Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2011: Tp 9, s 3: 485 - 491 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI VAI TRò CủA YscW TRONG VIệC TIếT ĐộC Tố BởI VI SINH VậT GÂY BệNH YERSINIA ENTEROCOLITICA Evaluating the Role of YscW in Secretion of Virulence Factors by Foodborne Pathogen Yersinia enterocolitica Nguyn Hng Thu 1 , Zachary W. Bent 2 1 Khoa Cụng ngh thc phm, Trng i hc Nụng nghip H Ni, Vit Nam 2 Trng i hc California, Davis, Hoa K a ch email tỏc gi liờn lc: thuycntp@hua.edu.vn Ngy gi ng: 26.04.2011; Ngy chp nhn: 15.06.2011 TểM TT YscW l mt lipoprotein nm mng ngoi t bo ca vi khun gõy bnh ng rut Yersinia enterocolitica. Cú gi thuyt cho rng YscW úng vai trũ quan trng h tr kh nng tit c t v gõy bnh ca Yersinia enterocolitica. Vỡ vy, nghiờn cu ny c tin hnh nhm mc ớch ỏnh giỏ vai trũ ca YscW bng vic thit k mt t bin khuyt on yscW v sau ú kim tra kh nng tit c t ca t bin ny. Kt qu cho thy t bin khuyt on yscW ó c thit k thnh cụng. Nhng dũng Y. enterocolitica cha t bin khuyt on yscW hu nh khụng th hin kh nng tit c t. Kt qu gi ý YscW l mt protein tim nng trong vic h tr kh nng gõy bnh ca Y. enterocolitica. T khoỏ: c t, t bin khuyt on, Yersinia enterocolitica, YscW. SUMMARY YscW is a small lipoprotein located in the outer membrane of food-borne pathogen Yersinia enterocolitica. It is hypothesized that YscW plays a vital role in the improvement of virulence factors (Yop) secretion by Y. enterocolitica. The role of YscW was thus investigated in the present study by construction of a yscW deletion mutant and its ability to secrete Yops was subsequently evaluated. In this study, yscW deletion gene (yscW) was successfully constructed. Y. enterocolitica mutants expressed nearly no Yop secretion. These results indicated that YscW might be required for the Yop secretion by Y. enterocolitica. Key words: Deletion mutant, virulence factors, Yersinia enterocolitica, YscW. 1. ĐặT VấN Đề Yersinia enterocolitica l chủng vi sinh vật gây bệnh đờng ruột ở ngời. Chủng vi sinh vật ny thờng đợc phân lập từ lợn v thực phẩm bao gồm hải sản, thịt g, sữa cha thanh trùng Cho đến nay, đã thống kê đợc nhiều trờng hợp nhiễm bệnh do ăn thức ăn nhiễm khuẩn Y. enterocolitica. Biểu hiện bệnh phụ thuộc vo lứa tuổi v khả năng miễn dịch của cơ thể (Babic-Erceg v cs., 2003, Ackers v cs., 2000). ở trẻ em (dới 5 tuổi), biểu hiện bệnh thờng l sốt, đau bụng v đi ngoi ra máu. ở trẻ em lớn hơn 5 tuổi v ngời trởng thnh, biểu hiện chính l đau bụng v sốt (Ehara v cs., 2000). Cơ chế gây bệnh của Y. enterocolitica đã v đang l vấn đề nghiên cứu rất đợc quan tâm trong nhiều năm trở lại đây. Hiện nay, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng gây bệnh của Y. enterocolitica l nhờ sự có mặt của plasmid gây bệnh pYV (plasmid for Yersinia virulence) v hệ thống tiết type III (Type III Secretion System-T3SS) (Bleves v Cornelis, 2000). Trong đó, hệ thống tiết Ysc (Yersinia secretion) đợc nghiên cứu sâu nhất. Ngời ta thấy rằng khi tiếp xúc với tế bo chủ, chủng vi sinh vật ny phản ứng với sự thay đổi của môi trờng xung quanh rất nhanh nhạy bằng cách kích thích hệ thống 485 Vai trũ ca YscW trong vic tit c t bi vi sinh vt gõy bnh Yersinia enterocolitica tiết type III. Trong điều kiện in vitro, ở 37 0 C v trong môi trờng thiếu Ca 2+ , nhờ hệ thống tiết type III, Y. enterocolitica sẽ tiết ra những độc tố có bản chất l những protein (Yops) vo trong tế bo chủ v gây bệnh cho cơ thể chủ (Cornelis, 2002). Có khoảng 25 protein tham gia vo cấu trúc nên hệ thống tiết Ysc. Tuy nhiên chỉ có một vi protein tham gia trực tiếp vo quá trình tiết độc tố của Y. enterocolitica. Trong đó, một lipoprotein có kích thớc nhỏ nằm ở mng ngoi tế bo Y. enterocolitica, tên l YscW có thể đóng vai trò quan trọng hỗ trợ cho khả năng tiết độc tố (Yops) ra ngoi môi trờng của chủng vi khuẩn gây bệnh Y. enterocolitica (Allaoui v cs., 1995; Burghout v cs., 2004). Protein ny đợc mã hoá bởi gene tơng ứng yscW trên plasmid pYV. Vì vậy, nghiên cứu ny sẽ tập trung vo việc thiết kế một gene chứa đột biến khuyết yscW v xác định khả năng tiết độc tố của gene đột biến ny từ đó xác định đợc rõ hơn vai trò của yscW. Việc nghiên cứu cơ chế gây bệnh của Y. enterocolitica sẽ tạo tiền đề cho việc điều trị các bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn Yersinia. 2. ĐốI TƯợNG V PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1. Chủng vi sinh vật, plasmid v điều kiện nuôi cấy Các chủng vi sinh vật v plasmid sử dụng trong nghiên cứu ny đợc liệt kê ở bảng 1. Chủng Y. enterocolitica đợc nuôi cấy ở 26 0 C v chủng E. Coli đợc nuôi cấy ở 37 0 C trên môi trờng thạch LB hoặc môi trờng lỏng LB (Luria-Bertani). 2.2. Phơng pháp thiết kế đột biến khuyết đoạn yscW (yscW) Đột biến khuyết đoạn yscW đợc thiết kế sử dụng phơng pháp PCR của Warren v cs. (1997). Về nguyên tắc, vùng upstream v downstream của gene mục tiêu đợc nhân lên nhờ việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu v sau đó kết hợp chúng lại để tạo thnh đột biến khuyết đoạn. Trong nghiên cứu ny, 4 đoạn mồi A, B, C, D đợc sử dụng. Trình tự nucleotide của các đoạn mồi ny đợc liệt kê ở bảng 2. Trong đó, 2 đoạn mồi A v B đợc sử dụng để nhân vùng upstream của gene yscW (đoạn AB). Hai đoạn mồi C v D đợc sử dụng để nhân vùng downstream của yscW (đoạn CD). Sau đó, đoạn mồi A v D đợc sử dụng để tạo thnh sản phẩm l đột biến khuyết đoạn yscW (đoạn AD). 2.3. Chuyển gene vo E. coli Allele đột biến khuyết đoạn, yscW, đợc chuyển vo vector pCR-BluntII-TOPO sử dụng bộ KIT Zero BluntII-TOPO Cloning Kit (Invitrogen). Đoạn gene ny sau đó đợc chuyển vo vector tự phân huỷ pGY765, từ đó tạo nên plasmid pGY1281. Plasmid ny đợc chuyển v o chủng E. Coli SM10pir bằng phơng pháp xung điện v đợc đặt tên l chủng GY6632. Bảng 1. Chủng vi sinh vật v plasmid đợc sử dụng Chng vi sinh vt v plasmid c im Ngun gc Y. enterocolitica JB580v SerogroupO:8, Nal, yenR (R- M+) Kinder v cs., 1993 GY6533 JB580v yscW ti E. coli SM10pir Thi thr leu tonA lacY supE recA::RP4-2-Tc::Mu Km Miller v Mekalanos, 1988 GY2683 S17-1pir pTM100 yscW in Tc (subcloned from pGY1001) Tae Jong Kim, thnh viờn lab, 2007 GY6632 SM10pir pGY1281 ti Plasmid Ptm 100 Mob + , derivative of pACYC184, Cm r , Tet r Michiels v Cornelis, 1991 pGY765 pMRS101 (NotI removed) ofY, Str r suicide vector Briana Young, thnh viờn lab, 2005 pGY1004 pTM100:: yscW Zachary Bent, thnh viờn lab, 2007 pGY1281 pMRS101 (NotI removed) yscW ti C m r : Khỏng chloramphenicol; Tet r : Khỏng tetracycline; Str r : Khỏng streptomycin 486 Nguyn Hng Thu, Zachary W. Bent Bảng 2. Các mồi đợc sử dụng Mi Trỡnh t (5-3) A CCGGCTATTGGGAATATG B TGCTGTGCGAGATAATGG C CCATTATCTCGCACAGCACGATGGTTGTACATCGCA D CGAGAGGAATAAAGTCCC 2.4. Tuyển chọn đột biến khuyết đoạn yscW ở Y. enterocolitica Allele yscW đợc chuyển vo Y. enterocolitica bằng phơng pháp tiếp hợp giữa chủng E. coli GY6632 v chủng wild- type Y. enterocolitica JB580v. Hỗn hợp tiếp hợp đợc nuôi cấy trên môi trờng thạch LB chứa đồng thời 2 kháng sinh: streptomycin (Str) v acid nalidixic (Nal), nhằm tuyển chọn những dòng Y. enterocolitica (kháng Nal) mang vector tự phân huỷ pGY1281 (kháng Str). Những dòng Yersinia đã loại bỏ (đo thải) vector tự phân huỷ đợc tuyển chọn bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trên môi trờng TYE chứa 7,5% sucrose. Gene sacB trên vector tự phân huỷ có khả năng dịch mã ra enzyme levansucrase. Enzyme ny chuyển sucrose thnh chất gây độc đối với Yersinia. Do đó, những dòng (clone) đã loại bỏ vector tự phân huỷ trở nên kháng sucrose nhng lại mẫn cảm với streptomycin. Những khuẩn lạc ny sau đó đợc cấy lại lên môi trờng thạch LB v LB chứa streptomycin (Str) v acid nalidixic (Nal). Những dòng no mọc trên môi trờng LB m không mọc trên môi trờng LB chứa streptomycin v acid nalidixic l những dòng m vector tự phân huỷ đã bị loại. Những dòng ny mang allele yscW wild-type hoặc allele khuyết gene yscW. Sau đó dùng PCR để xác định dòng vi khuẩn mang allele khuyết yscW, dòng ny đợc đặt tên l GY6533. 2.5. Điện di trên gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) Y. enterocolitica đợc nuôi cấy qua đêm trong môi trờng lỏng LB v sau đó nuôi cấy trong môi trờng Yop (thiếu ion Ca 2+ , thêm 1,5 mg/mL MgCl 2 and 2,1 mg/mL Na 2 C 2 O 4 ) với tỷ lệ 1:30, ở 37 0 C trong 6 giờ. Sự tiết protein Yop đợc xác định bằng phơng pháp điện di SDS-PAGE. Mật độ tế bo của dịch nuôi cấy đợc đo bằng phơng pháp so mu ở bớc sóng 600 nm v giá trị OD ny đợc dùng để đồng nhất mật độ tế bo. Dịch tế bo đợc ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút để tách tế bo vi khuẩn khỏi dịch nuôi cấy. Protein sau đó đợc kết tủa bằng dung dịch TCA 10% v để qua đêm ở 4 0 C. Dung dịch chứa kết tủa đợc rửa bằng acetone lạnh rồi ho tan trong dung dịch đệm chứa 2-mercaptoethanol với thể tích tơng ứng với giá trị OD 600 của dịch nuôi cấy. Mẫu sau đó đợc đun nóng ở 95 0 C trong 5 phút v khả năng tiết Yop đợc xác định bằng phơng pháp điện di sử dụng 10% gel polyacrylamide. Sau khi điện di dùng thuốc nhuộm CBB (Coomassie Brilliant Blue) để hiển thị protein. 3. KếT QUả V THảO LUậN 3.1. Thiết kế đột biến khuyết đoạn yscW Sau khi tiến hnh thiết kế đột biến khuyết đoạn yscW bằng phơng pháp PCR, đã thu đợc các đoạn AB, CD v AD (đoạn đột biến khuyết đoạn yscW) có kích thớc tơng đơng l 580 bp, 540 bp v 1120 bp (Hình 1, 2). Dựa trên trình tự của bộ gene (đã đợc giải mã) của chủng wild-type Y. enterocolitica JB580v, các đoạn AB, CD v AD cũng có kích thớc tơng tự nh vậy. Điều ny cho thấy đoạn đột biến khuyết yscW đã đợc thiết kế thnh công. Đoạn gene ny sau đó đợc tinh sạch bằng bộ Kit DNA Extraction Kit (QIAGEN) để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 487 Vai trò của YscW trong việc tiết độc tố bởi vi sinh vật gây bệnh Yersinia enterocolitica 2 M 1 M bp H×nh 1. §iÖn di s¶n phÈm PCR (a) §o¹n AB (b) §o¹n CD. MÉu ®−îc ®iÖn di trªn gel agarose 0,8% trong 1 giê ë 100V, nhuém b»ng ethidum bromide vμ hiÓn thÞ b»ng UV. GiÕng 1: §o¹n AB; GiÕng 2: §o¹n CD; M: Thang chuÈn (1 kb). H×nh 2. §iÖn di s¶n phÈm PCR cña ®o¹n AD. MÉu ®−îc ®iÖn di trªn gel agarose 0,8% trong 1 giê ë 100V, nhuém b»ng ethidum bromide vμ hiÓn thÞ b»ng UV. M: Thang chuÈn (1 kb) 1,636 1,018 506,517 §o¹n AB 1,636 1,018 §o¹n CD 506,517 (a) (b) M bp 1,636 §o¹n AD 1,018 506,517 488 Nguyn Hng Thu, Zachary W. Bent M bp pGY76 Đột biến khu y ết y sc W 1,63 1,018 506,51 4,07 3,054 5,090 6,108 Hình 3. Điện di plasmid pGY1281 sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn BamHI v XbaI endonucleases: pGY765 (~7000 bp) v yscW (~1120 bp); M: Thang chuẩn (1 kb) 3.2. Chuyển gene vo E. coli Sau khi tiến hnh chuyển vector mang allele khuyết đoạn yscW (pGY1281) vo E. coli, những dòng mang vector ny đợc tuyển chọn bằng cách nuôi cấy trong môi trờng thạch LB có chứa streptomycin. Plasmid của một số dòng phát triển trên môi trờng ny đợc tinh sạch, sử dụng bộ Kit Plasmid Miniprep Kit (Qiagen), để kiểm tra xem thực sự chúng có mang đoạn allele đột biến khuyết yscW. Đoạn allele khuyết yscW đợc giải phóng ra khỏi plasmid nhờ enzyme cắt giới hạn BamHI v XbaI. Kết quả điện di trên hình 3 cho thấy, 8 dòng E. coli chứa plasmid pGY765 v đoạn allele khuyết yscW. Một trong 8 dòng đợc lựa chọn v đặt tên l GY6632. Dòng ny sau đó đợc sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Tuyển chọn dòng Y. enterocolitica chứa đột biến khuyết đoạn yscW Sự có mặt của đoạn allele đột biến khuyết yscW trong Y. enterocolitica đợc xác định bằng phơng pháp PCR. Trong quá trình tuyển chọn, 58 dòng đã đợc kiểm tra v trong đó 3 dòng có sản phẩm PCR có kích thớc tơng ứng với 1120 bp, kích thớc của đoạn allele đột biến khuyết yscW, cho thấy rằng đoạn gene đột biến khuyết yscW có mặt ở Y. enterocolitica (Hình 4). Nghiên cứu ny chọn 1 trong 3 dòng v đặt tên l GY6533. 3.4. ảnh hởng của đột biến khuyết yscW đến khả năng tiết độc tố của Y. enterocolitica Nghiên cứu tiến hnh kiểm tra khả năng tiết Yops của dòng Yersinia chứa đột biến khuyết yscW bằng phơng pháp SDS- PAGE nh đã mô tả. Từ hình 5 có thể thấy các dòng Y. enterocolitica chứa đột biến khuyết yscW hầu nh không còn khả năng tiết Yop so với chủng hoang dại Y. enterocolitica JB580v. Điều ny có thể đợc giải thích l do thiếu YscW nên khả năng tiết độc tố Yop của Y. enterocolitica bị giảm sút mạnh, chứng tỏ rằng YscW có thể đóng vai trò quan trọng đối với việc tiết độc tố của Y. enterocolitica. Burghout v cs. (2004) đã đánh giá vai trò của YscW đối với khả năng tiết độc tố của Yersinia. Thông qua việc thiết kế một đột biến khuyết YscW v đánh giá khả năng tiết độc tố của đột biến ny, các tác giả thấy rằng khả năng tiết độc tố của đột biến ny giảm mạnh so với chủng hoang dại. 489 Vai trò của YscW trong việc tiết độc tố bởi vi sinh vật gây bệnh Yersinia enterocolitica M 1 2 3 4 5 M bp bp 1,636 1,636 1,018 1,018 506,517 506,517 H×nh 4. §iÖn di s¶n phÈm PCR cña 3 dßng Y. enterocolitica tuyÓn chän GiÕng 1: Chñng wild-type Y. enterocolitica JB580v; GiÕng 2, 3, 4: Ba dßng Y. enterocolitica chøa ®o¹n ®ét biÕn khuyÕt yscW; GiÕng 5: Plasmid pCR-BluntII-TOPO; M: Thang chuÈn (1 kb). 1 2 3 4 5 H×nh 5. §iÖn di SDS-PAGE cho thÊy kh¶ n¨ng tiÕt Yop cña 3 dßng Y. enterocolitica chøa ®ét biÕn khuyÕt yscW. GiÕng 1: Thang chuÈn; GiÕng 2: Chñng wild-type Y. enterocolitica JB580v; GiÕng 3, 4, 5: Ba dßng Y. enterocolitica chøa ®ét biÕn khuyÕt yscW. 490 Nguyn Hng Thu, Zachary W. Bent 4. KếT LUậN V Đề NGHị Bằng việc thiết kế đột biến gene khuyết yscW, kết quả nghiên cứu bớc đầu đã cho thấy YscW có thể đóng vai trò quan trọng đối với khả năng tiết độc tố của Y. enterocolitica. Tuy nhiên để có đánh giá chính xác vai trò của YscW, cần phải tiến hnh thêm những thí nghiệm nh sau: - Thí nghiệm chuyển lại đoạn gene yscW trở lại vo dòng Y. enterocolitica chứa đột biến khuyết yscW (complementation test) để kiểm tra khả năng tiết Yop của chúng có tơng tự chủng wild-type không. - Kiểm tra sự tiết Yop nội bo của dòng Y. enterocolitica chứa đột biến khuyết yscW. - Kiểm tra khả năng của đột biến khuyết yscW trong việc hỗ trợ cho việc chuyển Yop ra bên ngoi môi trờng. TI LIệU THAM KHảO Ackers, M. L., S. Schoenfeld, J. Markman, M. G. Smith, M. A. Nicholson, W. DeWitt, D. N. Cameron, P. M. Griffin & L. Slutsker (2000). An outbreak of Yersinia enterocolitica O:8 infections associated with pasteurized milk. J Infect Dis, 181, 1834-7. Allaoui, A., R. Scheen, C. Lambert de Rouvroit & G. R. Cornelis (1995). VirG, a Yersinia enterocolitica lipoprotein involved in Ca 2+ dependency, is related to exsB of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol, 177, 4230-7. Babic-Erceg, A., Z. Klismanic, M. Erceg, D. Tandara & M. Smoljanovic (2003). An outbreak of Yersinia enterocolitica O:3 infections on an oil tanker. Eur J Epidemiol, 18, 1159-61. Burghout, P., F. Beckers, E. de Wit, R.van Boxtel, G. R. Cornelis, J.Tommassen & M. Koster (2004). Role of the pilot protein YscW in the biogenesis of the YscC secretin in Yersinia enterocolitica. J Bacteriol, 186, 5366-75. Cornelis, G. R. (2002). Yersinia type III secretion: send in the effectors. J Cell Biol, 158, 401-8. Ehara, A., K. Egawa, F. Kuroki, O. Itakura & M. Okawa (2000). Age-dependent expression of abdominal symptoms in patients with Yersinia enterocolitica infection. Pediatr Int, 42, 364-6. Matsumoto, H. & G. M. Young (2009). Translocated effectors of Yersinia. Curr Opin Microbiol, 12, 94-100. Kinder, S. A., L. J. Badger, O. G. Bryant, C. J. Pepe and L. V. Miller (1993). Cloning o the YenI restriction endonuclease and methyltransferase from Yersinia enterocolitica serotype O:8 and construction of a transformable R-M+ mutant. Gene, 136, 271-275. Michiels T., & R. G. Cornelis (1991). Secretion of hybris proteins by the Yersinia Yop export system. Journal of Bacteriology, 173, 1677-1685. Miller, V. L. & J. J. Mekalanos (1988). A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: Osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. Journal of Bacteriology, 170, 2575-2583. Warrens, A. N., M. D. Jones & R. I. Lechler (1997). Splicing by overlap extension by PCR using asymmetric amplification: an improved technique for the generation of hybrid proteins of immunological interest. Gene, 186, 29-35. 491 . NI VAI TRò CủA YscW TRONG VI C TIếT ĐộC Tố BởI VI SINH VậT GÂY BệNH YERSINIA ENTEROCOLITICA Evaluating the Role of YscW in Secretion of Virulence Factors by Foodborne Pathogen Yersinia enterocolitica. giả thấy rằng khả năng tiết độc tố của đột biến ny giảm mạnh so với chủng hoang dại. 489 Vai trò của YscW trong vi c tiết độc tố bởi vi sinh vật gây bệnh Yersinia enterocolitica M 1 2 3 4. Kit (QIAGEN) để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 487 Vai trò của YscW trong vi c tiết độc tố bởi vi sinh vật gây bệnh Yersinia enterocolitica 2 M 1 M bp H×nh