TCNCYH 29 (3) - 2004 13 Phát hiện virut viêm não mới từ dịch não tuỷ của bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam Phan Thị Ngà 1 , Kouichi Morita 2 1 Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng, Hà Nội 2 Viện Y học Nhiệt đới, Trờng Đại học Nagasaki Nhật Bản Trong năm 2002, có 2 chủng virut Arbo mới đợc phân lập từ dịch não tuỷ (DNT) của bệnh nhân có hội chứng não cấp (HCNC) ở miền Bắc Việt Nam bằng dòng tế bào muỗi C6/36. Virut hình cầu, có vỏ (envelop), kích thớc khoảng 50 nm, vật liệu di truyền là ARN. Trình tự vật liệu di truyền của chủng virut có ký hiệu 02VN208 không giống trình tự của các chủng virut đã công bố trên thế giới. Cặp mồi đặc hiệu (specific) đợc thiết kế từ một phần trình tự clone gen của chủng virut có ký hiệu 02VN208 để định loại những chủng virut phân lập từ bệnh nhân và từ muỗi năm 2002 bằng kỹ thuật RT-PCR. Có 2 chủng virut phân lập từ dịch não tuỷ (DNT) của bệnh nhân HCNC và có 4 chủng virut phân lập từ muỗi đợc xác định dơng tính; Kết quả này là một bằng chứng cho thấy đây có thể là một loại virut Arbo do muỗi truyền gây viêm não, mới đợc phát hiện ở Việt Nam. Virut Nam Định là tên của virut đợc đặt theo tên địa phơng của bệnh nhân. Những nghiên cứu về huyết thanh học, siêu cấu trúc của virut cần đợc thực hiện để có cơ sở phân loại virut Arbo mới này. I. Đặt vấn đề Viêm não do virut là một trong những nguyên nhân gây tử vong ở trẻ em trong khu vực châu á, đặc biệt là viêm não do virut viêm não Nhật Bản (VNNB), tuy nhiên chỉ có khoảng 20 60% trờng hợp bị viêm não đợc xác định là do virut VNNB, số còn lại có thể là viêm não do virut khác [3, 8]. Tơng tự nh vậy ở Việt Nam, theo số liệu thống kê hằng năm có khoảng 2000 3000 trờng hợp bị hội chứng não cấp (HCNC) do virut, khoảng 30 50% số trờng hợp bị HCNC đợc xác định là do virut VNNB bằng kỹ thuật MAC-ELISA, các virut gây viêm não tiềm ẩn khác vẫn cha đợc phát hiện ngoài virut VNNB và virut đờng ruột [1, 2]. Năm 1971, một số chủng virut thuộc nhóm Alpha đợc phân lập từ muỗi ở miền Bắc Việt Nam, có giả thiết rằng nó có thể là một virut Arbo mới gây HCNC [6], tuy nhiên cho đến nay vẫn cha phân lập đợc virut Alpha từ bệnh nhân Việt Nam (số liệu phòng thí nghiệm). Do vậy mục tiêu nghiên cứu của đề tài là phát hiện virut viêm não mới do muỗi truyền từ DNT của bệnh nhân có HCNC cha rõ căn nguyên. II. Nguyên vật liệu và phơng pháp 1. Vật liệu: Có 148 mẫu DNT đợc lấy từ bệnh nhân có HCNC (3/2002 11/2002) tại Khoa Lây, Viện Nhi trung ơng. Các mẫu DNT này đợc xác định không có kháng thể IgM kháng virut VNNB bằng kỹ thuật MAC-ELISA. Huyết thanh đợc lấy vào ngày thứ 5 của bệnh và sau khi khỏi bệnh trên một năm (của bệnh nhân - chủng virut có ký hiệu 02V208 đợc phân lập từ DNT). Kháng thể kháng virut nhóm Alpha, Flavi, Bunya, kháng thể gắn FITC do trung tâm kiểm soát bệnh tật CDC, Colorado Mỹ cung cấp. Kháng thể định loại virut VNNB do Viện VSDTTƯ, Hà Nội cung cấp. Sinh phẩm cho kỹ thuật RT-PCR và cặp mồi đặc hiệu định loại virut VNNB do Viện Y học Nhiệt đới, Nagasaki cung cấp (841 N và 2670 R). TCNCYH 29 (3) - 2004 Cặp mồi đặc hiệu với chủng virut có ký hiệu 02VN208 đợc thiết kế từ chuỗi kéo dài để tổng hợp một sản phẩm PCR khoảng 400 bp. Hoá chất cho kỹ thuật nhuộm âm bản do Viện VSDTTƯ, Hà Nội cung cấp. Dòng tế bào muỗi C6/36. tế bào Vero và BHK 21, tế bào thần kinh chuột (Mouse neuronal cells) môi trờng nuôi tế bào, các trang thiết bị và vật liệu cần thiết khác. 2. Phơng pháp: Phân lập virut: Mẫu DNT đợc làm tan băng, gây nhiễm vào tế bào C6/36 [4, 7], quan sát tế bào trong 5 ngày. Chai tế bào gây nhiễm có hình ảnh huỷ hoại tế bào, nớc nổi tế bào gây nhiễm đợc lọc qua lọc 0,22 nm, hỗn dịch lọc đợc cấy truyền lần thứ hai trên tế bào C6/36. Nếu có hình ảnh huỷ hoại tế bào sau lần cấy truyền này chai tế bào đợc lu giữ ở 70 o C để định loại virut. Định loại virut bằng kỹ thuật ELISA, huỳnh quang, kỹ thuật RT-PCR. Xác định hình thái virut bằng kính hiển vi điện tử với kỹ thuật nhuộm âm bản. Xác định sự thích ứng của virut trên động vật phòng thí nghiệm (chuột ổ), các dòng tế bào thờng trực bằng thử nghiệm đám hoại tử (Plaque Assay). Sử dụng dòng tế bào BHK 21 để thực hiện kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử, kết quả dơng tính khi huyết thanh ở độ pha loãng 1/10 làm giảm 90% đám hoại tử. Virut đợc tinh chế từ nớc nổi tế bào gây nhiễm virut bằng Polyethylene Glycol (PEG) 6.000 Sucrose Gradient để tách chiết vật liệu di truyền theo phơng pháp của Chapon [5], sử dụng enzym Dnase và Rnase xác định vật liệu di truyền của virut. Trình tự vật liệu di truyền của virut đợc xác định bằng những bộ mồi ngẫu nhiên sử dụng TOPOTA cloning kit của In-Vitrogen, Mỹ. So sánh trình tự nucleotit của virut với trình từ nucleotit của những virut đã đợc công bố trong ngân hàng số liệu. IV. Kết quả Kết quả phân lập virut bằng tế bào C6/36. Hình 1. Hình ảnh chủng virut có ký hiệu 02VN208 đợc phát hiện bằng kính hiển vi điện tử với kỹ thuật nhuộm âm bản (mũi tên chỉ hạt virut X 150.000 ) 14 TCNCYH 29 (3) - 2004 Từ 148 mẫu dịch não tuỷ của bệnh nhân có HCNC năm 2002, không phát hiện đợc kháng thể IgM kháng virut VNNB bằng kỹ thuật MAC-ELISA, sử dụng tế bào C6/36 phân lập đợc 4 chủng virut VNNB và 2 chủng virut không định loại đợc với các kháng thể kháng virut nhóm Alpha, Flavi, Bunya. Hai chủng virut không định loại đợc có ký hiệu 02VN193 và 02VN208. Hình thái virut đợc xác định bằng kính hiển vi điện tử theo phơng pháp nhuộm âm bản, hai chủng virut này có hình thái giống nhau: virut hình cầu, có vỏ, kích thớc khoảng 50 nm. Kết quả xác định virut. Trong nghiên cứu này chủng virut có ký hiệu 02VN208 đợc chọn để xác định các đặc tính của virut. Kết quả thực nghiệm cho thấy chủng virut này không gây liệt chuột, nhng virut thích ứng trên tế bào C6/36 và nhiều dòng tế bào của động vật có vú khác đặc biệt là dòng tế bào thần kinh chuột. Sự thích ứng của virut trên các dòng tế bào thờng trực đợc khẳng định bằng thử nghiệm đám hoại tử tế bào và kỹ thuật RT-PCR. Bằng kỹ thuật trung hoà, xác định ở độ pha loãng 1/10 của huyết thanh làm giảm 90% đám hoại tử, nh vậy kháng thể trung hoà kháng virut trong mẫu huyết thanh đợc lấy sau khi khỏi bệnh hơn một năm vẫn còn tồn tại và có phản ứng đặc hiệu với chủng virut có ký hiệu 02VN208. Vật liệu di truyền của virut đợc kiểm tra với enzym Rnase và Dnase. Enzym Rnase đã tiêu huỷ toàn bộ vật liệu di truyền của virut, khẳng định virut có vật liệu di truyền là ARN. So sánh với trình tự vật liệu di truyền của chủng virut này với các chủng virut đã công bố trên thế giới trong ngân hàng số liệu, xác định trình tự vật liệu di truyền của nó không giống với trình tự vật liệu di truyền của các chủng virut đã công bố, chỉ có 40% tơng tự nh trình tự vật liệu di truyền của virut Corona. Cặp mồi đặc hiệu đợc thiết kế từ chủng virut có ký hiệu 02VN208 đợc dùng để kiểm tra với những chủng virut phân lập trong năm 2002 từ DNT của bệnh nhân có HCNC và từ muỗi bằng kỹ thuật RT-PCR. Xác định có 6 chủng virut dơng tính với cặp mồi này trong đó có 2 chủng virut phân lập từ DNT bệnh nhân HCNC (chủng virut có ký hiệu 02VN193, 02VN208) và 4 chủng virut phân lập từ muỗi Culex Tritaeniorhynchus và Culex Vishnui (chủng virut có ký hiệu 02VN9, 02VN18, 02VN178 và 02VN108). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 2. Kết quả định loại các chủng virut phân lập năm 2002 bằng cặp mồi đặc hiệu với chủng virut có ký hiệu 02VN208 (sản phẩm PCR khoảng 400 bp) 15 TCNCYH 29 (3) - 2004 Ghi chú các cột gen kiểm tra sản phẩm PCR trên Agarose 1%: 1: Thang chuẩn DNA 100 bp; 2: Chứng dơng (02VN208); 3: 02VN193, 4: 02VN 9; 5: 02VN18, 6: 02VN178, 7: 02VN180, 8: vi rut VNNB; 9: Chứng âm; 10: Thang chuẩn DNA 1 kb) IV. Bàn luận Trong nghiên cứu này có 2 chủng virut Arbo mới có vật liệu di truyền là ARN đợc phân lập bằng dòng tế bào muỗi C6/36. Trình tự vật liệu di truyền của chủng virut này đợc xác định không giống trình tự vật liệu di truyền của các virut đã đợc công bố trong ngân hàng số liệu, nh vậy đây là một chủng virut mới đợc phát hiện ở Việt Nam cũng nh trên thế giới. Kết quả xác định dơng tính với các chủng virut phân lập từ bệnh nhân và từ muỗi năm 2002 bằng cặp mồi đặc hiệu với chủng virut có ký hiệu 02VN208 là cơ sỏ để khẳng định đây là virut gây HCNC do muỗi truyền [hình 2]. Kiểm tra một số chủng virut phân lập từ DNT của bệnh nhân HCNC trong năm 2003, xác định có 1 chủng dơng tính với cặp mồi này (số liệu phòng thí nghiệm). Tên của virut đợc đặt theo tên địa phơng của bệnh nhân, chủng virut có ký hiệu 02VN208 có tên là virut Nam Định. Hai chủng virut Arbo mới phân lập từ bệnh nhân HCNC trong mùa dịch viêm não hè năm 2002, cả hai bệnh nhân hồi phục hoàn toàn sau điều trị. Do chẩn đoán bằng phân lập virut thờng ít đạt kết quả (bảng 1), nên việc chế tạo sinh phẩm cho kỹ thuật chẩn đoán và giám sát huyết thanh học cần đợc đề cập tới trong những nghiên cứu tiếp theo để ứng dụng cho chẩn đoán, giám sát huyết thanh học làm cơ sở để xác định dịch tễ, lâm sàng HCNC do virut Arbo mới này. 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình3. Kết quả xác định sự nhân lên của virut trên tế bào thần kinh chuột gây nhiễm với chủng virut có ký hiệu 02VN208 (sản phẩm PCR khoảng 400 bp) Ghi chú các cột gen kiểm tra sản phẩm PCR trên Agarose 1%: 1: Thang chuẩn DNA 100 bp; 2: Chứng dơng (02VN208); 3 - 7: ARN của virut trong nớc nổi tế bào gây nhiễm chủng virut có ký hiệu 02VN208 sau 1, 2, 3, 4 và 5 ngày; 8: Chứng âm. V. Kết luận 1. Virut Arbo mới đợc phân lập từ DNT của bệnh nhân có HCNC năm 2002 có đặc điểm: hình cầu, có vỏ, kích thớc khoảng 50 nm, vật liệu di truyền đợc xác định là ARN. 2. Virut thích ứng trên tế bào muỗi C6/36, BHK-21và đặc biệt là tế bào thần kinh chuột. Trình tự vật liệu di truyền của virut không giống 16 TCNCYH 29 (3) - 2004 17 trình tự của các chủng virut đã công bố trong ngân hàng số liệu, nó là một chủng Arbo virut mới đợc phát hiện ở Việt Nam. Đề tài đợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm virut Viêm não, Khoa Virut, Viện VSDTTƯ, Hà Nội, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Y tế và Viện VSDTTƯ. Các tác giả xin trân trọng cảm ơn sự hợp tác trong nghiên cứu này của: - Tập thể cán bộ Khoa lây Viện Nhi Trung ơng. - PGS TS. Nguyễn Kim Giao, các đồng nghiệp của Phòng Kính hiển vi điện tử, Phòng thí nghiệm Virut viêm não, Khoa Virut Viện VSDTTƯ. - Tiến sĩ Manmohan Parida, Khoa Virut, Viện Y học Nhiệt đới, Nagasaki, Nhật Bản cho sự trợ giúp về kỹ thuật sequencing tại Nagasaki. - Trung tâm kiểm soát bệnh tật CDC, Colorado Mỹ. Tài liệu tham khảo 1. Phan Thị Ngà, Nguyễn Thị Kiều Anh, Vơng Đức Cờng, Vũ Sinh Nam, Phạm Thị Minh Hằng, Trần Văn Tiến. 2002. Giám sát, chẩn đoán Viêm não Nhật Bản ở Việt Nam (2000 2001), Tạp chí Y học dự phòng, tập XII, số 4 (55 ), 2002, tr 5 11. 2. Nguyễn Thị Hiền Thanh. 2003. Bớc đầu tìm hiểu căn nguyên gây viêm màng não ở trẻ em do một số virut đờng ruột. Tạp chí Y học dự phòng, tập XIII, số 4 (61): 5-12. 3. Boquan C. and Sanju T. 1996. Arbovirus survey in China in recent ten years. Chinese Medical Journal, 109 (1): 13 15. 4. Calisher C. H., Shope R. E., and Walton T.E. 1988. Cell cultures for diagnosis of Arbovirus infections in livestock and wildlife. Journal of Tissue Culture Methods, Vol. 11, No. 3: 157 - 163. 5. Chapon C., Cech T. R., Zaug A. J. 1997. Polyadenylation of telomerase RNA in budding yeast. RNA 3:1337 1351. 6. Ha D. Q., Calisher C. H., Tien P. H., Karabatsos N., and Gubler D. J. 1995. Isolation of a newly recognized Alphavirus from mosquitoes in Vietnam and evidence for human infection and disease. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53 (1): 100 -104. 7. Igarashi, A. (1978). Isolation of singls Aedes Albopictus cell clone sensitive to Dengue and Chikungunyaviruses. J. Gen. Virol. 40: 531 544. 8. Mackenzie J. S., Chua K. B., Daniels P. W., Eaton B. T., field H. E., Hall R. A., Halpin K., Johansen C. A., Kirkland P. D., Lam S. K., McMinn P., Nisbet D. J., Paru R., Pyke A. T., ritchie S. A., siba P. Smith d. w., Smith G. a., Hurk A. F., Wang L. F., Williams D. T. 2001. Emerging viral Diseases of Southeast Asia and the Western Pacific. Emerging Infectious Disease, Vol. 7, No. 3:497 504. Summary Detection of new viral encephalitis from Cerebrospinal fluids of acute encephalitis syndrome patients in North Vietnam Two new Arbo viruses were isolated from cerebrospinal fluids of acute encephalitis syndrome patients in the North Vietnam in 2002 by C6/36 cells. It was determined spherical, envelope and RNA virus. The sequence of the virus did not homology with any known sequences that are available in the data bank. Specific primer pair was designed for RT-PCR to examine unknown human and mosquito isolates in 2002. Four mosquito and 2 human isolates were confirmed positive by the primer pair indicating the virus to be a new Arbovirus. Nam Dinh virus was named after patients locality. Further study on serology, ultramorphology should be needed in order to have sufficient data to classify this new Arbovirus in Vietnam. . 29 (3) - 2004 13 Phát hiện virut viêm não mới từ dịch não tuỷ của bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam Phan Thị Ngà 1 , Kouichi Morita 2 1 Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng,. Trong năm 2002, có 2 chủng virut Arbo mới đợc phân lập từ dịch não tuỷ (DNT) của bệnh nhân có hội chứng não cấp (HCNC) ở miền Bắc Việt Nam bằng dòng tế bào muỗi C6/36. Virut hình cầu, có vỏ (envelop),. tài là phát hiện virut viêm não mới do muỗi truyền từ DNT của bệnh nhân có HCNC cha rõ căn nguyên. II. Nguyên vật liệu và phơng pháp 1. Vật liệu: Có 148 mẫu DNT đợc lấy từ bệnh nhân có HCNC