Sự tạo củ lily in vitro và sự sinh trởng của cây lily trồng từ củ in vitro Research on production of in vitro lily bulblet and growth of plants derived from them Nguyễn Thị Lý Anh Summary The experiments were carried out on two exotic lily varieties: Star Gazer and Royal Justice.Using tissue culture method for production of bulblet shows that: in dark condition, medium culture MS ( 1962) plus 12% sucrose is best for bulblet formation from 8-10 week old shoots. After harvest, the in vitro bulblets with weight > 1g were treatmented by low temperature ( 5 O C) in 3 months. Plants derived from these bulblets growth very well and bulbs from them have good quality. Key words: exotic lily, tissue culture, bulblets. 1. Đặt vấn đề Hiện nay trên thị trờng hoa tơi của nớc ta, hoa lily (loa kèn màu) đã trở thành loại hoa đợc a thích nhất bởi vẻ đẹp sang trọng, màu sắc phong phú hấp dẫn, hơng thơm mát dịu và độ bền hoa cắt cao. Hoa lily cũng đã đợc trồng thành công ở nhiều nơi nh Đà Lạt, Sa Pa, Hà Nội. Tuy nhiên, việc sản xuất loại hoa này ở nớc ta còn nhiều hạn chế về diện tích, năng suất, sản lợng dẫn tới giá thành hoa cắt cành còn khá cao (20-30 nghìn đồng/cành). Nguyên nhân chính là do chúng ta cha chủ động đợc khâu sản xuất giống, chủ yếu phải nhập nội củ giống từ nớc ngoài với chi phí ngoại tệ lớn. Do đó việc nghiên cứu nhân nhanh giống hoa lily là hợp lý và rất cần thiết. ở Việt Nam, việc nhân giống bằng phơng pháp tạo củ in vitro đã đợc thực hiện trên hoa loa kèn (Nguyễn Thị Nhẫn & cs, 1999) và trên một số giống hoa lily nhập nội (Nguyễn Thái Hà & cs, 2003). Nhng sự sinh trởng, phát triển của cây lily trồng từ củ in vitro và khả năng tạo củ giống thơng phẩm của chúng hầu nh cha đợc đề cập. Vì vậy, nghiên cứu này đợc tiến hành nhằm góp phần vào việc sản xuất củ giống lily thơng mại ở Việt Nam. 2. phơng pháp nghiên cứu Giống hoa lily: Oriental hybrid Star Gazer hoa màu đỏ, có hơng thơm và giống Longiflorum x Asiatic Royal Justice hoa màu vàng. Chồi và củ in vitro của hai giống hoa này đợc chọn làm vật liệu cho các thí nghiệm. Môi trờng nuôi cấy là môi trờng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung đ ờng sacaroza với các nồng độ khác nhau để cảm ứng tạo củ từ các chồi đơn in vitro có tuổi chồi khác nhau. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng nuôi 25- 27 o C, độ ẩm phòng nuôi 70%, cờng độ chiếu sáng: 3000lux, thời gian chiếu sáng phụ thuộc vào từng nội dung nghiên cứu. Các củ in vitro sau khi thu hoạch đợc xử lý ở nhiệt độ 5 0 C, với các thời gian xử lý khác nhau và đợc trồng vào vụ Xuân trong nhà lới có mái che với chế độ nhiệt độ và ánh sáng phụ thuộc điều kiện tự nhiên. Mỗi công thức thí nghiệm đều đợc nhắc lại 3 lần, mỗi lần 40 mẫu và kết quả thực nghiệm đợc xử lý thống kê bằng chơng trình IRRSTART. Các thí nghiệm đợc tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, tế bào thực vật và vờn thực nghiệm của Viện Sinh học nông nghiệp, trờng Đại học Nông nghiệp I. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. ảnh hởng của nồng độ đờng và chế độ chiếu sáng đến sự hình thành củ in vitro Bảng 1. ảnh hởng của hàm lợng đờng và chế độ chiếu sáng đến sự tạo củ in vitro (sau 10 tuần nuôi cấy) 3% saccaroza 6% saccaroza 9% saccaroza 12% saccaroza C đờng Chỉ tiêu Giống CĐCS A B A B A B A B 16 giờ sáng /8 giờ tối 1,00 0,11 1,20 0,69 1,70 0,89 2,50 1,10 Royal Justice Tối hoàn toàn 1,10 0,15 1,50 0,53 2,00 1,05 3,00 1,25 16 giờ sáng /8 giờ tối 1,01 0,10 1,15 0,65 1,50 0,90 2,00 1,07 Royal Justice Tối hoàn toàn 1,02 0,15 0,65 0,43 1,50 1,00 2,70 1,20 Ghi chú: A: hệ số nhân củ (củ/chồi), B: khối lợng trung bình củ (g/củ). CĐCS: Chế độ chiếu sáng Các chồi lily 8 tuần tuổi đợc sử dụng thí nghiệm để tạo củ in vitro. Trên cả hai giống nghiên cứu, tỷ lệ tạo củ đều đạt 100% ở tất cả các công thức thí nghiệm. Nhng sự tăng nồng độ đờng saccaroza trong môi trờng nuôi cấy có ảnh hởng rõ rệt đến sự hình thành củ in vitro. Trong phạm vi thí nghiệm, ở nồng độ đờng càng cao quá trình tích luỹ chất dinh dỡng vào củ in vitro càng mạnh mẽ, đặc biệt trong điều kiện tối hoàn toàn. Điều này đợc thể hiện qua khối lợng trung bình củ và hệ số nhân củ đều đạt lớn nhất ở công thức có bổ sung 12% đờng khi đặt trong điều kiện không chiếu sáng (bảng 1). 3.2. Nghiên cứu ảnh hởng của tuổi chồi nuôi cấy đến sự hình thành củ in vitro Không chỉ nồng độ đờng của môi trờng nuôi cấy và chế độ chiếu sáng mà cả tuổi chồi in vitro cũng có tác động mạnh mẽ đến sự tạo củ. Các chồi 10 tuần tuổi cho khối lợng trung bình củ tốt nhất, còn chồi 8 tuần tuổi lại cho hệ số nhân củ tốt nhất. Các chồi nuôi cấy trên môi trờng nhân nhanh trong thời gian ngắn (6 tuần) hay quá dài (12 tuần) đều không đạt hiệu quả cao khi chuyển sang tạo củ. Quy luật này thể hiện trên cả hai giống hoa Star Gazer và Royal Justice. Nh vậy, tuổi chồi là nhân tố rất cần đợc quan tâm và các chồi sau nhân nhanh từ 8 - 10 tuần là phù hợp để tạo củ in vitro. Bảng 2. ảnh hởng của tuổi chồi đến sự tạo củ in vitro ( sau 10 tuần nuôi cấy) 6 tuần tuổi 8 tuần tuổi 10 tuần tuổi 12 tuần tuổi Chồi CT Giống A B A B A B A B Star Gazer 1,11 1,15 3,00 1,25 1,50 1,63 1,40 0,85 Royal Justice 1,20 1,05 2,70 1,20 1,50 1,50 1,33 0,75 Ghi chú: Tạo củ trong điều kiện không chiếu sáng CT: chỉ tiêu theo dõi, A : hệ số nhân củ (củ/chồi); B: khối lợng trung bình củ (g/củ). 3.3. ảnh hởng của thời gian xử lý lạnh đến sinh trởng phát triển của cây trồng từ củ in vitro và chất lợng củ G1 Thời gian xử lý lạnh có ảnh hởng rõ rệt đến sinh trởng, phát triển của cây trồng từ củ in vitro (bảng 3). Quy luật chung cho cả hai giống Star Gazer và Royal Justice là thời gian xử lý lạnh càng dài, tỷ lệ củ mọc cây và tỷ lệ cây có thân càng cao, đồng thời các cây có chiều cao và số lá vợt trội hơn hẳn. Thời gian xử lý lạnh 3 tháng cho sự sinh trởng và phát triển của cây là tốt nhất. Bảng 3. ảnh hởng của thời gian xử lý nhiệt độ thấp củ in vitro đến sinh trởng phát triển của cây Chỉ tiêu Giống Thời gian xử lý TL củ mọc (%) TL cây có thân (%) TL cây không có thân (%) Chiều cao TB (cm) Số lá TB (chiếc) 1 tháng 55,5 0,0 100,0 4,1 2,1 2 tháng 77,7 7,7 92,3 6,6 3,2 Star Gazer 3 tháng 79,5 100,0 0,0 25,3 11,0 1 tháng 55,5 0,0 100,0 5,0 2,8 2 tháng 56,7 33,3 66,7 6,7 3,8 Royal Justice 3 tháng 94,9 100,0 0,0 26,1 11,1 LSD (5%) 2,1 0,9 Ghi chú: Khối lợng củ in vitro >1g Thời gian xử lý lạnh cho củ in vitro còn ảnh hởng rất tích cực đến chất lợng củ thu hoạch đợc (củ G1).Khối lợng trung bình củ và tỷ lệ củ có khối lợng lớn cũng đạt đợc cao nhất ở công thức xử lý củ in vitro bằng nhiệt độ thấp trong 3 tháng (bảng 4). Qua những kết quả nêu trên có thể khẳng định: với loại cây yêu cầu sự xuân hóa nh cây lily, chế độ xử lý lạnh củ giống thích hợp là nhân tố có tính quyết định đối với sự sinh trởng phát triển của cây và chất lợng của củ thu hoạch (Roh M. S., 1996; Joong Suk Lee et all, 1996). Bảng 4. ảnh hởng của thời gian xử lý lạnh đến chất lợng củ G1 Tỷ lệ các cỡ củ G1 (%) Giống Thời gian xử lý <1.5g (P 1 ) 1.5-3.0g (P 2 ) >3.0g (P 3 ) Khối lợng TB củ G 1 (g/củ) 1 tháng 50,00 50,00 0 2,19 2 tháng 28,57 42,85 28,57 2,44 Star Gazer 3 tháng 12,33 40,90 35,48 3,85 1 tháng 100,00 0,00 0,00 1,02 2 tháng 25,26 45,26 29,47 3,50 Royal Justice 3 tháng 19,23 54,80 46,75 5,00 LSD (5%) 0,33 Ghi chú: Khối lợng củ in vitro >1g 4. ảnh hởng của khối lợng củ in vitro đến sinh trởng phát triển của cây và chất lợng củ G1 Bảng 5. ảnh hởng của khối lợng củ in vitro đến sinh trởng phát triển của cây Chỉ tiêu Giống Khối lợng củ in vitro (g/củ) Tỷ lệ củ mọc (%) Tỷ lệ cây có thân (%) Tỷ lệ cây không có thân (%) Chiều cao TB cây (cm) Số lá TB (chiếc) 0,5 1,0 73,0 61,5 38,5 12,7 6,4 Star Gazer > 1,0 79,5 100,0 0,0 25,3 11,0 0,5 1,0 77,2 86,7 13,0 20,7 9,5 Royal Justice > 1,0 94,9 100,0 0,0 26,1 11,1 LSD(5%) 2,5 1,1 Ghi chú: Trớc khi trồng củ in vitro đợc xử lý ở 5 0 C trong 3 tháng Kết quả trình bày qua bảng 5 và bảng 6 chỉ rõ: củ giống in vitro có khối lợng càng lớn, cây sinh trởng phát triển càng mạnh, dẫn đến chất lợng củ thu hoạch đợc (củ G1) càng cao. Với cả hai giống Star Gazer và Royal Justice , khi củ giống in vitro có khối lợng > 1g/củ sẽ có tỷ lệ mọc cao (79,5 và 94,9%), các cây đều có thân và củ G1 có khối lợng trung bình lớn (3,9 và 5,0g/củ). Các củ G1 này sau một lần nhân tiếp tục có thể trở thành củ giống thơng mại (Hanks M., 2000). Bảng 6. ảnh hởng khối lợng củ in vitro đến chất lợng củ G 1 Tỷ lệ cỡ củ G1 (%) Giống Khối lợng củ in vitro (g/củ) <1.5g (P 1 ) 1.5-3.0g (P 2 ) >3.0g (P 3 ) Khối lợng TB củ G 1 (g/củ) 0,5 1,0 28,5 42,9 28,6 2,4 Star Gazer >1,0 19,2 45,0 35,8 3,9 0,5 1,0 28,4 42,1 29,5 3,5 Royal Justice >1,0 19,2 34,1 46,7 5,0 LSD(5%) 0,3 Ghi chú: Trớc khi trồng củ in vitro đợc xử lý ở 5 0 C trong 3 tháng 4. Kết luận Điều kiện thích hợp để tạo củ in vitro là: môi trờng MS có bổ sung 12% đờng saccaroza, trong điều kiện không chiếu sáng và các chồi đã đợc nuôi cấy trên môi trờng nhân nhanh 8-10 tuần. Trong điều kiện này, giống Star Gazer có hệ số nhân củ đạt: 1,5-3,0 củ/chồi và khối lợng trung bình đạt: 1,25 1,63g/củ: giống Royal Justice có các chỉ tiêu tơng tự là : 1,5-2,7 củ/chồi và 1,20-1,50g/củ. Các cây trồng từ củ in vitro có khối lợng > 1g/củ và đợc xử lý ở nhiệt độ 5 O C trong 3 tháng đã sinh trởng, phát triển tốt và có chất lợng củ thu hoạch (G1) cao: Giống Star Gazer: tỷ lệ mọc cây đạt 79,5%, chiều cao cây trung bình: 25,3 cm, số lá trung bình/cây:11,0 lá và khối lợng trung bình củ G1: 3,9g/củ. Giống Royal Justice: tỷ lệ mọc cây đạt 94,9%, chiều cao cây trung bình: 26,1 cm, số lá trung bình/cây:11,1 lá và khối lợng trung bình củ G1: 5,0g/củ. Tài liệu tham khảo Nguyễn Thái Hà và cs (2003). Nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro các giống hoa Lilium spp. Báo cáo khoa học Hội nghị sinh học toàn quốc, 2003. Nxb Khoa học và kỹ thuật, trang: 875-879. Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Phơng Thảo (1999). Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa loa kèn bằng kỹ thuật tạo củ trong ống nghiệm. Báo cáo khoa học Hội nghị sinh học toàn quốc. Nxb Khoa học và kỹ thuật, trang: 866-873. Hanks M., (2000). A growers guide to bulbs. Murdoch Books, 2000. pp: 78-79 Joong Suk Lee, Young A Kim and Hyun Jin Wang, (1996). Effect of bulb vernalization on the growth and flowering of Asiatic hybrid lily. Acta. Hort. 414 ISHS. pp: 229-234. Murashige T. and Skoog F., (1962). A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15. pp: 473- 497. Roh M. S., (1996). New production technology of Lilium- A review on propagation and forcing. Acta. Hort. 414 ISHS. pp: 219-228. . lợng củ in vitro >1g 4. ảnh hởng của khối lợng củ in vitro đến sinh trởng phát triển của cây và chất lợng củ G1 Bảng 5. ảnh hởng của khối lợng củ in vitro đến sinh trởng phát triển của cây. Sự tạo củ lily in vitro và sự sinh trởng của cây lily trồng từ củ in vitro Research on production of in vitro lily bulblet and growth of plants derived. đến sinh trởng phát triển của cây trồng từ củ in vitro và chất lợng củ G1 Thời gian xử lý lạnh có ảnh hởng rõ rệt đến sinh trởng, phát triển của cây trồng từ củ in vitro (bảng 3). Quy luật