hiệu quả của môi trờng GEYC trong bảo quản lạnh sâu tinh trùng ngời Trịnh Bình, Trịnh Sinh Tiên Nguyễn Ngọc Hùng và Nguyễn Thị Bình Đại học Y Hà Nội Sử dụng môi trờng GEYC đợc tự pha tại phòng thí nghiệm bảo quản 30 mẫu tinh trùng ngời bằng lạnh sâu cho kết quả chất lợng tinh trùng sau bảo quản đảm bảo theo tiêu chuẩn của AATB. Môi trờng GEYC có thể chủ động tự pha tại phòng thí nghiệm có giá thành phù hợp với điều kiện Việt Nam. (Từ viết tắt: GEYC: Glycerol-Egg Yolk-Citrat; CSF: Cryosurvival factor; TT: tinh trùng) I. đặt vấn đề Theo thời gian, nhiều môi trờng đã đợc sử dụng để bảo quản lạnh tinh trùng ngời. Những công bố về hiệu quả của các môi trờng trong bảo quản lạnh tinh trùng rất khác nhau. Theo các tác giả Silva A.L, Yamasaki R, de Sala M.M, Cabrera M da G, de Sa M.F (1996) [6], qua nghiên cứu Đánh giá hiệu quả khi thêm sodium citrate và fructose hoặc sodium citrate vào môi trờng có egg yolk, glycerol và TEST trong bảo quản lạnh tinh trùng ngời đã có nhận xét: tỷ lệ tinh trùng di động và tỷ lệ tinh trùng sống đều giảm ở cả 2 khoảng thời gian bảo quản so với trớc khi bảo quản. Các chỉ số này không có sự khác biệt khi so sánh 3 loại môi trờng và ở 2 khoảng thời gian bảo quản. Sau tan đông 2 giờ, các chỉ số đều giảm so với phân tích ngay sau khi tan đông. Năm 1999, J.K Sherman [5] kết luận: tỷ lệ tinh trùng sống sau bảo quản nếu sử dụng môi trờng bảo quản là glycerol-egg yolk hay glycerol đơn thuần đều không có sự khác nhau. Năm 2000, các tác giả Hallak J, Sharma R.K, Wellstead C, Agarwal A [3] đã nghiên cứu so sánh khi sử dụng môi trờng bảo quản là TEST-Yolk và glycerol ở các khoảng thời gian bảo quản 0; 60; 120; 180 phút. Kết quả cho thấy: tỷ lệ tinh trùng di động giảm ở cả hai nhóm, nhng tỷ lệ tinh trùng di động nhóm TEST-Yolk cao hơn ở các khoảng thời gian bảo quản so với nhóm glycerol. Về mặt hình thái, tỷ lệ tinh trùng bình thờng ở nhóm TEST Yolk cũng cao hơn (p < 0,05). Kết quả đã khẳng định sử dụng TEST Yolk là môi trờng bảo quản lạnh tinh dịch sẽ đem lại mẫu tinh dịch sau bảo quản lạnh có chất lợng tốt hơn so với việc sử dụng glycerol. Do đó, các tác giả đã có khuyến cáo TEST Yolk là môi trờng đợc lựa chọn đầu tiên để bảo quản lạnh tinh trùng ngời. ở Việt Nam, bảo quản lạnh tinh trùng ngời để phục vụ cho việc chăm sóc sức khoẻ sinh sản là vấn đề rất cần thiết và mới mẻ. Trong số các môi trờng đợc các nhà chuyên môn trên thế giới cũng nh trong nớc đã sử dụng để bảo quản lạnh tinh trùng, môi trờng nào phù hợp với điều kiện, hoàn cảnh Việt Nam? Nh vậy, môi trờng bảo quản có ý nghĩa quan trọng đến chất lợng bảo quản tinh trùng. Để có thể vừa chủ động đợc môi trờng, vừa đảm bảo đợc chất lợng bảo quản tinh trùng cũng nh với giá thành hợp lý chúng tôi mạnh dạn nghiên cứu Hiệu quả của môi trờng GEYC trong bảo quản lạnh sâu tinh trùng ngời với mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của môi trờng GEYC trong bảo quản tinh trùng ngời bằng lạnh sâu. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng nghiên cứu. - 30 mẫu tinh dịch có tinh dịch đồ bình 9 - Công trình đợc thực hiện tại Lao. bảo quản Mô - Phôi của trờng Đại học Y Hà Nội. thờng đợc xét nghiệm và bảo quản lạnh sâu tại phòng bảo quản Mô - Phôi, Trờng Đại học Y Hà Nội. - Tiêu chuẩn chọn đối tợng nghiên cứu: + Nam giới trong độ tuổi sinh sản. + Đã không xuất tinh từ 3 đến 5 ngày. + Không sốt, không dùng thuốc, không uống rợu tại thời điểm lấy mẫu. 2. Phơng pháp nghiên cứu. Sử dụng phơng pháp nghiên cứu can thiệp. Đánh giá trớc và sau can thiệp tại các thời điểm khác nhau. 2.1. Xét nghiệm tinh dịch. a. Khảo sát đại thể. b. Khảo sát vi thể: Đánh giá mật độ và độ di động tinh trùng bằng kính hiển vi quang học và buồng đếm Makler. Tiến hành sau khi mẫu tinh dịch đã ly giải hoàn toàn. - Đánh giá tỷ lệ tinh trùng di động. + Tinh trùng di động tiến tới nhanh. + Tinh trùng di động chậm và tại chỗ. + Tinh trùng không di động. Đếm tổng cộng 200 tinh trùng trên vi trờng bằng máy bách phân bạch cầu. Sau đó tính tỷ lệ phần trăm mỗi loại. - Đánh giá mật độ tinh trùng. Không cần pha loãng tinh dịch, bất động tinh trùng bằng nhiệt trớc khi đếm. - Đánh giá hình thái. + Kỹ thuật nhuộm Giemsa. + Kỹ thuật nhuộm phiến đồ theo phơng pháp Papanicolaou. - Đánh giá tỷ lệ tinh trùng sống: phơng pháp nhuộm eosin. c. Đánh giá mẫu tinh dịch bình thờng: Theo tiêu chuẩn chọn mẫu tinh dịch có tinh dịch đồ bình thờng theo WHO 1999 [8]. 2.2. Chuẩn bị môi trờng bảo quản lạnh Glycerol - egg yolk - citrat (GEYC) [1]: * Pha theo công thức của Ackerman. - Thành phần: Thành phần để pha 200 ml môi trờng 1 Penicillin 1triệu UI 01 lọ 2 Streptomycin 1 gam 01 lọ 3 Egg yolks Bột khô 40 gam 4 Glycerol PA 30 ml 5 Glycocol Glycin 2 gam 6 Glucose 2,6 gam 7 Natri citrat PA 2,3 gam 8 Nớc cất 2 lần, khử ion kim loại 130 ml - Kỹ thuật pha: 1. Lấy 30 ml nớc cất hoà tan hết tinh thể (5; 6;7) đợc dung dịch A. 2. Lọc vô khuẩn dung dịch A. Lỗ màng lọc < 0.22 àm. 3. Cho Glycerol và Egg yolks vào dung dịch đã lọc, lắc đều bằng máy. 4. Cho đủ nớc cất để đợc 200ml. 5. ủ ở tủ sấy 56 o C trong 30 phút. 6. Chuẩn độ pH #7,2 bằng NaHCO 3 hoặc HCl 1N là đạt đợc dung dịch cần pha. * Kỹ thuật bảo quản tinh trùng. - Cho môi trờng bảo quản lạnh vào tinh dịch: - Đóng gói. - Hạ nhiệt độ: Sử dụng máy hạ nhiệt độ từ từ -Nicool 10. - Lu trữ. - Tan đông: Tan đông các mẫu tinh dịch đợc bảo quản lạnh sâu để kiểm tra ở các thời điểm sau bảo quản 1 ngày, 2 ngày, 30 ngày và 90 ngày. 2.3. Xử lý số liệu. Các số liệu đợc xử lý theo phần mềm Epi- Info Version 6.0 của WHO. Kiểm định sự khác biệt bằng test t và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. 3. Chỉ tiêu đánh giá. - Tỷ lệ tinh trùng di động nhanh. - Tỷ lệ tinh trùng di động (nhanh & chậm) - Tỷ lệ tinh trùng sống. 10 1.2. Tỷ lệ % tinh trùng di động (nhanh & chậm) trớc và sau bảo quản: - Chỉ số CSF di động nhanh = % tinh trùng di động nhanh sau bảo quản: % tinh trùng di động nhanh trớc bảo quản ì 100. Bảng 2: Tỷ lệ % tinh trùng di động (nhanh & chậm): X SD. - Chỉ số CSF di động (nhanh & chậm) = % tinh trùng di động (nhanh & chậm) sau bảo quản: % tinh trùng di động (nhanh & chậm) trớc bảo quản ì 100. Trớc bảo quản (A) 70,0 10,0 So A với B 1 ngày 48,5 12,1 2 ngày 43,1 11,3 30 ngày 43,1 8,4 Sau bảo quản (B) GEYC 90 ngày 45,0 10,2 P < 0,001 - Chỉ số tinh trùng sống = % tinh trùng sống sau bảo quản: % tinh trùng sống trớc bảo quản ì 100. III. kết quả Từ tháng 5/2002 đến tháng 8/2002, 30 mẫu tinh dịch đã đợc lấy tại phòng xét nghiệm bảo quản Mô - Phôi, Trờng Đại học Y Hà Nội. Những mẫu tinh dịch này đều đợc kết luận là bình thờng theo tiêu chuẩn của WHO (1999) và đợc bảo quản bằng lạnh sâu (-196C) môi trờng GEYC. Đánh giá tại các khoảng thời gian bảo quản 1 ngày, 2 ngày, 30 ngày, 90 ngày. Các chỉ tiêu đánh giá trớc và sau bảo quản là tỷ lệ di động và sống của tinh trùng. Kết quả trên cho thấy: - Nhìn chung, tỷ lệ tinh trùng di động (nhanh & chậm) sau bảo quản ở tất cả các thời điểm đánh giá đều giảm. - Tỷ lệ di động (nhanh & chậm) của tinh trùng sau bảo quản: giá trị trung bình thấp nhất ở khoảng thời gian bảo quản 30 ngày (43,1%), cao nhất ở khoảng thời gian bảo quản 1 ngày (48,5%) và đều thấp hơn tỷ lệ tinh trùng di động (nhanh & chậm) trớc bảo quản (43,1% so với 70,0%; 48,5% so với 70,0%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). 1. ảnh hởng của bảo quản bằng lạnh sâu. 1.1. Tỷ lệ % tinh trùng di động nhanh trớc và sau bảo quản: 1.3. Tỷ lệ % tinh trùng sống trớc và sau bảo quản: Bảng 1: Tỷ lệ % tinh trùng di động nhanh (X SD). Bảng 3: Tỷ lệ % tinh trùng sống: X SD. Trớc bảo quản (A) 41,9 20 So A với B 1 ngày 21,4 8,6 2 ngày 19,8 8,6 30 ngày 20,2 6,6 Sau bảo quản (B) GEYC 90 ngày 21,6 8,2 P < 0,001 Trớc bảo quản (A) 81,0 6,9 So A với B 1 ngày 61,2 12,9 2 ngày 58,1 11,7 30 ngày 61,0 11,3 Sau bảo quản (B) GEYC 90 ngày 59,7 11,1 P < 0,001 Qua bảng 3.1 cho thấy: Qua bảng 3 cho thấy: - Nhìn chung, tỷ lệ tinh trùng di động nhanh sau bảo quản ở các thời điểm đều giảm. - Tỷ lệ tinh trùng sống sau bảo quản ở tất cả các thời điểm đánh giá đều giảm. - Tỷ lệ di động nhanh của tinh trùng sau bảo quản: giá trị trung bình thấp nhất ở khoảng thời gian bảo quản 2 ngày (19,8%), cao nhất ở khoảng thời gian bảo quản 90 ngày (21,6%) và đều thấp hơn tỷ lệ tinh trùng di động nhanh trớc bảo quản (41,9%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). - Tỷ lệ sống của tinh trùng sau bảo quản: giá trị trung bình thấp nhất ở khoảng thời gian bảo quản 2 ngày (58,1%), cao nhất ở khoảng thời gian bảo quản 1 ngày (61,2%) và đều thấp hơn tỷ lệ tinh trùng sống trớc bảo quản (58,1% so với 81,0%; 61,2% so với 81,0%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). 11 2. Đánh giá tác dụng của môi trờng GEYC qua các khoảng thời gian bảo quản khác nhau. Bảng 4. Chỉ số chất lợng tinh trùng ở các khoảng thời gian bảo quản khi sử dụng môi trờng GEYC (X SD). Thời gian BQ Chỉ số (%) 1 ngày (I) 2 ngày (II) 30 ngày (III) 90 ngày (IV) P I,II,III,IV CSF (DĐ nhanh) 56,7 0,2 52,3 18,3 55,7 23,0 56,7 18,8 p > 0,05 CSF (DĐ nhanh & chậm) 69,0 5,2 62,3 16,5 62,3 12,2 64,0 13,5 p > 0,05 Chỉ số TT sống 76,0 3,5 72,0 13,0 75,3 13,8 73,7 13,8 p > 0,05 Qua kết quả trên cho thấy: - Chỉ số CSF di động nhanh có giá trị trung bình thấp nhất ở khoảng thời gian bảo quản 2 ngày (52,3%) và cao nhất ở khoảng thời gian bảo quản 1 ngày (56,7%). Tuy nhiên, khi so sánh từng cặp, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P I,II,III,IV > 0,05). Nh vậy không có sự liên quan chỉ số CSF cao hay thấp với khoảng thời gian lu trữ dài hay ngắn trong môi trờng GEYC. ở các khoảng thời gian bảo quản chỉ số này đều đạt yêu cầu do AATB quy định. - Chỉ số CSF di động (nhanh & chậm) có giá trị trung bình thấp nhất ở khoảng thời gian bảo quản 2 ngày (62,3%) và cao nhất ở khoảng thời gian bảo quản 1 ngày (69,0%). Khi so sánh từng cặp, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P I,II,III,IV > 0,05). Nh vậy không có sự liên quan chỉ số CSF cao hay thấp với khoảng thời gian lu trữ dài hay ngắn khi dùng môi trờng GEYC. ở các khoảng thời gian bảo quản, chỉ số này đều đạt yêu cầu do AATB quy định. - Chỉ số tinh trùng sống có giá trị thấp nhất ở khoảng thời gian bảo quản 2 ngày (72,0%) và cao nhất ở khoảng thời gian bảo quản 1 ngày (76,0%). Khi so sánh từng cặp, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P I,II,III,IV > 0,05). IV. bàn luận * Môi trờng glycerol đơn thuần và các môi trờng phối hợp nhiều thành phần: Môi trờng bảo quản tinh trùng đợc các nhà nghiên cứu quan tâm bởi vai trò của nó để nâng cao chất lợng tinh trùng sau bảo quản. Theo thời gian đã có nhiều môi trờng đợc sử dụng, công bố về hiệu quả của các môi trờng trong bảo quản tinh trùng cũng rất khác nhau. Năm 1949, Polge [5] đã sử dụng glycerol là môi trờng bảo quản lạnh tinh trùng đã đem lại kết quả khả quan, cho đến nay Ngân hàng tinh trờng Đại học tổng hợp Arkansas vẫn sử dụng glycerol đơn thuần. Các nghiên cứu 10 năm gần đây đợc công bố, đã đề cập nhiều đến các môi trờng phối hợp bởi nhiều thành phần nh: egg yolk, glycerol, glucose, fructose, glycine, citrate [Na citrate, K citrate], TES [N- tris (hydroxymethyl) aminomethane sulfonic acid], tris [(hydroxymethyl) aminomethane], Đã chứng tỏ rằng môi trờng phối hợp đó đã đem lại chất lợng tinh trùng sau bảo quản tốt hơn so với glycerol đơn thuần. Hallak [3] đã khẳng định sử dụng môi trờng TEST (TES & tris) Yolk tốt hơn glycerol. Foote R.H [2] kết luận môi trờng egg yolk-citrate-glucose- glycerol và egg yolk-tris-glucose-glycerol tốt hơn rất nhiều so với glycerol đơn thuần. Trong nghiên cứu này sử dụng môi trờng GEYC, kết quả cho thấy: Chỉ số CSF di động nhanh và CSF di động (nhanh và chậm) cũng nh tỷ lệ % tinh trùng di động nhanh và chậm ở các khoảng thời gian sau bảo quản đều có giảm so với trớc bảo quản với p < 0,001 (bảng 1; 2 và 3). Tuy nhiên mức độ giảm có khác nhau. 12 Kết quả trên cho thấy sử dụng môi trờng GEYC bảo quản tinh trùng ngời phù hợp với nhận xét của các tác giả trong và ngoài nớc. * Môi trờng có egg yolk và các môi trờng phối hợp không có egg yolk: Môi trờng nhiều thành phần có egg yolk đã đợc khẳng định trong bảo quản tinh trùng. Năm 1999, theo J.K. Sherman [5] có rất nhiều trung tâm bảo quản tinh trùng trên thế giới sử dụng môi trờng có chứa egg yolk nh: Ngân hàng gen và tinh trùng, trờng Đại học Tổng hợp Nebraska và Ngân hàng gen lạnh quốc tế sử dụng TESNaK-EYG có glucose không có citrate. Ngân hàng lạnh Califonia và Phòng thí nghiệm gen lạnh Quốc tế sử dụng TEST-EYG không có glucose, có citrate. Hiện nay còn nhiều quan điểm khác nhau về môi trờng egg yolk và các thành phần khác. Silva A.L [6] đã kết luận môi trờng TEST- Yolk, TEST-Yolk thêm 20% sodium citrate, 2% fructose và TEST-Yolk thêm 20% sodium citrate khi sử dụng bảo quản tinh trùng đều tốt nh nhau. Còn theo Stanic P [7] và Hammadeh M.E [4], môi trờng TEST-Yolk tốt hơn HSPM (môi trờng Tyrode có glycerol). Các tác giả khuyến cáo TEST-Yolk là môi trờng đợc lựa chọn đầu tiên bảo quản tinh trùng. Chỉ số CSF di động (nhanh & chậm) ở khoảng thời gian sau bảo quản 1 ngày, 2 ngày, 30 ngày và 90 ngày đều đạt khá cao (69,0%; 62,3%; 62,3% và 64%) (Bảng 3.4). Kết quả này chứng tỏ hiệu quả của môi trờng GEYC cho bảo quản tinh trùng trong lạnh sâu đạt yêu cầu do AATB quy định. Với những môi trờng nhiều thành phần có egg yolk, có hoặc không có TEST thì chất lợng cho bảo quản có khác nhau không? Trong 10 năm gần đây không thấy nghiên cứu nào công bố. Theo Foote R.H [2], sử dụng môi trờng egg yolk-citrate-glucose-glycerol và egg yolk-tris- glucose-glycerol cho kết quả tỷ lệ di động sau tan đông tơng ứng là 35% và 37%. Tác giả khuyến cáo một môi trờng có egg yolk và tris nên đợc sử dụng trong bảo quản tinh trùng. Với môi trờng GEYC chúng tôi áp dụng pha theo công thức do Ackerman giới thiệu. Chúng tôi tự pha lấy, trong đó không có thành phần TEST, các nguyên liệu khác đều nhập từ nớc ngoài, quy trình tơng đối phức tạp, đòi hỏi tiêu chuẩn cao về vô trùng và an toàn sinh học, cho nên phải bổ sung thêm kháng sinh. Tuy nhiên giá thành so với môi trờng khác trên thị trờng thì tơng đối rẻ. Mỗi lần chúng tôi pha 200ml, chia thành các ống nhỏ 2ml bảo quản ở -20 0 C, sử dụng trong 3 tháng. Không sử dụng lại sau tan đông. Môi trờng Sperm freeze nhập ngoại đợc đóng gói vô trùng. Chai 20ml, bảo quản ở 2 0 C-8 0 C, giá thành khá cao. Sau tan đông, quan sát những mẫu tinh trùng đợc bảo quản trong môi trờng GEYC dới kính hiển vi quang học, chúng tôi nhận thấy có nhiều hạt egg yolk xen lẫn với tinh trùng. Những hạt này có thể gây khó khăn khi lọc rửa tinh trùng sau bảo quản. Để khắc phục vấn đề này cần đợc phối hợp nghiên cứu chi tiết hơn. Qua những kết quả thu đợc, chúng tôi cho rằng với u thế về chất lợng, giá cả, chủ động, tiện lợi và tính khoa học, môi trờng GEYC thích hợp cho bảo quản tinh trùng bằng lạnh sâu. Tuy nhiên, để đáp ứng đợc cho thực tiễn các nhà lâm sàng cũng nh ứng dụng rộng rãi trong bảo quản tinh trùng cần có những nghiên cứu tiếp theo với quy mô và thời gian lớn hơn để có kết luận thoả đáng hơn. V. kết luận Nghiên cứu hiệu quả của môi trờng GEYC trong bảo quản lạnh sâu tinh trùng ngời, chúng tôi có những kết luận sau: 1. Chất lợng tinh trùng sau bảo quản bằng môi trờng GEYC đảm bảo theo tiêu chuẩn của AATB. 2. Môi trờng GEYC có thể tự chủ động pha tại phòng thí nghiệm với giá thành phù hợp với điều kiện Việt Nam. - Báo cáo là một phần trong luận văn cao học. Bạn đọc có thể tìm đọc toàn văn tại th viện trờng ĐHYHN, trung tâm thông tin Y học và th viện Quốc gia. tài liệu tham khảo 13 5. J.K.Sherman. (1990), Cryopreservation of human semen, CRC Handbook of the Laboratory Diagnosis and Treatment of Infertility, pp: 229-258. 1. Trơng Công Hổ, Hồ Mạnh Tờng (2001), Phơng pháp trữ tinh trùng, Phơng pháp xét nghiệm tinh dịch, Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ, Thành phố Hồ Chí Minh. 6. Silva A.L., Yamasaki R., de-Sala M.M., Cabrera M-da-G., de-Sa M.F. (1996), The addition of fructose or sodium citrate does not improve recovery rates of cryopreserved human spermatozoa, Int-J-Fertil-Menopausal- Stud, 41(3), pp: 304-9. 2. Foote R.H., Mc Gonagle., Goldstein M., Feldschuh J. (2002), The influence of cryoprotective media and processing procedures on motility and migration of frozen- thawed human sperm, Asian J Androl, 4(2), pp: 137-41. 7. Stanic P., Tandara M., Sonicki Z., Simunic V., Radakovic B., Sukhanek E. (2000), Comparison of protective media and freezing techniques for cryopreservation of Human semen, Eur-J-Obstet-Gynecol-Reprod-Biol, 91(1), pp: 65-70. 3. Hallak J., Sharma R.K., Wellstead C., Agarwal A. (2000), Cryopreservation of human spermatozoa: comparison of TEST-Yolk buffer and glycerol, Int-J-Fertil-Womens-med, 45(1), pp: 38-42. 4. Hammadeh M.E., Greiner S., Rosenbaum P., Schmidt W. (2001), Comparison between human sperm preservation medium and TEST Yolk buffer on protecting chromatin and morphology integradity of human spermatozoa in fertile and subfertile men after freeze thawing procedure, J Androl, 22(6), pp: 1012 8. 8. World health organisation (1999). WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm Cervical mucus interation, fourth edition, Cambridge University press.34. Summary The effect of GEYC on deep-cryopreserved human spermatozoa Deep-cryopreserved 30 samples of human spermatozoa in GEYC medium, it is prepared at Lab, shows that quality of cryopreserved spermatozoa conforms to criteria of AATB. GEYC medium would be performed at Laboratory with low cost andBBPP suitability of Vietnamese condition. 14 . cứu hiệu quả của môi trờng GEYC trong bảo quản lạnh sâu tinh trùng ngời, chúng tôi có những kết luận sau: 1. Chất lợng tinh trùng sau bảo quản bằng môi. Sau bảo quản (B) GEYC 90 ngày 45,0 10,2 P < 0,001 - Chỉ số tinh trùng sống = % tinh trùng sống sau bảo quản: % tinh trùng sống trớc bảo quản