i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  TRẦN THỊ MINH TÚ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƢỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƢỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN THỊ MINH TÚ KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 iii MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  AMPLIFICATION MOLECULAR ENGINEERING TO IDENTY CITRUS CANKER BACTERIA GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. LE DINH DON TRAN THI MINH TU TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. - Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn năm qua. - TS. Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Bùi Minh Trí và anh Nguyễn Văn Lẫm và các anh chị phụ trách phòng Hóa Sinh thuộc Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài. - Toàn thể lớp CNSH 28 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con đƣợc nhƣ ngày hôm nay, cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Chân thành cảm ơn. Tp. HCM, tháng 08 năm 2006 Sinh viên Trần Thị Minh Tú iv TÓM TẮT TRẦN THỊ MINH TÚ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƢỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng là vi khuẩn Xanthomonas spp. Đây là vi khẩn có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau, ảnh hƣởng rất lớn đến năng suất của cây trồng. Chúng tôi sử dụng các kỹ thuật nông học, phƣơng pháp sinh học phân tử nhằm định danh dòng Xanthomonas sp gây bệnh loét trên cây bƣởi mục tiêu hiểu rõ bản chất sinh học của dòng gây bệnh, để dễ dàng cho việc đƣa ra các biện pháp phòng trừ bệnh do vi khuẩn này gây ra. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thực tập Bệnh cây khoa Nông Học và Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, từ 06/02/06 đến 06/08/06. Nội dung nghiên cứu: 1. Phân lập, nuôi cấy, xác định gram, quan sát hình thái trên môi trƣờng PGA, YDC. 2. Chủng bệnh nhân tạo để kiểm tra lại triệu chứng gây bệnh của dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. 3. Thực hiện sắc ký bản mỏng dựa vào sắc tố đặc trƣng để nhận Xanthomonas sp. . 4. Tiến hành nhân sinh khối, ly trích DNA tổng số. 5. Thực hiện phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và Xan332. 6. Thực hiện phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR và XACF cho phép xác định nhanh Xanthomonas axonopodis pv. citri. v Kết quả đạt đƣợc: 1. Phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn, tất cả là gram âm, trên môi trƣờng YDC phân thành 2 nhóm vàng sữa và vàng chanh 2. Tất cả 4 dòng phân lập đƣợc đều tạo vết thƣơng sau khi chủng bệnh nhân tạo, triệu chứng bệnh có khác nhau. 3. Kết quả sắc ký có 1 dòng (XBDL1) có sắc tố phát sáng rõ sau khi chụp UV. 4. Thực hiện thành công phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và Xan332 cho sản phẩm 1,1 kb. 5. Không thực hiện đƣợc phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR và XACF. vi MỤC LỤC TRANG Trang bìa Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các hình viii Danh sách các bảng ix Danh sách các chữ viết tắt xi Phần 1. GIỚI THIỆU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 1 1.3. Yêu cầu 2 1.4. Giới hạn của đề tài 2 Phần 2. TỔNG QUAN 3 2.1. Sơ lƣợc về nhóm cây có múi trên thế giới và trong nƣớc 3 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây bƣởi 3 2.1.2. Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nƣớc 3 2.1.3. Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam 4 2.1.4. Tình hình sản xuất cam quýt trên thế giới 4 2.2. Bệnh loét cam Xanthomonas citri (Hasse-Dowson) 5 2.2.1. Triệu chứng bệnh 5 2.2.2. Đặc điểm gây bệnh của chủng vi sinh vật gây bệnh (X. a. pv. citri) 7 2.3. Sơ lƣợc vùng rDNA-ITS 8 vii 2.3.1. Giới thiệu vùng rDNA 8 2.3.2. Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp. 9 2.4. Sơ lƣợc về hrpW gen 9 2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam 11 2.5.1. Trên Thế Giới 11 2.5.2. Tại Việt Nam 12 2.6. Quy trình định danh Xanthomona sp. . 12 2.6.1. Quy trình định danh Xanthomonas sp. theo phƣơng pháp nuôi cấy, thực hiện phản ứng sinh hóa 12 2.6.2 Quy trình định danh theo phƣơng pháp phân tử 13 2.7 Phƣơng pháp PCR 13 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16 3.2. Nội dung nghiên cứu 16 3.3 Vật liệu nghiên cứu 16 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 17 3.4.1 Phân lập, nuôi cấy trên 2 môi trƣờng PGA và YDC, xác định Gram âm hay Gram dƣơng các dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi 17 3.4.2. Chủng bệnh nhân tạo 18 3.4.3. Thực hiện sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn 18 3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 20 3.4.5. Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS và vùng hrpW gen 21 3.4.5.1 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi Xan1330 và Xan332 22 3.4.5.2 Khuếch đại đoạn hrpW gen dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi XACF và XACR 23 3.5.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích và sản phẩm PCR 23 viii Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1. Phân lập, xác định gram vi khuẩn gây bệnh loét ở cây bƣởi da láng và bƣởi đƣờng cam 25 4.2 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh loét trên môi trƣờng PGA và YDC 25 4.2. Chủng bệnh bệnh nhân tạo 26 4.3. Sắc ký định danh vi khuẩn gây bệnh 28 4.4 Ly trích DNA tổng số 28 4.5. Thực hiện PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 332 trên vùng ITS 29 4.6 Thực hiện PCR với cặp mồi XACR và XACF trên hrpW gen 29 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 5.1. Kết luận 32 5.2. Đề nghị 32 Phần 6.TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 Phần 7. PHỤ LỤC 35 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1. Triệu chứng bệnh loét trên lá bƣởi Da Láng 6 Hình 2.2. Triệu chứng bệnh loét trên trái bƣởi Da Láng 6 Hình 2.3. Triệu chứng bệnh loét trên cành bƣởi Da Láng 7 Hình 2.4. Cấu trúc vùng 16s-23s rDNA ITS trên Xanthomonas ssp 10 Hình 2.5. Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa các dòng Xanthomonas ssp. dựa trên vùng 16s-23s rDNA ITS 10 Hình 3.1(a) Tấm sắc ký vừa nhỏ dung dịch sắc tố 19 Hình 3.1(b). Tấm sắc ký ngâm methanol trong bình hút ẩm 19 Hình 4.1. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng PGA nhiệt độ 28 o C 25 Hình 4.2. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng YDC ở nhiệt độ 28 o C 26 Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh sau khi chủng bốn dòng phân lập đƣợc trên lá non bƣởi Da Láng quan sát dƣới kính hiển vi độ phóng đai 4x10 lần 27 Hình 4.4. Kết quả sắc ký trƣớc 28 Hình 4.5. DNA tổng số ly trích theo quy trình 3.2.4.4 29 Hình 4.6. Kết quả diện di sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi Xan1330 và Xan332 29 Hình 4.7. Sơ đồ các bƣớc cơ bản định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi theo phƣơng pháp sinh học phân tử 31 [...]... xác định rõ dòng vi khuẩn gây bệnh này chúng tôi thực hiện đề tài Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi bằng phƣơng pháp sinh học phân tử Từ đó, chúng tôi có thể tìm ra phƣơng pháp phòng và trị bệnh đạt hiệu quả nhằm khôi phục lại giống bƣởi Đƣờng Da Láng mang lại hiệu quả kinh tế cao 1.2 Mục đích - Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có muối (cây. .. tỉnh Đồng Nai Tác giả đã phân lập đƣợc một số dòng vi khuẩn gây bệnh nhƣng chƣa định danh đƣợc Đồng thời, tác giả cũng xác định một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh loét 2.6 Quy trình định danh Xanthomona sp 2.6.1 Quy trình định danh Xanthomonas sp theo phƣơng pháp nuôi cấy, thực hiện phản ứng sinh hóa 1 Sử dụng môi trường chọn lọc để phân lập dòng gây bệnh (Bảng 2.1) 2 Xác định dựa vào sắc tố vàng... toàn là cây sạch bệnh Tạo vết thƣơng trên cây ký chủ Sau đó nhỏ dòng vi khuẩn đã kiểm tra các bƣớc trên lên vết thƣơng Đặt cây ký chủ đã chủng vào điều kiện tối ƣu cho bệnh phát triển Thông thƣờng thì ở nhiệt độ 27oC-30oC, trong vòng 7 ngày sau khi chủng thì thấy triệu chứng bệnh 2.6.2 Quy trình định danh theo phƣơng pháp phân tử Dựa trên quy trình định danh bằng phƣơng pháp nuôi cấy và kiểm tra sinh. .. Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh và Bộ Môn Bảo Vệ Thực VậtTrƣờng Đại Học Nông Lâm T.P Hồ Chí Minh 3.2 Nội dung nghiên cứu 1 Phân lập, nuôi cấy, xác định dòng vi khuẩn gây bệnh là gram âm hay gram dƣơng, quan sát hình thái trên môi trƣờng PGA, YDC 2 Chủng bệnh nhân tạo xác định dòng vi khuẩn phân lập đƣợc là dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh trên ký chủ là cây bƣởi Dựa trên kết quả chủng bệnh khẳng định đặc... nhiễm bệnh nghiêm trọng do vi khuẩn Xanthomonas sp gây nên Vi khuẩn không ảnh hƣởng nhiều đến chất lƣợng quả nhƣng gây nên những vết sần sùi trên mặt trái làm mất vẻ thẩm mỹ nên rất khó tiêu thụ trên thị trƣờng Ngoài ra, vi khuẩn còn gây bệnh trên cành, lá làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây Không chỉ gây hại trên cây bƣởi mà vi khuẩn Xanthomonas sp gây hại hầu hết các loại cây có... phƣơng pháp sinh học phân tử để định danh chính xác ở mức loài Quy trình gồm các bƣớc sau: 1 Phân lập và kiểm tra hình thái, sinh hoá trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ NA, YGA, YDC, KB 2 Tiến hành kiểm tra dòng phân lập đƣợc bằng phản ứng ELISA để kiểm tra và phân loại dựa trên độc tính gây bệnh 3 Kiểm tra sự oxy hóa nguồn cacbon (khả năng tạo axit từ đƣờng cacbon) 4 Kiểm tra khả năng gây bệnh của dòng phân. .. - Phân loại tính độc của chủng gây bệnh 2 1.3 Yêu cầu - Thành thạo các thao tác phân lập, nuôi cấy, chủng bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm - Thực hiện đƣợc phƣơng pháp sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn - Thành thạo phƣơng pháp ly trích DNA vi khuẩn - Tính toán, thiết lập đƣợc phản ứng PCR, hạn chế tối đa tạp nhiễm 1.4 Giới hạn của đề tài - Chỉ xác định đƣợc chủng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây. .. định đặc tính gây bệnh của dòng vi khuẩn phân lập 3 Thực hiện sắc ký bản mỏng để định danh Xanthomonas.sp (dựa vào sắc tố vàng Xanthomodin đặc trƣng) 4 Nhân sinh khối, ly trích DNA tổng số các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 5 Dùng phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và Xan332 để kiểm tra phƣơng pháp định danh đã thực hiện Đồng thời tiến tới giải trình tự sản phẩm PCR định danh ở mức... nhau quy t định là cây ký chủ- vi khuẩn gây bệnh- điều kiện ngoại cảnh môi trƣờng” (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999) Dựa triệu chứng bệnh và sự biến chủng của vi khuẩn có các loại bệnh loét sau: - Loại Asiatic (Canker A), do Xanthomonas axonopodis pv.citri, bắt nguồn từ châu Á, phân bố rộng, khả năng gây bệnh rất mạnh - Loại B, do Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii , bắt nguồn từ Nam Mỹ, gây bệnh. .. trong phạm vi pH 6,18,8, thích hợp ở pH 6,6 Vi khuẩn có khả năng chịu hạn ở nhiệt cao, trong điều kiện phòng thí nghiệm có thể tồn tại 130 ngày Bệnh loét cam, bƣởi là bệnh hại có tính nhiệt đới, vi khuẩn gây bệnh phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ cao, ẩm ƣớt, sức chống hạn và lạnh cao Vi khuẩn tồn tại trong vết lá, cành bệnh từ năm này qua năm khác Theo Wolf (1916) vi khuẩn bệnh loét cam . xác định rõ dòng vi khuẩn gây bệnh này chúng tôi thực hiện đề tài Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi bằng phƣơng pháp sinh. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƢỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ”.