- 3 -  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC.” - 4 - MỤC LỤC PHẦN 1: TỔNG QUAN 3 - 1.1. TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN 7 - 1.1.1. Công thức cấu tạo 7 - 1.1.2. Tính chất lý hóa 7 - 1.1.3. Nguồn gốc 7 - 1.1.4. Dược động học 7 - 1.1.5. Tác dụng và cơ chế tác dụng 8 - 1.1.6. Chỉ định 8 - 1.1.7. Chống chỉ định 9 - 1.1.8. Dạng bào chế và liều lượng 9 - 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN 9 - 1.2.1. Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh 9 - 1.2.1.1. Phương pháp 1 [15] 9 - 1.2.1.2. Phương pháp 2 [3] - 10 - 1.2.1.3. Phương pháp 3:[14], [20] - 10 - 1.2.2. Định lượng tobramycin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS - 11 - 1.2.2.1. Phương pháp 1: [4] - 11 - 1.2.2.2. Phương pháp 2: [19] - 11 - 1.2.3 Định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC - 12 - 1.2.2.1 Phương pháp 1 [14] - 12 - 1.2.2.2 Phương pháp 2 [20], [23] - 12 - 1.2.2.3 Phương pháp 3 [15] - 13 - 1.2.2.4 Phương pháp 4 [16] - 13 - 1.2.2.5 Phương pháp 5 [15] - 14 - 1.2.2.6. Phương pháp 6 [5] - 14 - 1.2.2.7. Phương pháp 7 [9] - 15 - 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) - 16 - 1.3.1. Nguyên tắc - 16 - 1.3.2. Cơ sở lý thuyết - 17 - 1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC - 17 - 1.3.3.1. Hệ thống bơm - 17 - 1.3.3.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi - 17 - 1.3.3.3. Hệ tiêm mẫu - 17 - 1.3.3.4. Cột sắc ký lỏng HPLC - 18 - 1.3.3.5. Detector trong HPLC - 18 - 1.3.3.6. Thiết bị hiển thị kết quả - 18 - - 5 - 1.3.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký - 19 - 1.3.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký - 21 - 1.3.5.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18] - 21 - 1.3.5.2. Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18] - 22 - 1.3.5.3. Chọn đệm pH - 23 - 1.3.5.4. Tốc độ dòng - 23 - 1.3.6. Cách đánh giá pic - 23 - 1.3.7. Ứng dụng của HPLC - 24 - 1.3.7.1. Định tính và thử độ tinh khiết: - 24 - 1.3.7.2. Sắc ký điều chế: - 24 - 1.3.7.1. Định lượng: - 24 - PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 26 - 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM - 26 - 2.1.1. Nguyên vật liệu : - 26 - 2.1.1.1. Nguyên liệu và hoá chất: - 26 - 2.1.1.2. Dụng cụ: - 26 - 2.1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu - 26 - 2.1.2.1. Phương pháp nghiên cứu - 26 - 2.1.2.2. Nội dung nghiên cứu - 27 - 2.2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 28 - 2.2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC - 28 - 2.2.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký - 28 - 2.2.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc kí: - 28 - a. Khảo sát chọn bước sóng thích hợp - 28 - Hình 1: Phổ hấp thụ của dung dịch tobramycin 0,02% - 29 - b. Lựa chọn cột: - 29 - c. Lựa chọn đệm: - 29 - d. Lựa chọn pha động: - 30 - e. Lựa chọn tốc độ dòng - 30 - đ. Điều kiện sắc ký lựa chọn - 31 - 2.2.2. Qui trình định lượng - 31 - 2.2.2.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống - 32 - 2.2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng - 32 - 2.2.2.3. Điều kiện sắc ký - 33 - 2.2.2.4. Tính kết quả - 33 - 2.2.3. Định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp mới xây dựng - 34 - 2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng - 35 - 2.2.4.1. Tính tuyến tính - 35 - - 6 - 2.2.4.2. Tính chính xác - 37 - 2.2.4.3. Tính đúng - 37 - Bảng 6: Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp - 38 - 2.2.4.4. Tính đặc hiệu - 39 - 2.3. BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ - 40 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT - 43 - 3.1 KẾT LUẬN - 43 - 3.2 ĐỀ XUẤT - 43 - - 7 - PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN 1.1.1. Công thức cấu tạo C 18 H 37 N 5 O 9 PTL: 467.5 Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-deoxy-α-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6- diamino-2,3,6-trideoxy-α-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21]. 1.1.2. Tính chất lý hóa Bột màu trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether. Góc quay cực riêng [α] D 20 : +138 0 đến +148 0 [7] 1.1.3. Nguồn gốc Chiết xuất từ môi trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarius, có thể bán tổng hợp từ kanamycin B [7]. 1.1.4. Dược động học Tobramycin hầu như không hấp thu qua đường tiêu hoá nhưng hấp thu tốt qua đường tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch. Thuốc ít liên kết với protein huyết - 8 - tương. Do phân tử phân cực mạnh nên khó đi vào các mô kể cả não. Thuốc đạt nồng độ cao trong vỏ thận. Khi sử dụng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy trong thai gây độc cho cả mẹ và con. Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải giảm liều khi suy thận, thường dựa vào creatinin huyết thanh để tránh độc tính. Hiện nay, tobramycin được dùng với chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày. Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn và ít độc tính hơn so với dùng liều nhỏ và nhiều lần trong ngày như trước đây. Đối với các ca nặng (nhiễm Pseu. aeruginosa ở người giảm neutrophile và các ca suy thận) cần khoảng cách liều dài hơn 24 giờ. Thời gian bán thải của tobramycin: 2 - 5 giờ [6] 1.1.5. Tác dụng và cơ chế tác dụng Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí. Thuốc không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí. Tobramycin rất giống gentamycin về tính chất sinh học và độc tính: chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận. Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cả gentamycin. Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của ribosom [2], [11]. 1.1.6. Chỉ định Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gr (-). - 9 - Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp. gây ra, tobramycin có thể dùng phối hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam. Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha - Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc benzylpenicilin nhưng phải tiêm riêng rẽ. [2] 1.1.7. Chống chỉ định Người có tiền sử dị ứng với các kháng sinh loại aminoglycosid, người nghe kém và người có bệnh thận. [2] 1.1.8. Dạng bào chế và liều lượng Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (người lớn), 10 mg/ml (trẻ em). Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ. Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt. Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %. Dạng thuốc hít qua đường miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm P. aeruginosa đường hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa. [11] 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN 1.2.1. Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh 1.2.1.1. Phương pháp 1 [15] - Chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501. - Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 5,59 g Kali dihydrophosphat : 0,41 g - Môi trường định lượng: Pepton : 5,0 g Cao thịt : 3,0 g Dikali hydrophosphat : 3,0 g Thạch : 15,0 - 20,0 g - 10 - Nước cất : 1000 ml pH sau khi tiệt trùng : 7,8 ± 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả theo [15] 1.2.1.2. Phương pháp 2 [3] - Chủng vi khuẩn: Bacillus pumilus NCTC 8241. - Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 16,75 g Kali dihydrophosphat : 0,523g - Môi trường định lượng: Cao men bia : 3,0 g Pepton : 6,0 g Casein pancreatic : 4,0 g Glucose : 1,0 g Cao thịt : 1,5 g Thạch : 15,0 g Nước cất : 100 ml pH sau khi tiệt trùng : 8,2 ± 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử Cân chính xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml; 20 IU/ml và 40 IU/ml. - Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phương pháp hoạt lực kháng sinh - DĐVN III. 1.2.1.3. Phương pháp 3:[14], [20] - Xác định hoạt lực kháng sinh của tobramycin bằng phương pháp vi sinh vật theo BP 2000 hay JP14 - 11 - - Chủng vi khuẩn : Bacillus subtilis ATCC 6633 - Môi trường nuôi cấy : Môi trường đặc - Dung dịch chuẩn Cân chính xác một lượng tobramycin chuẩn, tương đương khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25 ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc. Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 5 ο C đến 15 ο C và sử dụng trong vòng 30 ngày. Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để được các dung dịch có nồng độ 8µg/ml và 2µg/ml (theo hiệu lực). - Dung dich thử: Cân chính xác một lượng tobramycin, tương đương khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml. Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để được các dung dịch có nồng độ 8µg/ml và 2µg/ml (theo hiệu lực). 1.2.2. Định lượng tobramycin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 1.2.2.1. Phương pháp 1: [4] Cân một lượng tobramycin sulfat tương ứng với khoảng 0,3 g tobramycin nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nước cất 2 lần vừa đủ đến vạch, trộn đều. Lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức có dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,01N, 2 ml dung dịch KMnO 4 . Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ ở 40 0 C trong 60 phút. Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn bằng cách dùng chất đối chiếu tobramycin. Mẫu trắng tiến hành như mẫu thử nhưng không có tobramycin. Sau khi đun cách thuỷ ở 40 0 C, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang của các dung dịch này ở bước sóng 425 nm, cuvet dày 1cm. 1.2.2.2. Phương pháp 2: [19] - 12 - Dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl 3 . Sản phẩm có độ hấp thụ lớn nhất ở 645 nm. Định luật Lambert-Beer được áp dụng trong khoảng nồng độ từ 50-500 mUI/ml. 1.2.3 Định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC 1.2.2.1 Phương pháp 1 [14] - Cột styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8µm). - Nhiệt độ cột: 55 0 C. - Pha động: Hỗn hợp pha trong 1l nước đã loại CO 2 gồm: 52 g natri sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran và 50 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M đã được chỉnh pH về 3,0 bằng acid phosphoric. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha trong nước đã loại CO 2 . Tốc độ 0,3 ml/phút. - Detector: Detector ampe kế hoặc các thiết bị tương tự. - Thể tích tiêm: 20 µl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 0,1 mg/ml. 1.2.2.2 Phương pháp 2 [20], [23] - Cột RP 18 (3,9 mm x 30 cm). - Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan trong khoảng 800 ml nước, thêm vào dung dịch này 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N, sau đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000 ml, lắc đều. - Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4dinitrofluorobenzen 1% trong ethanol 96%. - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút. - Detector UV: 365 nm. [...]... NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.2.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC 2.2.1.1 Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký Chọn phương pháp sắc ký: Tobramycin sulfat là chất hữu cơ phân cực, tan nhiều trong nước Vì vậy, để phân tích và định lượng tốt, chúng tôi chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo Chọn cột sắc ký: Trong phương pháp định lượng HPLC pha đảo, cột sắc ký... tobramycin cũng như điều kiện thực nghiệm của nước ta hiện nay để xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng tobramycin bằng HPLC 2.1.2.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phương pháp:  Chọn cột, pha động, bước sóng phát hiện và tốc độ dòng, thể tích tiêm thích hợp để định lượng Xây dựng, đánh giá phương pháp định lượng tobramycin nguyên  liệu - Khảo sát tính thích hợp của hệ... lỏng hiệu năng cao có ứng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong HPLC:  Phương pháp chuẩn ngoại (external standard method) Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và... lọc chân không Satorius - Bình định mức các loại - Cốc có mỏ - Pipet chính xác, pipet thường - Lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm 2.1.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1.2.1 Phương pháp nghiên cứu - Tham khảo các phương pháp định lượng tobramycin đã công bố - Tham khảo các phương pháp định lượng tobramycin bằng HPLC - 26 - - Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất hoá lý của tobramycin cũng như điều kiện... Sx= 0,21 ∆X = tα ( n −1) × S x = 0,5962 Khoảng tin cậy = 90,43 ± 0,59 Kết luận: - 34 - Kết quả trình bày ở bảng trên cho thấy nguyên liệu tobramycin đem định lượng có hàm lượng là: 90,43% ± 0,59 % 2.2.4 Đánh giá phương pháp định lượng Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng tobramycin nguyên liệu bằng HPLC mới xây dựng dựa vào các chỉ tiêu sau - Đánh giá tính tuyến tính - Đánh giá tính chính... 1,53 Kết luận: Hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là thích hợp để định lượng tobramycin trong nguyên liệu 2.2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng - 32 - a Dung dịch thử Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 10,0 ml Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 µm b Dung dịch chuẩn (đối chiếu) Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin. .. lại của phương pháp Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ định lượng Khối lượng cân như bảng 6 Tiến hành định lượng các mẫu này theo điều kiện đã chọn, mỗi mẫu định lượng 3 lần, lấy kết quả trung bình Tính hàm lượng % của tobramycin có trong mẫu thử dựa trên chuẩn đã biết hàm lượng, từ đó tính % tìm lại của mẫu thử - 37 - Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp được trình. .. ứng Tính hàm lượng % tobramycin có trong mẫu thử theo công thức sau: - 33 - %X = A ×m ×P A ×m c c Trong đó: t t At, Ac là diện tích pic tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn mt, mc là lượng cân tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn (mg) P là hàm lượng % ghi trên nhãn của tobramycin chuẩn 2.2.3 Định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp mới xây dựng Chuẩn bị và cho hệ thống HPLC chạy ổn định với pha... phương pháp hiện nay với hi vọng có thể đưa vào sử dụng trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lượng các sản phẩm chứa tobramycin 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 1.3.1 Nguyên tắc Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không... hưởng kết quả định lượng) , hoặc phải dùng thuốc thử nhập ngoại để tạo dẫn chất - Định lượng bằng phương pháp HPLC :  Ưu điểm: Nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng được hoạt chất  Nhược điểm: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị và thuốc thử đắt tiền vì detector UV thường không dùng được mà thường phải tạo dẫn chất Phương pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng để phân tích . ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC. ” - 4 - MỤC LỤC. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 28 - 2.2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC - 28 - 2.2.1.1. Nguyên tắc lựa chọn