1 ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA VẮC XIN VÔ HOẠT TỤ HUYẾT TRÙNG GÀ DÙNG MONTANIDE 50 LÀM CHẤT BỔ TRỢ MIỄN DỊCH Nguyễn Mạnh Thắng (1) , Nguyễn Ngọc Hải (2) , Trần Đình Từ (3) TÓM TẮT Độ dài miễn dịch và thời gian bảo quản của vacxin tụ huyết trùng nhũ dầu dùng montanide 50 làm chất bổ trợ miễn dịch đã được đánh giá, khảo sát trên gà thí nghiệm khi công cường độc bằng vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa và các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ thực địa (chủng LĐ06, BT01 và ĐH). Kết quả cho thấy sau 6 tháng tiêm vacxin, khi công cường độc bằng các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực cao như chủng Pa, BT01 , tỷ lệ bảo hộ cho gà thí nghiệm đạt từ 70% - 80%, trong khi đó toàn bộ gà đối chứng chết hết. Nếu công cường độc bằng chủng vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực thấp hơn như chủng LĐ06, ĐH, tỷ lệ bảo hộ cho gà thí nghiệm đạt từ 80% - 100%, tuy nhiên gà đối chứng vẫn sống từ 20% đến 40%. Sau 12 tháng bảo quản vacxin ở nhiệt độ từ 2 0 C – 8 0 C, tỷ lệ bảo hộ của vacxin cho gà thí nghiệm đạt 80% khi công cường độc bằng vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa. Nếu công cường độc bằng các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ thực địa thì vacxin sau 9 tháng bảo quản ở nhiệt độ từ 2 0 C – 8 0 C có khả năng bảo hộ cho gà thí nghiệm từ 80% đến 90%. Từ khoá: Tụ huyết trùng gà,Vacxin, Pasteurella multocida, Độ dài miễn dịch, Thời gian bảo quản, Phân lập, Độc lực, Tỷ lệ bảo hộ. Duration of immunity and storage of fowl cholera vaccine using montanide 50 such as adjuvant Nguyễn Mạnh Thắng , Nguyễn Ngọc Hải , Trần Đình Từ SUMMARY The duration of immunity and storage of fowl cholera vaccine using montanide 50 such as adjuvant were tested in chikens by challenged Pasteurella multocida strain Pa and isolated strains from field (LĐ06, BT01 và ĐH). The results showed that 6 months after vaccination, chickens were challenged by high virulent Pasteurella multocida strains such as Pa and BT01, the percentage of protection reachs to 70% - 80% in vaccinated chickens, all controlled chickens died. If chickens were challenged by less virulent Pasteurella multocida strains such as LĐ06 and ĐH, then the percentage of protection for vaccinated chickens reachs to 80% - 100%, but controled chickens also survive from 20% to 40%. After 12 months store in 2 0 C – 8 0 C, emulsion vaccine can to protect 80% chickens when challenged against a virulent Pasteurella multocida strain Pa. After 9 months store in 2 0 C – 8 0 C, emulsion vaccine can to protect chickens from 80% to 90% when challenged by Pasteurella multocida isolated from field strains such as LĐ06, BT01 và ĐH. Key words: Fowwl cholera,Vaccine, Pasteurella multocida, Duration of immunity, Storage, Isolate, Virulent, Percentage of protection. (1): Công ty thuốc thú y trung ương (Navetco),, (2): Khoa Chăn nuôi thú y-Đại học Nông Lâm Tp. HCM. (3): Hội Thú y Việt Nam. 2 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tụ huyết trùng gia cầm do vi khuẩn Pasteurella multocida gây nên. Tại nước ta, bệnh có mặt tại hầu hết các tỉnh thành gây nhiều thiệt hại về kinh tế cho các trang trại và hộ chăn nuôi gia đình (Nguyễn Xuân Bình, 1994; Lê Văn Tạo và cs, 2001; Sa Đình Chiến, 2001). Một trong các biện pháp làm giảm thiệt hại do bệnh gây ra là tiêm vacxin phòng bệnh. Để nâng cao hiệu quả phòng bệnh thì hiệu lực của vacxin phải được cải tiến. Thay thế chất bổ trợ phèn chua, keo phèn bằng chất bổ trợ nhũ dầu là một hướng đi đúng để tạo ra vacxin có chất lượng tốt hơn (McClimon và cs, 1994 Islam và cs, 2004 Akand và cs, 2004). Chúng tôi đã nghiên cứu sử dụng dung dịch montanide 50 để chế tạo thử nghiệm vacxin tụ huyết trùng nhũ dầu. Vacxin có hiệu lực tốt đối với gà, tuy nhiên trong thực tế sử dụng, ngoài yếu tố hiệu lực thì độ dài miễn dịch và độ dài bảo quan của vacxin cũng rất được quan tâm. Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát độ dài miễn dịch và độ dài bảo quản của vacxin tụ huyết trùng dùng montanide 50 làm chất bổ trợ miễn dịch. II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu: - Vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg phân lập từ gà bị bệnh THT ở Nam bộ, thuộc serotype A:1. - Vi khuẩn Pasteurella multocida chủng LĐ06, BT01 và ĐH được phân lập từ gà bị bệnh THT ở Tiền Giang và Long An, thuộc serotype A:1. - Vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa có nguồn gốc từ Viện Thú Y, được dùng để kiểm nghiệm vacxin tụ huyết trùng gia cầm. - Gà khoẻ mạnh được nuôi từ 1 ngày tuổi đến khi làm thí nghiệm. - Vacxin tụ huyết trùng vô hoạt nhũ dầu. - Các trang thiết bị cần thiết cho thí nghiệm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xác định độ dài miễn dịch của vacxin Tiêm vacxin vô hoạt nhũ dầu cho 10 gà với liều 1,0 ml/con, gà đối chứng được tiêm nước muối sinh lý trộn với dung dịch montanide 50 cũng với liều 1,0 ml/con. Sau khi tiêm vacxin 2 tháng, 4 tháng và 6 tháng gà thí nghiệm và gà đối chứng được công cường độc bằng vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa với liều ~300 CFU/con. Vào thời điểm 6 tháng sau khi tiêm vacxin, ngoài việc sử dụng vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa để công cường độc theo quy định của Cục thú y, chúng tôi còn sử dụng thêm các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ thực địa (LĐ06, BT01 và ĐH) để công cường độc cũng với liều ~300 CFU/con nhằm đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin đối với các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida này. 2.2.2. Phương pháp xác định độ dài bảo quản của vacxin Vacxin được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 0 C – 8 0 C. Sau thời gian bảo quản 3 , 6 , 9 và 12 tháng vacxin được lấy ra để kiểm tra hiệu lực trên gà bằng cách tiêm cho 10 gà với liều 1,0 ml/con, gà đối chứng được tiêm nước muối sinh lý trộn với dung dịch montanide cũng với liều 1,0 ml/con. Vào ngày thứ 21 sau khi tiêm vacxin dùng vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa công cường độc với liều ~300 CFU/con. Vào thời điểm 9 tháng bảo quản vacxin, ngoài việc sử dụng vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa công cường 3 độc theo quy định của Cục thú y, để đánh giá thêm khả năng bảo hộ của vacxin trên gà đối với các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ thực địa, chúng tôi sử dụng them các chủng vi khuẩn LĐ06, BT01 và ĐH để công cường độc cũng với liều ~300 CFU/con. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Độ dài miễn dịch của vacxin Chúng tôi khảo sát độ dài miễn dịch của 2 lô vacxin chế tạo thử nghiệm. Kết quả khảo sát độ dài miễn dịch của vacxin tụ huyết trùng gà dùng montanide 50 làm chất bổ trợ miễn dịch khi công cường độc bằng vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Hiệu lực của vacxin tụ huyết trùng nhũ dầu trên gà sau khi tiêm 2, 4 và 6 tháng Thời gian Liều công/con Lô thí nghiệm Số gà Số sống/tổng số Tỷ lệ bảo hộ (%) 2 tháng ~300CFU, chủng Pa Vacxin lô 01 10 con 9/10 con 90 Vacxin lô 02 10 con 8/10 con 80 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 4 tháng ~300CFU, chủng Pa Vacxin lô 01 10 con 9/10 con 90 Vacxin lô 02 10 con 9/10 con 90 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 6 tháng ~300CFU, chủng Pa Vacxin lô 01 10 con 7/10 con 70 Vacxin lô 02 10 con 8/10 con 80 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 Kết quả thí nghiệm cho thấy, sau 2 tháng tiêm vacxin nhũ dầu, tỷ lệ bảo hộ cho gà ở lô vacxin 01 là 90% và của lô vacxin 02 là 80%. Sau 4 tháng tiêm vacxin tỷ lệ bảo hộ cho gà ở lô vacxin 01 vẫn đạt 90%, của lô vacxin 02 là 90%, cao hơn so với tỷ lệ bảo hộ sau 2 tháng tiêm vacxin (80%), trong khi đó toàn bộ gà đối chứng chết hết. Sau 6 tháng tiêm vacxin tỷ lệ bảo hộ cho gà ở lô vacxin 01 chỉ đạt 70%, có giảm xuống so với tỷ lệ bảo hộ sau 2 tháng và 4 tháng tiêm vacxin, tỷ lệ bảo hộ cho gà ở lô vacxin 02 đạt 80%, thấp hơn so với thời điểm sau 4 tháng tiêm vacxin (90%) nhưng vẫn bằng tỷ lệ bảo hộ sau 2 tháng tiêm vacxin. Tại Việt Nam và trên thế giới, một số nghiên cứu về độ dài miễn dịch của vacxin tụ huyết trùng gia cầm dùng các chất bổ trợ nhũ dầu khác nhau cũng đã được thông báo. Năm 1994, Lê Lập và cộng sự đã chế tạo vacxin tụ huyết trùng gia cầm nhũ dầu (không nói rõ loại nhũ dầu) từ vi khuẩn Pasteurella multocida chủng N41 phân lập từ các tỉnh miền Trung. Tỷ lệ bảo hộ cho gà sau 4 tháng tiêm vacxin là 75%, sau 5 tháng đạt 60%. Kết quả nghiên cứu của Glunder G và cộng sự (2004) cho thấy sau 6 tháng tiêm vacxin tụ huyết trùng nhũ dầu (dùng dầu khoáng trộn với arlacel và tween làm chất bổ trợ miễn dịch) tỷ lệ bảo hộ cho gà thí nghiệm đạt 70%. Tỷ lệ bảo hộ của các loại vacxin tụ huyết trùng nhũ dầu này thấp hơn tỷ lệ bảo hộ của vacxin vô hoạt nhũ dầu (dùng montanide 50 làm chất bổ trợ miễn dịch) do chúng tôi chế tạo thử nghiệm vào cùng thời điểm khảo sát (bảng 1). 4 Ngoài chủng công cường độc là vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa theo quy định của Cục Thú y, chúng tôi còn sử dụng thêm các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ thực địa (LĐ06, BT01 và ĐH) để công cường độc cũng với liều ~300 CFU/con nhằm đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin đối với các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida này. Độc lực của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ thực địa đối với chuột bạch thấp hơn độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa. LD50 của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa đối với cuột bạch là 21 CFU/con, liều LD50 của vi khuẩn Pasteurella multocida của các chủng LĐ06, BT01 và ĐH lần lượt là 124 CFU/con; 36 CFU/con và 42 CFU/con. Kết quả được trình bày trong bảng .2. Bảng 2. Hiệu lực của vacxin tụ huyết trùng vô hoạt nhũ dầu trên gà sau 6 tháng tiêm vacxin Chủng công Liều công/con Lô thí nghiệm Số gà Số sống/ tổng số Tỷ lệ bảo hộ (%) Pa ~300CFU Vacxin lô 01 10 con 6/10 con 70 Vacxin lô 02 10 con 8/10 con 80 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 LĐ 06 ~300CFU Vacxin lô 01 10 con 9/10 con 90 Vacxin lô 02 10 con 10/10 con 100 Đối chứng 5 con 2/5 con 40 BT01 ~300CFU Vacxin lô 01 10 con 7/10 con 70 Vacxin lô 02 10 con 7/10 con 70 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 ĐH ~300CFU Vacxin lô 01 10 con 8/10 con 80 Vacxin lô 02 10 con 9/10 con 90 Đối chứng 5 con 1/5 con 20 Vào thời điểm 6 tháng sau khi tiêm vacxin, khi sử dụng các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ thực địa (LĐ06, BT01 và ĐH) công cường độ thì tỷ lệ bảo hộ cho gà có khác nhau ở các lô thí nghiệm. Đối với các chủng có độc lực thấp thì như LĐ06 hoặc ĐH thì tỷ lệ bảo hộ cho gà đạt cao, từ 80% đến 100%, tuy nhiên lô đối chứng có tới 20% hoặc 40% gà không chết. Trong khi đó, đối với các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực cao như Pa, BT01 thì tỷ lệ bảo hộ cho gà có thấp hơn, chỉ đạt từ 70% đến 80%, tuy nhiên toàn bộ gà đối chứng chết hết sau khi công cường độc. 3.2. Khảo sát độ dài bảo quản của vacxin Hiệu lực miễn dịch của 02 lô vacxin tụ huyết trùng gà dùng montanide 50 làm chất bổ trợ miễn dịch sau một thời gian bảo quản ở 2 0 C – 8 0 C được trình bày trong bảng 3. Bảng 3. Hiệu lực của vacxin tụ huyết trùng vô hoạt nhũ dầu trên gà sau một thời gian bảo quản khi công bằng vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa Thời gian bảo quản Lô thí nghiệm Số gà Liều công (chủng Pa) Số sống/ tổng số Tỷ lệ bảo hộ (%) 3 tháng Tiêm vacxin lô 01 10 con ~ 300 CFU 9/10 con 90 Tiêm vacxin lô 02 10 con 9/10 con 90 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 5 6 tháng Tiêm vacxin lô 01 10 con ~ 300 CFU 8/10 con 80 Tiêm vacxin lô 02 10 con 9/10 con 90 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 9 tháng Tiêm vacxin lô 01 10 con ~ 300 CFU 8/10 con 80 Tiêm vacxin lô 02 10 con 7/10 con 70 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 12 tháng Tiêm vacxin lô 01 10 con ~ 300 CFU 8/10 con 80 Tiêm vacxin lô 02 10 con 8/10 con 80 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 Sau 3 tháng bảo quản, tỷ lệ bảo hộ của 2 lô vacxin tụ huyết trùng vô hoạt nhũ dầu trên gà đạt 90% khi công cường độc bằng vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Pa, trong khi đó toàn bộ gà ở lô đối chứng chết hết. Vào thời điểm 6 tháng bảo quản, tỷ lệ bảo hộ trên gà thí nghiệm của lô vacxin 01 đạt 80%, có thấp hơn tỷ lệ bảo hộ của lô vacxin 01 sau khi bảo quản 3 tháng, tỷ lệ bảo hộ của lô vacxin 02 vẫn đạt 90%. Sau 12 tháng bảo quản tỷ lệ bảo hộ trên gà thí nghiệm của lô vacxin 01 giữ nguyên là 80%, không thay đổi so với tỷ lệ bảo hộ sau 6 tháng và 9 tháng bảo quản. Tỷ lệ bảo hộ trên gà thí nghiệm của lô vacxin 02 sau 12 tháng bảo quản đạt 80%, có giảm so với tỷ lệ 90% sau 6 tháng bảo quản. Tuy nhiên vào thời điểm 9 tháng sau khi bảo quản, tỷ lệ bảo hộ trên gà thí nghiệm của lô vacxin 02 chỉ đạt 70%, thấp hơn so với thời điểm bảo quản sau 12 tháng (80%). Vào thời điểm sau 9 tháng bảo quản vacxin, chúng tôi có sử dụng thêm các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ thực địa (LĐ06, BT01 và ĐH) để công cường độc nhằm kiểm tra lại khả năng bảo hộ của vacxin đối với các chủng vi khuẩn này trên gà và do một số khó khăn cũng như điều kiện kinh phí, chúng tôi chỉ sử dụng lô vacxin 02 để kiểm tra. Kết quả được trình bày trong bảng .4. Bảng 4: Hiệu lực của vacxin tụ huyết trùng vô hoạt nhũ dầu trên gà sau khi bảo quản 9 tháng Chủng công Liều công/con Lô thí nghiệm Số gà Số sống/ tổng số Tỷ lệ bảo hộ (%) Pa ~300CFU Tiêm vacxin lô 02 10 con 7/10 con 70 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 LĐ 06 ~300CFU Tiêm vacxin lô 02 10 con 9/10 con 90 Đối chứng 5 con 1/5 con 20 BT01 ~300CFU Tiêm vacxin lô 02 10 con 8/10 con 80 Đối chứng 5 con 0/5 con 0 ĐH ~300CFU Tiêm vacxin lô 02 10 con 9/10 con 90 Đối chứng 5 con 1/5 con 20 Khi sử dụng các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ thực địa (LĐ06, BT01 và ĐH) để công cường độc sau khi tiêm vacxin đã được bảo quản 9 tháng thì tỷ lệ bảo hộ cho gà không giống nhau ở các lô thí nghiệm. Tỷ lệ này dao động từ 70% đến 90% tùy thuộc vào chủng công cường độc. Khi dùng các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực cao như chủng Pa và BT01 để công thì tỷ lệ bảo bảo hộ cho gà lần lượt là 70% và 80% nhưng toàn bộ gà đối chứng chết hết. Trong khi đó, nếu sử dụng các 6 chủng vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực thấp hơn là LĐ06 và để công cường độc thì tỷ lệ bảo bảo hộ cho gà thí nghiệm lên tới 90%, tuy nhiên vẫn còn 20% gà ở lô đối chứng không chết. Theo quy định của Cục thú y, vacxin tụ huyết trùng gia cầm được coi là đạt tiêu chuẩn về hiệu lực nếu tỷ lệ bảo hộ ở gia cầm thí nghiệm đạt từ 50% trở lên. Như vậy, kết quả khảo sát của chúng tôi cho thấy khi bảo quản 12 tháng ở nhiệt độ từ 2 0 C đến 8 0 C, vacxin tụ huyết trùng vô hoạt nhũ dầu (dùng montanide 50 làm chất bổ trợ miễn dịch) do chúng tôi chế tạo thử nghiệm vẫn còn khả năng bảo hộ cho gà, đạt tiêu chuẩn theo như quy định của Cục thú y. IV. KẾT LUẬN Vacxin tụ huyết trùng vô hoạt nhũ dầu (dùng montanide 50 làm chất bổ trợ miễn dịch) do chúng tôi chế tạo thử nghiệm có độ dài miễn dịch đối với gà thí nghiệm là 6 tháng và độ dài bảo quản ở nhiệt độ từ 2 0 C – 8 0 C kéo dài tới 12 tháng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Xuân Bình, 1994. Tỷ lệ nhiễm bệnh tụ huyết trùng gia cầm theo lứa tuổi và mùa vụ tại Long An. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập I, số 4, trang 67 - 71. 2. Sa Đình Chiến, 2001. Nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Sơn La, một số đặc tính của Pasteurella multocida phân lập được, biện pháp phòng trị. Luận án tiến sĩ nông nghiệp. Hà Nội. 3. Lê Lập, lê Thị Thi, Phan Thanh Phượng, 1994. Hiệu lực miễn dịch của vacxin tụ huyết trùng gia cầm chủng N41 ở miền Trung Việt Nam. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập I, số 5, trang 51 – 54. 4. Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong Thú y, 1994. Nhà xuất bản Nông nghiệp – Bộ Nông nghiệp và CNTP. 5. Lê Văn Tạo, Hoàng Ngọc Cao, Cù Hữu Phú, Nguyễn Bích Thủy, 2001. Tình hình bệnh tụ hyết trùng gia cầm ở Nông Cống (Thanh Hóa) và lựa chọn vacxin phòng bệnh. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập VIII, số 4, trang 53 – 57. 6. Akand M.S.I., Choudhury K.A., Kabir S.M.L., Sarkar S.K. and Amin K.M.R., 2004. Development of washed cell fowl cholera vaccine in Bangladsh. International journal of Poultry Science 3. Pages: 534 - 537. 7. Glunder G., van der Ven H, Foulman A., 2004. Studies on the efficacy of different adjuvants in livestock specific bacterial vaccines for turkeys against Bordetella infection and onset of antibody titers in respect to the age of the turkey poults. Pol. Journal Vet. Sci. 7(2). Pages: 77-81. 8. Islam M.A., Samad M.A., Rahman M.B., 2004. Evaluation of alum precipitated formalin killed cholera vaccines with their immunologic responses in ducks. Inter. Jour. of Sci. Infor., 3(2). Pages: 140 – 143. 9. McClimon L.B., Glick B., Dick J.W., 1994. Effect of three commercially available adjuvants on the production of antibodies to Pasteurella mutocida in broilers. Avian Dis., 38 (2). Pages: 354 – 361. . công cường độc. 3.2. Khảo sát độ dài bảo quản của vacxin Hiệu lực miễn dịch của 02 lô vacxin tụ huyết trùng gà dùng montanide 50 làm chất bổ trợ miễn dịch sau một thời gian bảo quản ở 2 0 C. 1 ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA VẮC XIN VÔ HOẠT TỤ HUYẾT TRÙNG GÀ DÙNG MONTANIDE 50 LÀM CHẤT BỔ TRỢ MIỄN DỊCH Nguyễn Mạnh Thắng (1) , Nguyễn. dài bảo quan của vacxin cũng rất được quan tâm. Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát độ dài miễn dịch và độ dài bảo quản của vacxin tụ huyết trùng dùng montanide 50 làm chất bổ trợ miễn dịch.