng tôi tiế n hà nh chuẩn độ 3 chng virut: (1)chng 0196, (2) chng Châu Âu; (3) chng MLV. Mỗ i chủ ng vi rú t PRRS đượ c thự c hiệ n chuẩ n độ lặ p lạ i 3 lầ n, kế t quả cc lần thực hiện đều ging nhau. Bảng 1. Kt quả chuẩn độ các chủng virut PRRS TT Chủng virut PRRS TCID50 1 0196 10 6.5 /ml 2 Châu Âu 10 5.5 /ml 3 MLV 10 6.7 /ml 3.5. Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa virút PRRS trên môi trƣờng tế bào Marc145. Để thit lập phương php trung ha trên môi trường t bo Marc 145 đi vi vi rú t PRRS , chúng tôi đã sử dụng chng vi rú t cường độc phân lập tại thực đa v mẫu huyt thanh dương v âm đi vi phương php ELISA v IPMA Mẫ u huyế t thanh dương là mẫ u huyế t thanh thu đượ c từ lợ n đượ c gây nhiễ m vi rú t PRRS nhân tạ o và mẫu huyt thanh âm l mẫu huyt thanh thu thập từ lợn ca những vùng không b nhiễ m bệ nh PRRS, đã đượ c sà ng lọ c bằ ng phả n ứ ng ELISA và IPMA Phn ng trung hò a vir ut PRRS trên môi trường t bo Marc145 đượ c thiế t lậ p trên cơ sở phn ng trung ha vi rút theo hưng dẫn ca Virology methods manual [1] Trong quá trình thiế t lậ p phương phá p t rung hò a virut PRRS tạ i bộ môn HSMDBL , thí nghiệ m đã đượ c thự c hiệ n lặ p lạ i nhiề u lầ n , v sau mi lần thí nghiệm , cc điều kiện như nng độ CO2, thờ i gian ủ virut v huyt thanh, nhiệ t độ thích hợ p cho việ c trung hò a virut…đều được tố i ưu hó a sau từ ng thí nghiệ m. Kế t quả : Phương phá p trung hò a đã đượ c thiế t lậ p gm cc bưc như sau: Bướ c 1: Chuẩ n bị tế bà o Bưc 2 : Chuẩn b virut Bướ c 3: Trung hò a huyt thanh Bưc 5: Đnh gi kt qu Âm tí nh: Nế u ở độ pha loã ng huyế t thanh đó có bệ nh biế n tế bà o (huyế t thanh không trung ha được vi rút). Dương tính: Nế u tạ i giế ng đó lớ p tế bà o vẫ n phá t triể n tố t , bm đy v không c bệnh tích tế bà o. Đi vi c c mẫ u thí nghiệ m : Ở cc ging c nng độ huyt thanh cao : Lớ p tế bà o mọ c đều, mn v pht triển tt, không có tế bà o chế t, không có bệ nh biế n tế bà o . Ở cc ging c nng độ huyế t thanh thấ p, xuấ t hiệ n cá c đá m tế b o cụm lại, sau 5 ngy cc đm t bo b bong ra v chế t, khi nhuộ m không cò n hoặ c rấ t í t tế bà o bá m đá y. Kế t quả cho thấ y phn ng trung ha đã được thit lập trên mẫu huyt thanh dương tính v âm tính chuẩn (theo phương php ELISA và IPMA) vi chủ ng vi rú t thực đa cường độc. 3.6. Kế t quả á p dụ ng phả n ứ ng trung hò a đố i vớ i mộ t số mẫ u huyế t thanh dương, âm tính đố i vớ i ELISA Sau khi thiế t lậ p đượ c phương phá p đề tà i đã thự c hiệ n phả n ứ ng trung hò a đố i vớ i 20 mẫ u huyế t thanh củ a lợ n sau khi bị bệ nh PRRS tạ i Quả ng Nam dương tính vớ i ELISA và 5 mẫ u huyế t thanh âm tính vớ i ELISA . Kế t quả bướ c đầ u cho thấ y đố i vớ i cá c mẫ u huyế t thanh âm tính ELISA thì đồ ng thờ i cho kế t quả âm tính đi vi phn ng trung ha . Cn cc mẫu dương tính ELISA cao cũ ng cho hiệ u giá đố i vớ i VNT. Chúng tôi cũng đã sử dụ ng cá c mẫ u huyt thanh trên đố i vớ i 2 chng vi rút Châu Âu v Bc M, nhưng kế t quả đề u âm tính đố i vớ i tấ t cả cá c mẫ u dương tính ELISA. 27/6 Bảng 2: Kế t quả thự c hiệ n phả n ứ ng VNT đố i vớ i mầ u huyế t thanh từ thự c địa TT Ký hiệu mẫu Gia súc Tuổi Kết quả ELISA S/P Kết quả VNT (log2, chủng VN) Kết quả VNT (log2, chủng EU) Kết quả VNT (log2, chủngNA) 1 243 Lợn 5 tháng 3.96 8.00 0.00 0.00 2 257 Lợn 4 tháng 3.86 3.00 0.00 0.00 3 248 Lợn 4 tháng 3.78 7.00 0.00 1.00 4 246 Lợn 5 tháng 3.70 7.00 0.00 0.00 5 273 Lợn 5 tháng 3.67 7.00 0.00 0.00 6 269 Lợn 5 tháng 2.99 7.00 2.00 0.00 7 252 Lợn 4 tháng 2.97 6.00 0.00 0.00 8 253 Lợn 4 tháng 2.94 5.00 0.00 0.00 9 275 Lợn 5 tháng 2.92 6.00 1.00 0.00 10 256 Lợn 4 tháng 2.80 6.00 0.00 0.00 11 278 Lợn 4 tháng 2.35 4.00 2.00 1.00 12 259 Lợn 4 tháng 2.28 4.00 0.00 0.00 13 7 Lợn ni 36 thng 2.15 4.00 0.00 0.00 14 5 Lợn 4.5 tháng 1.99 5.00 0.00 0.00 15 242 Lợn 5 tháng 1.97 2.00 0.00 0.00 16 245 Lợn 4 tháng 1.33 6.00 0.00 0.00 17 260 Lợn 4 tháng 0.97 3.00 0.00 0.00 18 261 Lợn 4 tháng 0.65 5.00 1.00 1.00 19 224 Lợn 3.5 tháng 0.50 3.00 0.00 0.00 20 222 Lợn 3.5 tháng 0.45 3.00 0.00 0.00 21 211 Lợn 5 tháng 0.00 1.00 0.00 0.00 22 212 Lợn 5 tháng 0.02 1.00 0.00 0.00 23 214 Lợn 5 tháng 0.01 1.00 0.00 0.00 24 215 Lợn 5 tháng 0.03 1.00 0.00 0.00 25 216 Lợn 5 tháng 0.04 1.00 0.00 0.00 Trong nghiên cứ u nà y để so sá nh kế t quả củ a 2 phương phá p chú ng tôi sử dụ ng công thứ c tính hệ s tương quan:          yx n i n i n i ii n i n i i n i i ssn yx n yx yyxx yyxx r 1 1 1 11 1 1 2 1 2 1 1                            Bảng 3: Hệ số tương quan giữ a kế t quả ELISA và kế t quả phả n ứ ng trung hò a Chủng virut Hệ số tƣơng quan Chng thực đa 0.883102 Chng Bc M 0.276098 Chng Châu Âu 0.143956 28/6 Qua bả ng trên cho thấ y có sự tương quan giữ a kế t quả ELISA vớ i kế t quả VNT củ a chủ ng thự c địa, v không c sự tương quan giữa kt qu ELISA vi kt qu VNT củ a cá c chủ ng Châu Âu và Bắ c Mỹ . 3.7. Kế t quả thự c hiệ n phương phá p IPMA đố i vớ i mẫ u huyế t thanh thự c địa Trong nghiên cứ u nà y chú ng tôi cũ ng đồ ng thờ i thự c hiệ n phả n ứ ng IPMA đố i vớ i cá c mẫ u huyế t thanh từ thự c đị a. Phn ng IPMA c độ nhạy v độ đặc hiệu cao , phương phá p nà y thườ ng chỉ đượ c sử dụ ng trong cá c phò ng thí nghiệ m có điề u kiệ n nuôi cấ y tế bà o và gây nhiễ m virut. Bảng 4: Kt quả thực hin phản ứng IPMA đi vi mu huyế t thanh thự c địa TT Ký hiệu mẫu Gia súc Tuổi Kết quả ELISA S/P ratio Kết quả IPMA (chủng VN) Kết quả IPMA (chủng EU) Kết quả IPMA (chủng NA) 1 243 Lợn 5 tháng 3.96 4.00 3.00 3.00 2 257 Lợn 4 tháng 3.86 4.00 3.00 2.00 3 248 Lợn 4 tháng 3.78 4.00 3.00 3.00 4 246 Lợn 5 tháng 3.70 4.00 3.00 3.00 5 273 Lợn 5 tháng 3.67 4.00 3.00 3.00 6 269 Lợn 5 tháng 2.99 4.00 3.00 4.00 7 252 Lợn 4 tháng 2.97 4.00 3.00 3.00 10 256 Lợn 4 tháng 2.80 3.00 3.00 2.00 12 259 Lợn 4 tháng 2.28 3.00 2.00 2.00 14 5 Lợn 4.5 tháng 1.99 4.00 2.00 3.00 15 242 Lợn 5 tháng 1.97 3.00 2.00 2.00 21 211 Lợn 5 tháng 0.00 0.00 0.00 0.00 22 212 Lợn 5 tháng 0.02 0.00 0.00 0.00 23 214 Lợn 5 tháng 0.01 0.00 0.00 0.00 24 215 Lợn 5 tháng 0.03 0.00 0.00 0.00 25 216 Lợn 5 tháng 0.04 0.00 0.00 0.00 Kế t quả bướ c đầ u cho thấ y khi thự c hiệ n đố i vớ i cả 3 chng virut đều cho kt qu âm tính v dương tính r. Bảng 5: Hệ số tương quan giữ a kế t quả ELISA và kế t quả phả n ứ ng IPMA Chủng virut Hệ số tương quan Chng thực đa 0.951706 Chng Bc M 0.894025 Chng Châu Âu 0.977332 Qua bả ng kế t quả về hệ số tương quan cho thấ y kế t quả thự c hiệ n phả n ứ ng IPMA trên cả 3 chng đều c tương quan đi vi kt qu ca phn ng ELISA. Bảng 6: Hệ số tương quan giữ a kế t quả trung hò a và kế t quả phả n ứ ng IPMA Chủng virut Chủng thc đa Chủng Bc M Chủng Châu Âu Chng thực đa 0.866012 0.210092 0.210092 Chng Bc M 0.210092 0.213021 0.402374 Chng Châu Âu 0.210092 0.402374 0.220564 Chỉ c sự tương quan giữa kt qu ca phn ng trung ha v IPMA ca chng virut thự c địa. Cn kt qu ca cc chng khc không c sự tương quan. 29/6 IV. Kết luận: Trong nghiên cứ u nà y chú ng tôi có nhữ ng kế t luậ n như sau: - Phn ng trung ha t bo đi vi vi rút PRRS đã được thit lập tại bộ môn Ha sinh - Miễ n dị ch - Bệ nh lý , Việ n thú y. - Phương phá p đượ c thiế t lậ p gồ m cá c công đoạ n : (a)Chuẩ n bị tế bà o ; (b)Chuẩ n bị vi rú t ; (c)Trung hò a huyế t thanh; (d)Đọ c kế t quả phả n ứ ng - Bướ c đầ u á p dụ ng phương phá p trung hò a đố i vớ i mẫ u thự c địa và có sự so sá nh kế t quả vớ i 2 phương phá p ELISA và IPMA. - Kế t quả trung hò a củ a cá c mẫ u huyế t thanh củ a gia sú c bị bệ nh từ thự c địa đề u âm tính đố i vớ i cá c chủ ng Châu Âu và Bắ c Mỹ . - Đi vi chng vi rút Châu Âu v Bc M kt qu ca phn ng ELISA không tương đng vớ i kế t quả củ a phả n ứ ng trung hò a vi rú t. TÀI LIỆU THAM KHO: 1. Brian WJ Mahy and Hillar O Kangro (1996) Virology methods manual, Chapter 6- P108; P195-199 2. Enuh Rahario JUSA, yuji INABA, Michihiro KOUNO, Omasu HIRUE, Hisao YASUHARA (2005), Slow reacting and complement requiring neutralizing antibody in swine infected with PRRS virut - Journal of General Virology 86, P1943–1951 3. E. Albina (1998) Immune responses in pigs infected with PRRS- Veterinary Immunology and Immuno-pathology P49-66 4. I. Dı´az,1,2 L. Darwich,1,2 G. Pappaterra,3 J. Pujols1,3 and E. Mateu1,2 Immune responses of pigs after experimental infection with a European strain of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Journal of General Virology (2005), 86, P1943–1951 5. Gonnie Nodelijk (1996) comparison of commercila ELISA and immune peroxidase monolayer assay to detect antibodies directed against PRRS, Veterinary Microbiology P285- 295 6. MichaelO’Connor_Irish (2002), Detection of antibody to PRRS virus by ELISA and IPMA, Veterinary Journal, P73 -75 7. Nettebotner (1997), Diagnosis of PRRS, Veterinary Microbiology, P295-301. 8. OIE Terrestrial Manual (2008) Porcine reproductive and respiratory syndrome Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, P1116-1127. 9. J.Plana-Duran (1997) Efficacy of inactivated vaccine for prevention of reproductive failure induced by PRRS, Veterinary Microbiology, P361-370 10. R.W.Wills (1997), PRRS a persistent infection.pdf, Veterinary Microbiology P231-240 11. Zygmunt Pejsak (1997) Clinical signs and economic losses caused by porcine reproductive and resiratory syndrome virus in a large breeding farm, Veterinary Microbiology P317-322 . php trung ha virut trên t bào. II. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Nội dung. - Nuôi cấy t boMarc145 - Chuẩn độ virut PRRS - Thit lập phương php trung ha virut PRRS. chủng virut PRRS TT Chủng virut PRRS TCID50 1 0196 10 6.5 /ml 2 Châu Âu 10 5.5 /ml 3 MLV 10 6.7 /ml 3.5. Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa virút PRRS trên môi trƣờng tế bào. trên, cc thí nghiệm về gây nhim vi rú t , nhân ging vi rú t, chuẩn độ v phn ng trung ha đều đạt kt qu tt. 3.2. Kết quả gây nhiễm virut PRRS trên tế bào Marc145 Qua gây nhim virut