PHẦN I - CƠ CHẾ CỦA QUÁ TRÌNH SPLICINGViệc biểu hiện thông tin của một gen thông thường liên quan đến phân tử RNA được phiên mã từ khuôn DNA. Sau khi được tổng hợp, phân tử RNA (ở một số bacteria và đa số ở Eukaryote) phải trải qua một số quá trình “sơ chế” trước khi ra khỏi nhân tế bào. Một sự kiện thú vị nhất xảy ra trong quá trình chuyển hóa phân tử RNA là processing (chế biến mRNA). Ngạc nhiên hơn nữa, một số enzyme xúc tác cho các phản ứng này là phân tử RNA chứ không phải là protein. Việc phát hiện ra những chất xúc tác là RNA (hay còn gọi là ribozyme), đã mang lại một cuộc cách mạng trong suy nghĩ về chức năng của phân tử RNA và về nguồn gốc của sự sống.Phân tử RNA mới được tổng hợp xong được gọi là primary transcript (bảng phiên mã sơ cấp) hay còn gọi là pre-mRNA. Bảng phiên mã sơ cấp của phân tử mRNA (ở Eukaryote) chủ yếu chứa các trình tự hoàn thiện của một gen, mặc dù các trình tự này có thể mã hóa cho các chuỗi polypeptide không kế tiếp nhau.Những vùng không mã hóa của phân tử pre-mRNA gọi là intron và phần mã hóa được gọi là exon.Nhìn chung, các bước tổng quát trong quá trình xử lý mRNA bao gồm các sự kiện: - Gắn mũ vào đầu 5’ và gắn đuôi poly(A) vào đầu 3’ (xảy ra cùng lúc phiên mã).- Splicing (cắt nối gen)Ở đây, chúng tôi xin bàn kĩ về quá trình splicing.Thật ra, splicing là quá trình cắt bỏ các đoạn intron và nối các đoạn exon lại với nhau. Cả intron và exon đều được phiên mã từ DNA.Ở bacteria, một chuỗi polypeptide thường được mã hóa bởi một đoạn DNA, quá trình mã hóa cứ tiếp tục dọc theo đoạn DNA cho đến khi thông tin cần thiết để xác định cho chuỗi polypeptide hoàn tất mà không có bất kì sự ngắt quãng nào. Tuy nhiên, khái niệm rằng tất cả các gen là liên tục bị bác bỏ vào năm 1977 khi Phillip Sharp và Richard Roberts độc lập khám phá ra rằng nhiều gen polypeptide ở sinh vật nhân chuẩn bị gián đoạn bởi các trình tự không mã hoá (intron).Phần lớn các gen ở động vật có xương sống có chứa intron (trong số các trường hợp ngoại lệ là những gen mã hoá histone). Sự xuất hiện của intron ở các loài Eukaryote là khác 1 nhau. Nhiều gen trong nấm men Saccharomyces cerevisiae là thiếu intron, mặc dù ở một số loài nấm men khác intron phổ biến hơn. Intron cũng được tìm thấy trong một vài gen của eubacterial và archaebacterial.Intron trong DNA được phiên mã dọc theo phần còn lại của gen nhờ enzyme RNA polymerase. Các đoạn intron trong bảng phiên mã sơ cấp sau đó được cắt đi, các đoạn exon nối lại với nhau tạo thành phân tử RNA trưởng thành và đầy đủ chức năng.Trong phân tử mRNA của Eukaryote, hầu hết các đoạn exon có chiều dài dưới 1000 nucleotide, mã hóa từ 30 đến 60 acid amin trong một chuỗi polypeptide. Các đoạn intron khác nhau về kích thước, từ 50 đến 20000 nucleotide. Có nhiều gen ở Eukaryote (bao gồm cả con người), số lượng intron còn nhiều hơn cả exon. Có 4 nhóm intron, mỗi nhóm khác nhau về chi tiết cắt nối nhưng có chung một điểm là chúng tự cắt nối (self-splicing) chứ không nhờ bất cứ enzyme protein nào tham gia.Nhóm intron I được tìm thấy thỉnh thoảng ở nhân, ty thể, lạp thể, mã hóa cho các phân tử mRNA, tRNA và rRNA. Nhóm intron II thông thường được tìm thấy ở bảng phiên mã sơ cấp của ty thể hoặc lục lạp của nấm, tảo và thực vật. Thi thoảng, nhóm intron I và II cũng được tìm thấy ở bacteria. Cả 2 nhóm này đều không đòi hỏi cao về năng lượng (như ATP) cho quá trình splicing.Cơ chế splicing của cả 2 nhóm đều liên quan đến 2 bước phản ứng trao đổi este (transesterification).Một phân tử đường ribose chứa nhóm OH ở vị trí 2’ hoặc 3’ sẽ tấn công vào nhóm phosphor và trong mỗi bước, một liên kết phosphodiester được tạo thành, duy trì cân bằng năng lượng.Ở nhóm intron I, phản ứng cắt nối cần một phân tử Guanine nucleoside hoặc nucleotide (cofactor), các cofactor này không đóng vai trò cung cấp năng lượng mà thay vào đó, nhóm 3’OH của Guanosine (G) được dùng như một nucleophile (tác nhân thân hạch) trong bước đầu tiên của quá trình splicing. Nhóm 3’OH sẽ hình thành nên một liên kết 3’,5’-phosphodiester với đầu 5’ của intron. Nhóm 3’OH của đoạn exon được chuyển chỗ trong bước này và lại hoạt động như một nucleophile, tướng tác với đầu 3’ của đoạn intron. Kết quả là các đoạn intron được cắt chính xác và nối các đoạn exon lại.2 Hình 1: Phản ứng trao đổi esteĐây là bước đầu tiên trong quá trình splicing của nhóm I. Ở đây, đầu 3’ của Guanosine (G) đóng vai trò như nucleophileHình 2: Cơ chế splicing của nhóm intron ICác nucleophile có thể là Guanosine, GMP, GDP, GTP. Các đoạn intron bị cắt ra cuối cùng sẽ suy biến.Cơ chế tự cắt nối của intron lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1982 trong các nghiên cứu về cơ chế splicing của các đoạn intron nhóm I của rRNA từ mao sinh vật đơn 3Nhóm 3’OH của Guanosine hoạt động như một nucleophile, tấn công vào vùng 5’ của đoạn intronPre-mRNAĐầu 3’OH của exon đầu trở thành nucleophile và tiếp tục phản ứng với nhóm phosphate ở đầu 5’ của exon sauGiai đoạn trung gianRNA sau khi cắt nối bào Tetrahymena thermophila, được thực hiện bởi Thomas Cech và các đồng nghiệp. Họ phân lập DNA (bao gồm cả intron) từ Tetrahymena rồi tiến hành sao chép trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme RNA polymerase tinh khiết từ vi khuẩn. Kết quả là RNA tự cắt nối chính xác mà không có sự tham gia của bất kỳ enzyme protein nào từ Tetrahymena. Việc phát hiện ra các phân tử RNA có thể có chức năng xúc tác như là một mốc quan trọng trong sự hiểu biết của chúng ta về hệ thống sinh học.Ở nhóm intron II, các phản ứng xảy ra tương tự như trên trong bước 1, nhưng ở đây, nhóm 2’OH của Adenosine nằm phía trong đoạn intron. Một cấu trúc thòng lọng (lariat) được tạo thành như một cầu nối trung gian.Hình 3: Cơ chế cắt nối của nhóm intron IIVề mặt hóa học thì nhìn chung là tương tự nhóm intron I, ngoại trừ việc Adenosine đóng vai trò là nucleophile (thay vì là Guanosine) và cấu trúc thòng lọng được hình thành với liên kết 2’,5’ phosphodiester giữa Adenosine và đầu 5’ của intron.4Đầu 2’OH của Adenosine nằm trong intron hoạt động như nucleophile, tấn công vào đầu 5’của đoạn intron để tạo nên cấu trúc thòng lọngPre-mRNAGiai đoạn trung gianRNA sau khi cắt nốiĐầu 3’OH của exon đầu trở thành nucleophile và tiếp tục phản ứng với nhóm phosphate ở đầu 5’ của exon sauAdenosine trong cấu trúc thòng lọng có 3 liên kết phosphodiester Nhóm intron III và là nhóm lớn nhất được tìm thấy ở bảng phiên mã sơ cấp nằm trong nhân. Chúng được gọi là spliceosomal intron, bởi vì việc loại bỏ chúng diễn ra trong vòng và được xúc tác bởi một phức hệ protein lớn gọi là spliceosome. Trong các spliceosome, các đoạn intron trải qua quá trình splicing bởi cơ chế thòng lọng, tương tự như nhóm intron II.Spliceosome được tạo thành từ một phức hợp đặc biệt gồm snRNA và protein gọi là snRNP (small nuclear ribonucleoprotein). Các snRNA (small nuclear RNA) có chiều dài từ 100-200 nucleotide, có 5 loại snRNA liên quan đến quá trình splicing được tìm thấy trong nhân tế bào Eukaryote là U1, U2, U4, U5, U6. Các RNA và protein trong snRNP được bảo tồn cao trong tế bào Eukaryote từ nấm men cho đến người.Các spliceosomal intron thường chứa trình tự dinucleotide GU và AG ở đầu 5’ và 3’ và những vùng này là nơi xảy ra splicing.Do SnRNA U1 có chứa một chuỗi bổ sung cho trình tự gần đầu 5’ của đoạn intron nên nó liên kết với pre-mRNA ở vị trí này. Đồng thời, các snRNP U2, U4, U5, và U6 cũng đến tụ họp lại hình thành nên các spliceosome. Các snRNP đóng góp 5 loại RNA và khoảng 50 protein cho các spliceosome. Việc lắp ráp các spliceosome đòi hỏi cần có ATP, nhưng phản ứng cắt nối RNA dường như không yêu cầu ATP.Một số intron của mRNA được ghép bởi ít nhất một loại spliceosome, trong đó snRNP U1 và U2 được thay thế bằng snRNP U11 và U12 (chúng nhận biết trình tự AU và AC ở 2 đầu 5’ và 3’ thay vì là GU và AG) như thể hiện trong hình 4.Một số thành phần của bộ máy cắt nối xuất hiện được nối với CTD của RNA polymerase. Khi bước cắt đầu tiên được tiến hành, nó bị ràng buộc bởi một tethered spiceosome, sau bước cắt thứ hai đã tạo điều kiện cho 2 đầu cuối của đoạn intron nằm gần nhau và tiếp theo đó là quá trình nối. Sau khi cắt thì đoạn intron vẫn còn nằm trong nhân, và sau đó chúng cũng bị suy biến.Nhóm intron thứ 4 được tìm thấy trong một số tRNA, chúng phân biệt với nhóm intron I va II ở chỗ là cần ATP và enzyme Endonuclease cho quá trình cắt nối. Endonuclease sẽ cắt liên kết phosphodiester ở cả 2 đầu của intron và 2 đoạn exon sẽ nối lại với nhau bằng cơ chế tương tự như phản ứng của enzyme DNA ligase.5 Trong 4 nhóm intron nói trên thì nhóm intron thứ ba là các spiceosomal intron xuất hiện giới hạn trong tế bào Eukaryote.6(a) Hình 4: Cơ chế splicing ở pre-mRNAa, Phân tử m-RNA tương tác với phức hợp spliceosome. Đầu 5’ của snRNA U1 tiến lại gần đầu 5’ của intron và bắt cặp. snRNA U2 sẽ được bắt cặp tại vị trí A (màu hồng) và trở thành nucleophile trong suốt quá trình splicing. Cặp base của snRNA gây ra sự di chuyển và giúp kích hoạt Adenylate, nhóm 2’OH của nó sẽ hình thành nên cấu trúc thòng lọng thông qua liên kết 2’,5’ phosphodiester.b, Sự tụ họp của spliceosome. Đầu tiên là snRNA U1 và U2 kết hợp với nhau, sau đó, các thành viên còn lại của snRNA (phức hợp U4/U5, U6) gắn lại tạo thành một dạng spliceosome không hoạt động, tiếp đó là sự sắp xếp lại nội bộ để chuyển sang dạng hoạt động. U1 và U4 được giải phóng trước, U6 bắt cặp với vị trí splice 5’ của intron và U2, quá trình cắt nối xảy ra tương tự như nhóm intron II.c, Một cơ chế cắt nối khácSau khi các đoạn intron được cắt đi, các đoạn exon nối lại với nhau tạo thành một phân tử mRNA có trình tự mã hóa liên tục. Trong quá trình ghép nối, các đoạn exon có thể xáo trộn với nhau, từ đó tạo ra nhiều phân tử mRNA mang trình tự mã hóa khác nhau. Như vậy, nhiều gen có thể mã hóa cho hai hay nhiều chuỗi polypeptide khác nhau, điều này tùy thuộc vào việc phân đoạn 7(b)(c) nào được chọn làm exon và quá trình ghép nối các exon trong quá trình hoàn thiện mRNA và số protein mà mỗi cơ thể tạo ra có thể lớn hơn nhiều so với số lượng gen mà cơ thể đó có. TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Giáo trình “Principles of Biochemistry” (David L.Nelson and Michael M.Cox)2. Giáo trình “Campbell Biology”8 . lúc phiên mã).- Splicing (cắt nối gen)Ở đây, chúng tôi xin bàn kĩ về quá trình splicing. Thật ra, splicing là quá trình cắt bỏ các đoạn intron và nối các. Guanosine (G) đóng vai trò như nucleophileHình 2: Cơ chế splicing của nhóm intron ICác nucleophile có thể là Guanosine, GMP, GDP, GTP. Các đoạn intron