TCNCKH 36 (3) - 2005 84 PHƯƠNG PHáP CHUYểN GEN MớI TĂNG TRIểN VọNG Sử DụNG ARNi TRONG LIệU PHáP ĐIềU TRị GEN Tạ Thành Văn Bộ môn Hóa-Hóa sinh- Trờng Đại học Y Hà Nội Ngày nay các nhà khoa học đã hiểu những nguyên tắc cơ bản của ARNi và các công ty dợc phẩm trên thế giới hiện đang nghiên cứu để tăng cờng khả năng ứng dụng công nghệ này in vivo. Vấn đề then chốt nhất để có thể để tiến tới áp dụng phơng pháp điều trị này trên lâm sàng phải có kỹ thuật chuyển tải ARNi vào trong tế bào một cách hiệu quả, kết hợp với các phơng pháp sàng lọc nhanh, chính xác. Đồng thời việc nghiên cứu tạo ra những phân tủ ARNi có khả năng bất hoạt gen đặc hiệu và hiệu quả cũng là một vấn đề hết sức quan trọng (1). Các nhà khoa học trên thế giới đã nhận ra tiềm năng to lớn của việc sử dụng ARNi trong liệu pháp điều trị gen. Một số công ty dợc phẩm đã công bố kết quả các công trình nghiên cứu mà họ đang tiến hành trong hội nghị về ARNi toàn Châu Âu tại London vào tháng 10 năm 2004. 1. Phơng pháp chuyển gen bằng kỹ thuật hóa học mới Hãng Ambion có kế hoạch đa ra sản phẩm là siPORTer-96, một thiết bị tạo điện trờng (electroporation) cho phép các nhà nghiên cứu đa ARNi vào trong các dòng tế bào mà khó đợc thực hiện bởi các phơng pháp khác nh các tế bào gốc hay các tế bào nổi (không bám vào đáy của các phơng tiện nuôi cấy). Các phơng pháp chuyển gen bằng phơng pháp hóa học (sử dụng các hóa chất có bản chất là lipid) đợc sử dụng thờng xuyên đối với các dòng tế bào trởng thành nhng lại không hiệu quả đối với các dòng tế bào gốc (2). Thiết bị tạo điện trờng tạo ra các xung điện để tạo ra các lỗ siêu nhỏ ở màng tế bào, qua đó các phần tử có thể dễ dàng xâm nhập vào trong tế bào. Các lỗ siêu nhỏ này sau đó đợc đóng lại nhờ những xung điện trong những điều kiện đặc biệt để cho phép các tế bào hồi phục và tiếp tục phát triển. Ưu điểm của phơng pháp này là quá trình đa gen từ ngoài vào độc lập với chu trình phân chia của tế bào và tác dụng của ARNi trên quá trình thể hiện gen của tế bào đợc phát hiện sớm chỉ trong khoảng một vài giờ sau khi ARNi đợc đa từ ngoài vào. Để tăng cờng tỷ lệ sống của tế bào sau khi chuyển gen nhờ tác dụng của điện trờng, công ty đã nghiên cứu và sản xuất dung dịch đệm cho kỹ thuật chuyển gen này. Dung dịch đệm này có độ dẫn điện thấp và có thành phần giống nh bào tơng. Chính vì vậy mà các lỗ siêu nhỏ sau khi đợc tạo ra, đợc hàn gắn lại nhanh chóng. Dung dịch đệm này cho phép thu hồi lại 65-95% tế bào sống sau khi đợc chuyển gen và tỷ lệ bất hoạt gen đạt tới 75-99%. Nghiên cứu tìm ra phơng pháp chuyển siARN mới, có hiệu quả cao là hớng nghiên cứu đợc nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nhằm mục đích bất hoạt một gen đích bấy kỳ nào đó trong tế bào. Song song với hớng nghiên cứu này, việc cần thiết là phải chế tạo ra ARNi đặc hiệu với gen đích và có tác dụng kéo dài. Đồng thời cũng cần thiết phải nghiên cứu tác dụng phụ do ARNi gây ra khi nó đợc chuyển đến cơ quan đích. Một trong những tác dụng phụ đợc các nhà khoa học chú ý nhiều là TCNCKH 36 (3) - 2005 ARNi tạo ra sự đáp ứng của interferon và hậu quả là dẫn đến chết tế bào. Khắc phục tình trạng này, các nhà khoa học đã chế tạo ra các dẫn xuất ARNi để hạn chế tác dụng kích thích sự đáp ứng của interferon nhng lại làm tăng cờng và kéo dài tác dụng bất hoạt gen. 2. Tăng cờng tác dụng của ARNI Công ty Invitrogen đã nghiên cứu tăng cờng tiềm năng áp dụng của ARNi và đã cho ra đời sản phẩm là Block-iT TM transfection control kit (hình 1) cho phép tối u hóa các điều kiện đa ARNi vào trong tế bào đồng thời cũng cho phép nguời sử dụng theo dõi hiệu quả và sự khác biệt giữa các lần thí nghiệm. Lipfect- amine TM 2000 trong kit này cho phép tăng cờng hiệu quả của việc chuyển gen còn Block-iT Fluorescent oligonucleotide mang tín hiệu huỳnh quang mạnh cho phép phát hiện đợc các tế bào đã đợc chuyển gen. Cho đến nay, đây là một kit cho phép chúng ta kiểm tra hiệu quả của việc chuyển gen một cách dễ dàng và đơn giản nhất với hiệu suất chuyển gen đạt tới 90-95%. Kỹ thuật hiện tại đã cho phép có thể thực hiện 10 ngàn thí nghiệm chuyển gen chỉ trong vòng một ngày và quy trình chuyển gen đang đợc phát triển theo hớng tự động hóa. Đồng thời sự ra đời của phức hợp ARNi tàng hình, sản phẩm của sự biến đổi cấu trúc và đặc tính hóa học của các dẫn xuất ARNi trớc đó đã cho phép bất hoạt các gen đích một cách hiệu quả, bền và hạn chế đợc các tác dụng phụ. Các nhà khoa học về liệu pháp điều trị gen cho rằng sản phẩm này hứa hẹn một triển vọng ứng dụng điều trị lớn của ARNi trong trên lâm sàng. Các chuyên gia thiết kế Block-iT ARNi xác định những vùng gen đặc hiệu nhất trên gen đích để thiết kế các phân tử ARNi tàng hình có chiều dài khoảng 25 nucleotide bằng phần mềm phân tích ARNi. Cho đến nay, trong th viện ARNi (ARNi library) đã có trên 10 ngàn siARN đặc hiệu với trên 5 ngàn gen đích khác nhau. Nghiên cứu sản xuất ra ARNi đặc hiệu với các gen đích trải dài trên cả genome của tế bào là đích mà các nhà khoa học đang hớng đến. Các chuyên gia này cũng nghiên cứu phát triển các kỹ thuật đánh giá hiệu quả tác dụng của ARNi khi nó đợc đa vào trong tế bào. Đây là hớng nghiên cứu đang đợc chú ý nhằm đánh giá hiệu quả tác dụng của các thuốc để góp phần tăng cờng khả năng tác dụng của thuốc cũ và nghiên cứu ứng dụng điều trị các thuốc mới. Hình 1: Mô hình cơ chế bất hoạt gen của hệ thống BLOCK-iT ARNi sau khi đợc chuyển vào trong tế bào (sản phẩm của hãng Invitrogen) 85 TCNCKH 36 (3) - 2005 86 3. Triển vọng ứng dụng trong điều trị Nhiều công ty dợc phẩm hàng đầu trên thế giới đang đầu t nghiên cứu ứng dụng liệu pháp điều trị gen trên lâm sàng trong đó việc sử dụng ARNi đợc coi là một trong các hớng u tiên. Một số vấn đề then chốt trong quá trình này cần phải đợc làm sáng tỏ: i) Thiết kế tạo ra ARNi đặc hiệu với gen đích; ii) Nghiên cứu đặc tính dợc động học và vận chuyển ARNi; iii) Phơng pháp đánh giá hiệu quả tác dụng của ARNi. ở thực nghiệm in vivo, khi ARNi đợc tiêm vào trong cơ thể động vật (môi trờng trong cơ thể hoàn toàn khác với môi trờng nuôi cấy tế bào với rất nhiều các nuclease trong huyết thanh của động vật), ARNi sẽ bị thủy phân nhanh chóng trớc khi nó đợc đa đến cơ quan đích. Chính vì vậy, mục tiêu mà các nhà khoa học đang hớng đến là nghiên cứu tạo ra các chế phẩm ARNi bền vững nhằm cải thiện các đặc tính dợc động học bằng cách biến đổi cấu trúc hóa học của các đơn vị nucleotide. Từ nguyên tắc này, một số chế phẩm ARNi mới đã đợc tạo ra. Trong đó phải kể đến SiARN-027 của công ty SiARN Therapeutics, USA, một sản phẩm có khả năng bất hoạt gen của yếu tố phát triển tế bào nội mạc góp phần điều trị một số bệnh liên quan đến quá trình thoái hóa ở tuổi già (macular). SiARN-027 có thể đợc tiêm trực tiếp vào mắt và tránh đợc phá hủy bởi các nuclease. Công ty này cũng đã tạo ra đợc một số các dạng biến đổi của ARNi khác hiện đã đợc thử nghiệm thành công trên mô hình động vật và đang tiến tới thử nghiệm lâm sàng. Trong số này phải kể đến anti-HCV siARN, các ARNi bất hoạt gen của các yếu tố phát triển khối u, quá trình thoái hóa thần kinh (Huntington, Parkinson, Alzheimer và Spinocerebellar ataxia 1). Cần phải nhấn mạnh rằng, sở dĩ có sự thành công trong lĩnh vực này là do sự kết hợp giữa hai yếu tố: công nghệ adenoviral siARN và các kỹ thuật Y sinh học. Trong đó các công nghệ và kỹ thuật đều nhằm hớng đến việc giải quyết các vấn đề do Y học lâm sàng đặt ra là tạo ra thuốc để điều trị bệnh. Tài liệu tham khảo 1. Phan Thị Phi Phi. Tắt (ức chế) gen thông qua các phân tử ARN nhỏ. Tạp chí nghiên cứu y học 22, 89-93, (2003). 2. Tạ Thành Văn. Hệ thống chuyển tải gen và ứng dụng trong liệu pháp điều trị gen. Tạp chí nghiên cứu y học 24, 107- 110, (2003). 3. Nina Flanagan. Enhancing ARNis potential. Genetic engineering news 24 (17), 1-24, (2004). . các phân tử ARN nhỏ. Tạp chí nghiên cứu y học 22, 8 9-9 3, (2003). 2. Tạ Thành Văn. Hệ thống chuyển tải gen và ứng dụng trong liệu pháp điều trị gen. Tạp chí nghiên cứu y học 24, 10 7- 110, (2003) TCNCKH 36 (3) - 2005 84 PHƯƠNG PHáP CHUYểN GEN MớI TĂNG TRIểN VọNG Sử DụNG ARNi TRONG LIệU PHáP ĐIềU TRị GEN Tạ Thành Văn Bộ môn Hóa-Hóa sinh- Trờng Đại học Y Hà Nội Ngày nay các nhà khoa học. (sản phẩm của hãng Invitrogen) 85 TCNCKH 36 (3) - 2005 86 3. Triển vọng ứng dụng trong điều trị Nhiều công ty dợc phẩm hàng đầu trên thế giới đang đầu t nghiên cứu ứng dụng liệu pháp