Chương 6: SỰ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT GENOM Ở THỰC VẬT BẬC CAO ĐẶC ĐIỂM BỘ MÁY DI TRUYỀN CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT Tế bào thực vật là một tế bào hữu nhân điển hình, được bao bọc bên ngoài bởi lớp vách cenllulose. Tế bào thực vật chứa nhiều lạp thể, đặc biệt là các lục lạp. Lục lạp chứa bộ máy di truyền riêng có liên hệ chặt với bộ máy di truyền của nhân bào. Tế bào thực vật có tính toàn thế Tính toàn thế ở tế bào thực vật được ứng dụng nhằm mục đích tái sinh, nhân nhanh các giống cây chuyển gen. ĐẶC ĐIỂM BỘ MÁY DI TRUYỀN CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT Tế bào thực vật có bộ máy di truyền phức tạp - ADN thực vật chứa cả những đoạn mã hóa và những đoạn không mã hóa. - Có sự lặp đi lặp lại nhiều lần của một đoạn. - Cơ chế biểu hiện gen đa dạng phức tạp, đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ gen thực vật. - Có sự hiện diện của các gen nhảy trong quá trình phát triển. SINH TRƯỞNG VÀ SINH SẢN CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT Sinh trưởng Nguyên phân Giảm phân Sinh sản Hữu tính: đa dạng sinh học Vô tính: tạo dòng thuần DNA Ở THỰC VẬT BẬC CAO - Sự tái bản của ADN dựa trên nguyên tắc khuôn và bổ sung. - Sự tái bản ADN mang tính nửa bảo tồn. - Sự tái bản ADN mang tính định hướng - Có sự tham gia của các phức hệ enzyme: helicaza, Primosome, các enzym ADN polimeraza I và II, ATPaza, topoisomeraza SỰ THỂ HIỆN CỦA GEN – PHIÊN MÃ VÀ DỊCH MÃ Nhân tố tham gia phiên mã: Các ARN- polimeraza: ARN - polimeraza I có vai trò tổng hợp các rARN, trừ rARN 5S. ARN - polimeraza II có vai trò phiên mã các mARN. ARN - polimeraza III có vai trò tổng hợp các tARN và rARN 5S. Các nhân tố điều chỉnh: Protein và các acid. TÍNH BẢO THỦ CỦA GEN VỀ DI TRUYỀN VÀ NHỮNG BIẾN DỊ - Sự xâm nhập của các DNA ngoại lai. - Sự chuyển dịch các gen. - Sự chuyển dịch của lục lạp và ty thể vào nhân bào. Các tính trạng thực vật là biểu hiện của các gen di truyền Cơ chế sinh tổng hợp DNA đảm bảo tính bảo thủ của gen, ổn định di truyền qua các thế hệ. Nguyên nhân biến dị ở thực vật KỸ THUẬT GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH VÀ DÒNG HÓA GEN Nhận diện tế bào chủ chứa đoạn DNA tái tổ hợp Chiết xuất và tinh sạch DNA Cắt DNA Nối các đoạn DNA Chuyển DNA vào tế bào chủ Phân tích các phân đoạn DNA Phân tích các phân đoạn DNA [...]... đầu bằng 4 CHUYỂN DNA VÀO TẾ BÀO CHỦ TRỰC TIẾP GIÁN TIẾP - Agrobacterium - Virus - Hấp thu DNA Siêu âm Xung điện Bắn gen Vi tiêm Qua ống phấn Silicon carbide 5 NHẬN DIỆN TẾ BÀO CHỦ CHỨA DNA TÁI TỔ HỢP - Nuôi cấy tái sinh tế bào mang gen chuyển trên môi trường chọn lọc - Sử dụng các phương pháp xác định cá thể chuyển gen nhận biết cây chuyển gen (nhuộm, PCR, Southern blot,…) - Theo dỏi sự biểu hiện... nhau sẽ có tốc độ dịch chuyển hay định vị ở những vị trí khác nhau trên các bản gel khi ở trong điện trường OD260nm ĐO OD = 1.8 – 2 : dung dịch DNA sạch OD280nm Ví dụ: Điện di agarose - Chuẩn bị bản gel agarose và dung dịch điện di - Lắp đặt bản gel - Pha mẫu DNA cần điện di với dung dịch màu tải mẫu (30% glycerol, 0,25% bromophenol blue và 0,25% xylencyanol) - Tiêm dịch DNA - Thực hiện điện di - Kiểm... tinh sạch DNA từ lá chanh 4 Phương pháp thực hiên: - Chuẩn bị mẫu: Mẫu lá sau khi được lau cồn, cắt bỏ gân lá, thịt lá (1g) được nghiền trong nitơ lỏng - Trích DNA: Bột lá được nghiền với 1ml extraction buffer, sau đó, thêm 50ml SDS 10%, lắc nhẹ, ủ ở 650C, 30 phút Sau thời gian ủ, mẫu được li tâm 13000rpm, 10 phút, thu 40ml dịch trong, bổ sung 40ml isopropanol, ủ ở 200C, 30 phút, sau đó, li tâm 13000rpm,... phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases ở các vị trí đặc hiệu Đặc tính của các RE: - Không cắt ở đầu tận cùng - Chỉ cắt khi nhận ra các trình tự đặc thù (4 – 12 nucleotit), tạo ra các đoạn DNA có đầu dính hay đầu bằng 2 CẮT DNA - Enzyme cắt giới hạn hoạt động tối ưu trong những điều kiện khác nhau - Các phản ứng cắt chỉ thực hiện với một lượng DNA tối thiểu trong một thể tích tối... thêm 20ml CTAB và ủ ở 650C, 15 phút Ví dụ: Chiết xuất và tinh sạch DNA từ lá chanh Thêm 40ml Chloroform, lắc đều, li tâm 13000rpm, 5 phút, hút 20ml dịch trong lớp trên, thêm 0.5ml ethanol 960 ủ ở nhiệt độ phòng, 15 phút Sau thời gian ủ, dịch ủ được li tâm 13000rpm, 10 phút, thu tủa, li tâm 13000rpm, 5 phút với ethanol 700 2 lần, sau đó, loại bỏ ethanol và phơi khô DNA qua đêm ở nhiệt độ phòng DNA... một lượng DNA tối thiểu trong một thể tích tối thiểu - Kết quả cắt phụ thuộc độ tinh sạch DNA - Enzyme cắt giới hạn được lưu trữ ở -200C Ví dụ: Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn Hòa 1mg DNA trong 17ml nước cất 2 lần và 2ml đệm phản ứng, vortex, bổ sung 1đơn vị RE, lắc đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp VD: EcoRi : BstXI : 60 phút, 370C 120 phút, 500C Bổ sung từ từ 10ml EDTA 0.5M (pH 7.5) để kết... sinh tế bào mang gen chuyển trên môi trường chọn lọc - Sử dụng các phương pháp xác định cá thể chuyển gen nhận biết cây chuyển gen (nhuộm, PCR, Southern blot,…) - Theo dỏi sự biểu hiện và di truyền của gen chuyển ... CHIẾT XUẤT VÀ TINH SẠCH DNA Chuẩn bị mẫu Phá vỡ tế bào Hòa tan ADN Loại bỏ các thành phần không phải là ADN Tủa ADN Rửa DNA Làm khô Kiểm tra và lưu trữ DNA Ví dụ: Chiết xuất và tinh sạch DNA từ lá chanh 1 Vật liệu: 2 Lá chanh Hóa chất: Nitơ lỏng; Cồn 700; Nước cất; EDTA; Agarose; Cồn 960; Ethidium bromide; Extraction buffer: CTAB buffer: TE 0.1 buffer: Isopropanol; SDS 10%; 0.1M Tris.HCl (pH 8); 0.5M NaCl; . Chương 6: SỰ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT GENOM Ở THỰC VẬT BẬC CAO ĐẶC ĐIỂM BỘ MÁY DI TRUYỀN CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT Tế bào thực vật là một tế. qua các thế hệ. Nguyên nhân biến dị ở thực vật KỸ THUẬT GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH VÀ DÒNG HÓA GEN Nhận diện tế bào chủ chứa đoạn DNA