BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG NANO PAMAM DENDRIMER ỨNG DỤNG TRONG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƢ Mã số: 112014 Chủ nhiệm đề tài: ThS.Nguyễn Thị Trâm Châu TP HỒ CHÍ MINH, 10/2015 BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG NANO PAMAM DENDRIMER ỨNG DỤNG TRONG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƢ Mã số: 112014 Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) TP HỒ CHÍ MINH, 10/2015 Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI Đơn vị công tác Nội dung nghiên cứu lĩnh vực chuyên môn cụ thể đƣợc giao ThS.NCS Nguyễn - Trƣờng ĐHCN TPHCM, Chủ nhiệm đề tài Thị Trâm Châu CSQN - Tổng hợp hữu PGS.TS Nguyễn Cửu - Viện Hàn lâm Khoa học Hƣớng dẫn tƣ vấn Khoa Cơng nghệ VN Họ tên - Vật liệu hóa dƣợc TS Trần Ngọc Quyển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ VN Hƣớng dẫn tƣ vấn - Vật liệu hóa dƣợc Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Bảng số liệu PAMAM dendrimer hệ 164 Bảng Trọng lƣợng phân tử dựa 1H-NMR PAMAM hệ -0.5, 2.0, 3.0 4.0 253 Bảng Khối lƣợng phân tử PEG, PAMAM G4 G4-PEG 286 Bảng Dữ liệu xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn 308 Bảng Kết lƣợng 5-Fu đƣợc mang G4-PEG-5-FU 319 Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Cấu tạo dendrimer Hình Cấu trúc PAMAM dendrimer Hình Cấu trúc dendrimer hệ Hình Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer hệ 153 Hình Quy trình tổng hợp PAMAM G 0.5 175 Hình Quy trình tổng hợp PAMAM G 2.0 186 Hình Quy trình tổng hợp PAMAM G 3.0 197 Hình Quy trình tổng hợp PAMAM G4.0 208 Hình 9: Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-NPC (a), NPC-PEG-TA (b), PAMAM G4-PEG (c) 219 Hình 10 Cơ chế mang thuốc cấu trúc PAMAM G4-PEG 20 Hình 11 Minh họa PAMAM G4 với số ghi proton đặc trƣng hệ 231 Hình 12 Phổ H-NMR PAMAM dendrimer hệ G-0.5, G2.0, G3.0, G4.0 242 Hình 13 Kết 1H NMR NPC-PEG-NPC (a) NPC-PEG-TA (b) 264 Hình 14 Kết FT-IR PAMAM G4 (a) G4-PEG (b) 275 Hình 15 Kết 1H NMR PAMAM G4 (a) G4-PEG (b) 286 Hình 16 Kết GPC G4-PEG 297 Hình 17 Hình ảnh TEM PAMAM G4 (a), PAMAM G4-PEG (b) 297 Hình 18: Biểu đồ đƣờng chuẩn 5-FU 308 Hình 19: Biểu đồ sắc ký 5-FU không đƣợc mang G4-PEG 308 Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI Ở TRO N G VÀ N GO ÀI NƢ ỚC 1.1 Giới thiệu đề tài .2 1.2.Tình hình nghiên cứu biến tính PAMAM dendrimer nhằm giảm độc tính 1.3 Tình hình nghiên cứu tăng cƣờng hiệu mang thuốc củar hệ PAMAM dendrimer biến tính với PEG Error! Bookmark not defined MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 12 ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 12 3.2 Phạm vi nghiên cứu 12 3.3 Cách tiếp cận phƣơng pháp nghiên cứu 13 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 4.1 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 142 4.2 Tổng hợp PAMAM hệ từ G= -0.5 đến G= 153 4.3 Tổng hợp PAMAM G4-PEG 208 4.4 Ứng dụng nanocarrier PAMAM G4-PEG mang thuốc điều trị ung thƣ 5-FU 20 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẠT ĐƢỢC 231 5.1 Kết phổ H-NMR PAMAM dendrimer hệ 231 5.2 Kết phổ H-NMR NPC-PEG-NPC NPC-PEG-TA 253 5.3 Kết PAMAM G4 PAMAM G4-PEG 264 5.4 Kết mang thuốc 5-FU G4-PEG 297 KẾT LUẬN 319 TÀI LIỆU THAM KHẢO .1 Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DMF Dimethylformamide EDA Ethylenediamine 5-FU 5-Fluorouracil GPC Gel permeation chromatography HPLC High pressure liquid chromatography Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR NPC p-Nitrophenyl chloroformate PAMAM Polyamidoamine PEG Polyethylene glycol TEM Transition electron microscopy THF Tetrahydrofuran Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang nano PAMAM dendrimer ứng dụng mang thuốc chống ung thƣ - Mã số: 112014 - Chủ nhiệm đề tài: NCS.ThS.Nguyễn Thị Trâm Châu Điện thoại: 0905.628 268 Email: nguyenthitramchau@yahoo.com - Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): Khoa: Công nghệ - Cơ sở Quảng Ngãi Tổ mơn: Hóa – Môi trƣờng - Thời gian thực hiện: tháng Mục tiêu: Tổng hợp PAMAM G4, từ biến tính PAMAM G4 polyethylene glycol (PEG), làm chất mang thuốc chống ung thƣ 5-FU Nội dung chính: (1) Tổng hợp PAMAM dendrimer hệ từ G= -0.5 đến G= (2) Xác định thành phần cấu trúc PAMAM dendrimer (3) Biến tính PAMAM G4 polyethylene glycol (PEG) (4) Xác định thành phần cấu trúc PAMAM G4-PEG Kết đạt đƣợc (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ) Sản phẩm khoa học: báo khoa học Bài báo quốc tế: [1] Thi Bich Tram Nguyena, Thi Tram Chau Nguyenb, Hoang Chinh Tranc, Cuu Khoa Nguyenc & Ngoc Quyen Tranc* (2015) 1H NMR Spectroscopy as an Effective Method for Predicting Molecular Weight of Polyaminoamine Dendrimers and their Derivatives, tạp chí quốc tế (SCIE) International Journal of Polymer Analysis and Characterization, Taylor & Francis Group, No.20, pp.57-68, 2015, DOI: 10.1080/1023666X.2014.955632 Bài báo nƣớc: [2] Nguyễn Thị Trâm Châu* , Trần Ngọc Quyển**, Nguyễn Cửu Khoa**, Trần Hữu Thái***, Bùi Văn Công***, Nguyễn Quang Thắng*** , Lê Thanh Lịch*** , Tôn Nữ Tố Nhi*** , Trần Quang Tuệ *** (2015) Tổng hợp vật liệu nanocarrier mang thuốc 5Fluorouracil (5-FU) hiệu quả, Tạp chí Đại học Cơng Nghiệp, TP.HCM (đã đƣợc duyệt đăng 4/2015); Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu MỞ ĐẦU Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật, ngƣời không ngừng nghiên cứu để tìm vật liệu nhằm phục vụ cho nhu cầu sống Công nghệ nano đời đáp ứng đƣợc nhu cầu cấp thiết Trong năm gần đây, nanopolymer đƣợc nghiên cứu rộng rãi phía ứng dụng y sinh Dendrimer nanopolymer đƣợc nghiên cứu nhiều với cấu trúc hình cầu có nhiều khoảng trống bên đƣợc ứng dụng làm chất mang thuốc, protein phân phối gen Hiện có nhiều quốc gia, trƣờng đại học, trung tâm nghiên cứu, công ty dƣợc phẩm đầu tƣ kinh phí nghiên cứu tổng hợp dendrimer để ứng dụng y học đời sống Với cấu trúc đặc biệt, cho phép dendrimer trở thành phƣơng tiện hiệu để vận chuyển vật liệu y sinh Ngày có nhiều loại thuốc đƣợc phát triển phải đối mặt với vấn đề độ hòa tan, tác dụng sinh học độ hấp thụ Nhiều báo cáo việc đóng gói loại thuốc điều trị ung thƣ vào nanocarrier nâng cao đáng kể độ tan nƣớc độ ổn định việc lƣu trữ thuốc, giúp tăng cƣờng hoạt động chống khối u giảm tác dụng phụ thuốc PAMAM dendrimer nanocarrier làm việc nhƣ cơng cụ hữu ích cho việc phân phối loại thuốc, nhƣ liệu pháp gen hóa trị Tuy nhiên, có vài nhƣợc điểm kèm với PAMAM dendrimer gây độc tính tan máu ly giải tế bào tƣơng tác mạnh mẽ nhóm -NH2 bên ngồi PAMAM dendrimer mang điện tích dƣơng với màng tế bào mang điện tích âm dẫn đến phá vỡ màng tế bào, gây độc cho tế bào, đồng nghĩa với hiệu điều trị chƣa cao[12-13, 23, 27] Để giải vấn đề này, bề mặt dendrimer đƣợc thay nhóm -NH2 nhóm -OH polyethylene glycol hoạt hóa, làm ngăn chặn tiếp xúc nhóm -NH2 với màng tế bào, giúp giảm độc tính tạo khả tƣơng tác sinh học cao chất mang, từ nâng cao hiệu mang thuốc điều trị [7, 24-25] Trang Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NG HIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI Ở TRONG VÀ NG OÀI NƢỚC 1.1 Giới thiệu đề tài 1.1.1 Dendrimer gì? Dendrimer bắt nguồn từ tiếng Hylạp “dendron”, có nghĩa nhánh Phân tử đƣợc tạo cách thêm tiếp đơn vị nhánh tỏa từ điểm khởi đầu Nếu phân tử dendrimer đủ lớn có dạng hình cầu, kích cỡ từ 1-10 nm Gần Polymer Dendrimer đƣợc tìm thấy tính chất đặc biệt nhƣ: có khối lƣợng phân tử cao, có tính chất nhánh khác nhiều so với polymer mạch thẳng Polymer dendrimers tổng hợp có khả phân nhánh cao, phân tử gần nhƣ đối xứng cấu trúc 1.1.2 Cấu tạo dendrimer Dendrimer đƣợc cấu tạo gồm phần: phần lõi (ethylene diamine (EDA), diaminobutyl (DAB), polyamidoamine (PAMAM), polypropylimine (PPI)), nhánh phát từ lõi tạo thành vòng tròn đồng tâm, nhóm chức ngồi (amine, carboxyl, rƣợu) Dendrimer có nhiều dạng khác nhau, dạng có đặc tính sinh học khác nhau, nên phân bố sinh học khác Hình Cấu tạo dendrimer 1.1.3 Polyamidoamine (PAMAM) dendrimer PAMAM dendrimer đƣợc tạo từ core ethylenediamine (EDA) phát triển nhánh methylacrylate ethylenediamine Trang Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu Hình Cấu trúc PAMAM dendrimer  Dendrimer hệ: Hình Cấu trúc dendrimer hệ => Là đối tượng nghiên cứu hấp dẫn chuyển tải tác nhân hóa học trị liệu vào tiếp xúc với khối u, điều trị nơi có khối u, đồng thời kiểm sốt đƣợc thời gian phóng thích thuốc, nhằm mục tiêu giảm tác dụng phụ không mong muốn tăng cƣờng hiệu điều trị 1.1.4 Những khó khăn hóa trị liệu điều trị ung thƣ Ung thƣ nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới Theo báo cáo tổ chức y tế giới tốc độ tăng trƣởng bệnh ung thƣ đến mức báo động toàn cầu Cho đến nay, có nhiều phƣơng pháp điều trị ung thƣ đƣợc phát triển đạt đƣợc thành công định, giúp bệnh nhân ung thƣ kéo dài thêm thời gian sống Ngày nay, có nhiều loại thuốc chống ung thƣ đƣợc nghiên cứu đƣa vào điều trị cho bệnh nhân Tuy nhiên, loại thuốc chống Trang Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu ung thƣ độc với tế bào bệnh lẫn tế bào lành Hầu hết thuốc chống ung thƣ có tác dụng phụ cho ngƣời bệnh, có độ hịa tan khó tồn trữ Độc tính thuốc trị ung thƣ Tác dụng thuốc chữa ung thƣ khơng đặc hiệu Các thuốc chữa ung thƣ có tác dụng độc, ngăn cản phân bào tế bào ung thƣ, nhƣng đồng thời gây độc với tế bào lành Hơn nữa, hầu hết thuốc trị ung thƣ có hệ số trị liệu thấp (khoảng cách liều điều trị liều gây độc tính nhỏ), chúng gây ảnh hƣởng cho tế bào liều điều trị, điều làm giới hạn trị liệu Các mô tăng sinh nhanh nhƣ tủy xƣơng, tế bào sinh sản, niêm mạc, da, nang tóc, đặc biệt bào thai,… nơi thƣờng biểu thị độc tính thuốc trị ung thƣ Do độc tính cao nên việc sử dụng hóa trị liệu chữa ung thƣ hạn chế Các biểu độc thƣờng gặp là:  Rối loạn tiêu hóa, buồn nơn nơn, viêm lt niêm mạc, táo bón, tiêu chảy  Rối loạn chức gan, tổn thƣơng ống thận  Rụng tóc, ban đỏ, viêm loét da  Với tủy xƣơng, hầu hết thuốc chữa ung thƣ làm suy yếu chức tủy xƣơng, hạn chế tạo hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu, gây thiếu máu; dễ bị xuất huyết dễ bị nhiễm khuẩn Cần kiểm tra máu thƣờng xuyên để điều chỉnh liều dùng ngừng thuốc  Với hệ nội tiết, thuốc có ảnh hƣởng xấu đến buồng trứng tinh hồn, dẫn đến vơ sinh  Với trẻ em, thuốc làm chậm tăng trƣởng phát triển  Ung thƣ thứ phát: dùng thuốc lại phát sinh ung thƣ mới, xảy sau nhiều tháng nhiều năm  Gây tổn thƣơng mạch máu đau truyền thuốc đƣờng tĩnh mạch, bị tiêm sau điều trị thời gian  Sút cân, ngƣời yếu, khơng cịn khả làm việc  Đã thấy thuốc gây quái thai động vật thí nghiệm Vì ngƣời dùng thuốc chữa ung thƣ khơng nên có Những tác dụng phụ gây sợ hãi lo lắng thƣờng xuyên, chí gây rối loạn tính cách, hành vi bệnh nhân Sự kháng thuốc tế bào ung thƣ Trang Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu Các tế bào ung thƣ kháng lại thuốc chữa ung thƣ nhƣ vi khuẩn kháng lại thuốc hóa trị liệu kháng khuẩn Cơ chế tế bào ung thƣ kháng thuốc gồm:  Làm giảm thâm nhập thuốc vào tổ chức ung thƣ  Làm giảm tích lũy thuốc, thải trừ thuốc khỏi tế bào ung thƣ “bơm” P - glycoprotein màng tế bào  Làm giảm hoạt tính thuốc cách chuyển hóa phân tử thuốc  Làm biến đổi protein mục tiêu yếu tố cần để thuốc tác động lên tế bào ung thƣ  Tăng cƣờng sửa chữa DNA sai hỏng tác động thuốc  Tăng tổng hợp protein để đảm bảo cho việc phân chia tế bào bị thuốc tác động Sự kháng thuốc đặc hiệu cho loại thuốc định nhƣng nhƣ kháng kháng sinh, tế bào ung thƣ có tƣợng kháng thuốc chéo  Hiệu điều trị thấp Do phần lớn thuốc trị ung thƣ tan nƣớc nên khả hấp thu thuốc vào thể qua đƣờng uống Lƣợng thuốc vào tuần hồn chung dạng cịn hoạt tính thấp Tiêm truyền phƣơng pháp tốt hơn, bảo đảm đƣợc lƣợng thuốc xâm nhập vào tuần hoàn chung Tuy nhiên, tiêm truyền thời gian dài gây đau tổn thƣơng mạch máu cho bệnh nhân Khi thuốc vào đƣợc tuần hồn chung phần nhỏ lƣợng thuốc đến đƣợc đích tác dụng, phần cịn lại phân bố vào quan khác bị chuyển hóa gan hay bị thải trừ thận dẫn đến nồng độ thuốc quan đích thấp, khơng phát huy đƣợc tác dụng Ví dụ: 5-FU, tiêm tĩnh mạch, nửa đời thải trừ trung bình khỏi huyết tƣơng khoảng 16 phút (từ đến 20 phút) Khơng cịn thấy thuốc dạng ngun vẹn huyết tƣơng sau tiêm tĩnh mạch đƣợc h 7-20% thuốc thải trừ dạng không biến đổi qua nƣớc tiểu sau h, số tới 90% thải trừ đầu Phần lại chuyển hóa phân giải gan tạo chất (carbon dioxide, urea, alpha-fluoro-beta-alanine) khơng có hoạt tính Các chất xuất qua nƣớc tiểu sau 3-4 h Trong lƣợng thuốc 5-FU xâm nhập đƣợc vào tế bào ung thƣ có khoảng 20% theo đƣờng đồng hóa phát huy tác dụng Khoảng Trang Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu 80% bị dị hóa dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) trở thành dạng bất hoạt tính nhanh chóng bị đào thải Do để đạt đƣợc nồng độ thuốc có tác dụng đích, theo cách thông thƣờng, phải đƣa vào thể lƣợng thuốc nhiều Nhƣng việc tăng liều lƣợng bị giới hạn liều độc nhƣ tác dụng phụ nhiều điều bất lợi khác Do đó, để tăng tốc độ sinh hóa giảm đề kháng thuốc khoảng cách liều dùng thuốc bắt buộc phải rút ngắn Điều gây bất tiện cho bệnh nhân trình điều trị ung thƣ tăng chi phí điều trị 1.1.5 Tìm hiểu kích thƣớc mơ tế bào hệ chất mang - Tại hầu hết mô khỏe mạnh, kích thƣớc khe hở lớp nội mơ thành mạch máu thƣờng nhỏ nanomet (nm - đơn vị đo phần tỉ mét) Các khe hở nhỏ so với kích thƣớc hầu hết chất mang nano - Cịn mơ ung thƣ, có phát triển tế bào ung thƣ địi hỏi tăng sinh mạch máu, vi mạch máu đƣợc hình thành mơ ung thƣ có kích thƣớc lên đến vài trăm nanomet - Do đó, với kích thƣớc dendrimer nhỏ 10nm, biến tính với số polymer tƣơng hợp sinh học nhỏ 50nm, nên khả khuếch tán chất mang thuốc đến vùng mô tập trung tế bào ung thƣ nhanh dễ dàng - Mặt khác, với kích thƣớc nói trên, chất mang thuốc cịn tải đƣợc hầu hết loại thuốc điều trị nhiều loại ung thƣ 1.2 Tình hình nghiên cứu biến tính PAMAM dendrimer nhằm giảm độc tính Dendrimer đƣợc Donald A Tomalia cộng tổng hợp lần vào năm 1980 Nó polymer đa nhánh, từ tâm (lõi) ngƣời ta phát triển nhánh dần bên PAMAM đƣợc tổng hợp từ ethylenediamine, methylacrylate Sau năm, năm 1985 khái niệm dendrimer đƣợc Donald A Tomalia cộng đƣa [33] Năm 1985, George R Newkon, chuyên gia hoá học trung tâm trƣờng Đại Học South Floride xuất báo dendrimer, ông tổng hợp dendrimer từ polyamidoalcol [22] Trong năm tám mƣơi ngƣời ta tổng hợp dendrimer xác định đƣợc tính Trang Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu chất vật lí hóa học [34-35] Năm 1999, Khoa Hóa học, đại học Califonia, Mỹ nghiên cứu thiết kế dendrimer ứng dụng làm tác nhân mang thuốc, mang gen, tác nhân hình ảnh cộng hƣởng từ hạt nhân Và theo hƣớng nghiên cứu này, nhiều nhà khoa học tiếp tục sâu phát triển [21] Năm 2000, Malik cộng phát dendrimer PAMAM cationic có nhóm bên ngồi NH2 nguyên nhân gây huyết giải đầu độc tế bào [20] Do bề mặt tế bào mang điện tích âm nên gặp dendrimer mang điện tích dƣơng có tƣơng tác với làm phá vỡ màng tế bào, dẫn đến tiêu hủy tế bào [1516] Năm 2003, D Bhadra đồng nghiệp tiến hành lai hóa MPEG 5000 với PAMAM core EDA hệ G4.0 Kết xác định độ độc chuột nhóm nghiên cứu cho thấy PAMAM khơng lai hóa có tƣợng gây độc máu tế bào, số lƣợng hồng cầu giảm xuống 10 6-2  106/L số lƣợng bạch cầu tăng lên đến  10 3-4  10 3/l; cịn PAMAM lai hóa MPEG có độc tính giảm đi, số lƣợng bạch cầu tăng từ 10 3-1,5  10 3/L Các nghiên cứu in vivo loại dendrimer khác cho thấy PEG hóa làm giảm độc tính nhiều Trên chuột nghiên cứu, liều độc melamine dendrimer gan ≥10 mg/kg, liều độc dendrimer lai hóa 50% PEG bề mặt lên đến g/kg [8] Năm 2005, Viện công nghệ nano Michigan sinh học thuốc, Mỹ nghiên cứu động lực học phân phối thuốc dendrimer biến tính nhằm làm tăng độ tan nƣớc giảm độc tính thuốc điều trị [6] Một loạt báo cáo nhóm nghiên cứu Thommey P Thomas James R Baker Jr từ năm 2004 đến 2010 hợp chất mang thuốc chữa trị ung thƣ hƣớng mục tiêu đến tế bào ung thƣ dựa sở dendrimer PAMAM G5 với kháng thể đơn dòng (kháng thể anti-PSMA, kháng thể Anti-HER2) Những tổ hợp nhắm mục tiêu đến dòng tế bào ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, … có độc tính tế bào thấp so với thuốc chống ung thƣ tự methotrexate [6, 28-32] Một số cơng trình nghiên cứu khác nƣớc ngồi loại thuốc chống ung thƣ (Camptothecin, 6-Mercaptopurin, Methotrexate, Adriamycin, 5Fluorouracil, Doxorubicin Paclitaxel) đƣợc bao bọc dendrimer PAMAM làm tăng đáng kể độ tan, khả lƣu trữ, hoạt tính chống ung thƣ thuốc Trang Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu Tại Việt Nam, năm 2007, nhóm nghiên cứu PGS TS Nguyễn Cửu Khoa, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng-Viện Khoa học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh đƣợc xem đơn vị nghiên cứu tổng hợp dendrimer với nhiều dạng khác [1-2, 4-5] Từ năm 2010 đến 2013, nhóm tác giả Nguyễn Cửu Khoa cho thấy dendrimer hệ chẵn (với nhóm amine bề mặt) có độc tính với tế bào ( in vitro) cao so với dendrimer hệ lẻ (với nhóm chức ester bề mặt) [3, 19, 23] Điều giải thích nhóm amine tích điện dƣơng nên tạo liên kết tốt với màng tế bào (tích điện âm) gây độc cho tế bào điện tích dƣơng bề mặt chúng [26] Đối với dendrimer, đặc tính sinh học nhƣ độc tố hay tính sinh miễn dịch chịu ảnh hƣởng lớn kích thƣớc nhóm chức bên ngồi Độc tính giảm dần nhóm chức bên theo thứ tự nhƣ sau: NH3+> Guanidin+ >SO32- >PO32- >COO->PEG Muốn làm giảm độ độc dendrimer biến tính nhóm chức bề mặt với tác nhân độc hại Trong việc gắn nhóm PEG, pluronic, acetyl, ancolhol mạch dài, acid mạch dài,… vừa có tác dụng giảm độ độc dendrimer vừa kéo dài thêm bán chu kỳ tuần hoàn máu (blood halflives) giảm tích lũy thể 1.3 Tình hình nghiên cứu tăng cƣờng hiệu mang thuốc hệ PAMAM dendrimer biến tính với PEG Nhƣ đề cập trên, mục đích việc PEG hóa giảm tính sinh miễn dịch chất mang PAMAM Ngồi ra, với tính chất đặc biệt PEG vừa có khả tan tốt nƣớc vừa tan đƣợc dầu nên PEG kết hợp với PAMAM tăng khả hydrate hóa bề mặt, tạo thuận lợi cho việc dẫn thuốc kỵ nƣớc thể [17] Năm 2000, Chie Kojima cộng tổng hợp PAMAM hệ 3.0 4.0 gắn kết với MPEG khối lƣợng phân tử 550 2000 Sau đó, nhóm nghiên cứu sử dụng sản phẩm PAMAM-MPEG nang hóa khảo sát giải phóng thuốc hai loại thuốc trị ung thƣ có tính dầu adriamycin (ADR), methotrexate (MTX) Kết sản phẩm PAMAM 4.0 kết hợp với MPEG 2000 mang đƣợc 6,5% ADR 26% Trang Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu MTX Thuốc MTX đƣợc nang hóa PAMAM-MPEG đƣợc phóng thích cách từ từ dung dịch nƣớc [16] Hình Sự kết hợp PEG - PAMAM với adriamycin, methotrexate Không vậy, số nghiên cứu khác việc lai hóa PEG cịn kéo dài thời gian lƣu dendrimer tuần hồn máu Dendrimer khơng lai hóa nhanh chóng bị thải trừ khỏi máu tập trung quan nhƣ gan hay thận sau vài phút hay vài Theo nghiên cứu Kukowska - Latallo, PAMAM G5.0 đánh dấu tritium đƣợc thể nhanh chóng đào thải qua đƣờng thận 24 h sau tiêm Trong nghiên cứu khác, PAMAM đƣợc đánh dấu với đồng vị 125 I tiêm thử nghiệm vào chuột Wistar, sau 1h khoảng 1% lƣợng PAMAM lƣu lại máu 60% lƣợng PAMAM tập trung gan Nhƣng lai hóa với PEG, thời gian lƣu tuần hoàn chung đƣợc tăng lên đến 24h, dendrimer chủ yếu đƣợc phân bố máu quan khác, nhờ kéo dài thời gian bán thải giảm độ thải thuốc Cũng nghiên cứu nhóm Bhadra năm 2003 [8], thuốc chống ung thƣ 5-fluorouracil đƣợc lần lƣợt nang hóa chất mang PAMAM G4.0 khơng lai hóa lai hóa 25% bề mặt với PEG 5000 Kết khảo sát in vitro cho thấy so với PAMAM khơng lai hóa, PAMAM lai hóa có khả mang lƣợng thuốc gấp đến 12 lần tốc độ giải phóng thuốc giảm lần, thời gian phóng thích thuốc hồn tồn kéo dài đến ngày Nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành so sánh in vivo chuột kết tƣơng tự Khi khơng PEG hóa, nồng độ cực đại thuốc huyết tƣơng cao, thời gian đạt nồng độ cực đại nhanh (Cmax =21-23 g/mL, tmax =3 h) kết thời gian lƣu thuốc tuần hoàn thấp (6-7 h) Cịn PEG hóa, nồng độ Cmax giảm khoảng 1/3, thời gian đạt đƣợc chậm t max =7 h, mang lại hiệu kéo dài thời gian thuốc tồn huyết tƣơng, lên đến 12 h Trang Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu Hình Mơ hình PAMAM-MPEG mang thuốc 5-Fluorouracil Năm 2008, Shuhua Bai cộng tiếp tục tổng hợp PAMAM-MPEG với MPEG khối lƣợng phân tử 2000 PAMAM hệ G3.0 Sau tổng hợp thành cơng PAMAM-MPEG, nhóm nghiên cứu tiến hành nang hóa PAMAM-MPEG với thuốc chống đơng máu Heparin (LMWH) Nhờ nang hóa cấu trúc PAMAMMPEG mà độ hấp thu qua đƣờng hô hấp sinh khả dụng LMWH tăng 60,6% so với LMWH tiêm dƣới da bình thƣờng Thời gian bán thải thuốc đƣợc nang hóa 11,9 h; tăng gấp 2,4 lần so với LMWH saline thông thƣờng Đáng ý hiệu phóng thích thuốc từ từ MPEG - PAMAM cho phép giãn khoảng cách hai lần dùng thuốc lên gấp đôi, 48 h, mà bảo đảm hiệu nhƣ LMWH thông thƣờng tiêm cách quãng 24 h việc giảm kích thƣớc huyết khối in vivo chuộ t [28] Cũng theo nghiên cứu nhóm G Pasut PAMAM G3.0 năm 2005, hiệu lai hóa PEG lại hầu nhƣ khơng chịu ảnh hƣởng mức độ lai hóa [37] Từ kết này, nhóm nghiên cứu đƣa giả thuyết phân tử thuốc đƣợc nang hóa chủ yếu cấu trúc dendrimer bị nhốt chuỗi PEG Năm 2009 2010, hiệu mang giải phóng thuốc lai hóa PEG đƣợc khẳng định kết số nghiên cứu khác Arunvel Kailasan cộng [14], Chie Kojima cộng [9] Năm 2011, nhóm tác giả Dan Liu cộng tổng hợp copolymer nhạy pH mang thuốc Doxorubicin thử nghiệm tế bào ung thƣ gan chuột Cấu tạo copolymer dựa tƣơng tác tĩnh điện PAMAM mang thuốc Doxorubicin (Dox) poly(methacryloyl sulfadimethoxine) (PSD) nhạy pH Trên PSD đƣợc gắn với PEG (Polyethylene glycol) để tăng tính tƣơng hợp sinh học dẫn xuất lactose để định hƣớng đến tế bào gan [10] Trang 10 Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu Năm 2011, Zhu S cộng tổng hợp thành công hệ mang thuốc dendrimer sở polyester với chất tƣơng hợp sinh học PEG thông qua liên kết amide thuốc doxorubicin thông qua cầu nối hydrazone Glu đƣợc gắn bề mặt dendrimer doxorubicin (hình 1.31) [36] Hình Cấu trúc hóa học PEG-Dendrimer gắn với doxorubicin thông qua mối nối hydrazone [36] Năm 2013, nhóm tác giả P Dinesh Kumar cộng thực biến tính PAMAM G4 (G5) MPEG Trong MPEG đƣợc hoạt hóa NPC cho mang thuốc HIV, nhóm tác giả kiểm tra khả giải phóng thuốc in vitro PAMAM chƣa biến tính biến tính mơi trƣờng đệm PBS Kết cho thấy PAMAM đƣợc biến tính MPEG cho hiệu mang thuốc cao, giải phóng thuốc chậm (hình 1.32) giảm khả gây độc tế bào so với PAMAM chƣa biến tính [11] Gần năm 2015, Luis F Barraza cộng dừng lại mức độ biến tính PAMAM G4 PEG mang thuốc 5-FU Trong đó, PEG đƣợc hoạt hóa trƣớc qua bƣớc NPC hình thức khống chế tỷ lệ 1:1, điều dễ dẫn đến khả PEG bị hoạt hóa hai đầu NPC kết PEG liên kết đầu vào PAMAM, tạo lớp màng bao phủ bề mặt PAMAM ngăn cản phần thuốc khơng vào khoảng trống cấu trúc PAMAM Nhóm tác giả thực bƣớc khảo sát ảnh hƣởng hiệu liên kết PEG 25%-100% lên PAMAM G4 đến hình thức lƣu trữ thuốc Kết rằng, hiệu biến tính PAMAM G4 PEG đạt 50% khả thuốc 5-FU đƣợc mang vào sâu bên cấu trúc PAMAM thấp, Trang 11 Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu thuốc 5-FU chủ yếu tập trung phía gần bên ngồi bề mặt PAMAM, cịn hiệu biến tính PAMAM G4 PEG đạt khoảng 25% lƣợng thuốc 5-FU đƣợc mang vào sâu bên cấu trúc PAMAM G4 kèm theo hỗ trợ nhóm PEG có tƣợng gập chuỗi lại giúp khả lƣu trữ thuốc hiệu [18] Nhìn chung năm gần đây, có nhiều nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM polymer tƣơng hợp sinh học Tuy nhiên, hầu hết nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp hoạt hóa PEG NPC khơng chế tỷ lệ mol 1:1 (PEG : NPC) dều có sử dụng xúc tác hay dung mơi q trình phản ứng Nhƣợc điểm phƣơng pháp dễ xảy khả PEG bị hoạt hóa hai đầu NPC kết PEG liên kết đầu vào PAMAM, tạo lớp màng bao phủ bề mặt PAMAM ngăn cản phần thuốc khơng vào khoảng trống cấu trúc PAMAM Vì cơng trình nghiên cứu này, chúng tơi tập trung biến tính dendrimer PAMAM G4 hoạt hóa NPC TA nhằm tăng cƣờng khả liên hợp tồn trữ thuốc hệ chất mang nano PAMAM-PEG MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Tổng hợp PAMAM G4, từ biến tính PAMAM G4 PEG (polyethylene glycol), làm chất mang thuốc hiệu ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu: PAMAM G4.0 3.2 Phạm vi nghiên cứu (1) Tổng hợp PAMAM dendrimer đến G= 4.0 (2) Tổng hợp hệ chất mang PAMAM G4-PEG (3) Ứng dụng mang thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) Trang 12 Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu 3.3 Cách tiếp cận phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Cách tiếp cận Các hệ dendrimer đƣợc tổng hợp Việt Nam dựa theo quy trình nhƣ báo cáo Tomalia kết nghiên cứu nhóm tác giả Nguyễn Cửu Khoa, TS Trần Ngọc Quyển Trên sở kết nghiên cứu trên, nội dung nghiên cứu đề tài này, tổng hợp vật liệu nanocarrier PAMAM G4-PEG mang thuốc 5-Fluorouracil (5FU) hiệu 3.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu (1) Phương pháp tổng hợp Tổng hợp PAMAM đến hệ G4.0 nanocarrier PAMAM G4-PEG phƣơng pháp tổng hợp hữu (2) Phương pháp tinh kiểm tra sản phẩm - Các chất sau tổng hợp đƣợc làm phƣơng pháp cô đuổi dung môi sử dụng thiết bị cô quay chân không, thẩm tách túi thẩm tách Spectra Por Regenerated Cellulose Membrane - Kiểm tra cấu trúc hóa học sản phẩm thu đƣợc phƣơng pháp phổ đại nhƣ: 1H-NMR, FT-IR, GPC - Kiểm tra cấu trúc hình học kích thƣớc sản phẩm thu đƣợc phƣơng pháp TEM (3) Phương pháp đánh khả mang thuốc - Phƣơng pháp HPLC để xác định lƣợng 5-FU mang hệ nanocarrier PAMAM G4-PEG Trang 13 Đề tài cấp trƣờng 2014 ThS Nguyễn Thị Trâm Châu NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 4.1 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 4.1.1 Hóa chất 4.1.2 Thiết bị dụng cụ - Phổ hồng ngoại FT-IR đƣợc đo máy IR- Vector 22 BRUKER (Đức) - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR đo máy Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer - Trọng lƣợng phân tử đƣợc đo phƣơng pháp sắc ký gel (GPC) máy Agilent 1100 - HPLC đo máy Agilent 1200-GPC - TEM đƣợc chụp máy Gieon-1400 (JEOL, Tokyo, Nhật Bản) - Máy đông khô - Máy khuấy từ gia nhiệt hiệu Thermo Scientific Trang 14 ... THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG NANO PAMAM DENDRIMER ỨNG DỤNG TRONG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƢ Mã số: 112014 Chủ nhiệm... NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang nano PAMAM dendrimer ứng dụng mang thuốc chống ung thƣ - Mã số: 112014 - Chủ nhiệm... nghiên cứu trên, nội dung nghiên cứu đề tài này, tổng hợp vật liệu nanocarrier PAMAM G4-PEG mang thuốc 5-Fluorouracil (5FU) hiệu 3.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu (1) Phương pháp tổng hợp Tổng hợp PAMAM