Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 332 THU NHẬN VÀ BIỆT HOÁ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TUỶ XƯƠNG CHUỘT (Mus musculus var. Albino) Trương Định, Trương Hải Nhung, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc ĐH Khoa học Tự nhiên TPHCM MỞ ĐẦU Tuỷ xương chứa một nguồn tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell-MSC) dồi dào. Các tế bào MSC này được thu nhận và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12 (Sigma), 10% FBS (Invitrogen). Sau khoảng 10 ngày nuôi cấy, các tế bào MSC tăng sinh mạnh và chiếm 70-80% diện tích bề mặt đáy bình Roux (25 cm 2 , Nunc), tiến hành cấy chuyền với trypsin/EDTA (Sigma) 0,25% nhằm cung cấp chất din h dưỡng và không gian phát triển cho tế bào MSC. Tế bào MSC là tế bào gốc đa năng, chúng có khả năng biệt hoá th ành rất nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau. Chúng có thể biệt hoá th ành tế bào xương khi nuôi trong môi trường DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung dexamethasone, glycerol phosphate, ascorbate, EGF (nhân tố tăng trưởng biểu mô); thành tế bào mỡ khi nuôi trong môi trường DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung isobutyl -methylxanthine, dexamethasone, insulin, indomethacin; thành tế bào giống tế bào thần kinh khi nuôi trong môi trường DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung dịch chiết não chuột. Tế bào gốc nói chung và tế bào gốc trung mô nói riêng hiện đang là mối quan tâm hàng đầu của nhiều nhà khoa học và những thầy thuốc lâm sàng bởi khả năng đặc biệt duy nhất của chúng đó là khả năng biệt hoá thành nhiều kiểu tế bào khác nhau trong cơ thể, như xương, sụn, mỡ, tế bào thần kinh Thêm vào đó chúng là một nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho việc cấy ghép và sinh dược phẩm, chúng cũng phục vụ như là một mô hình tối ưu của sự phát triển của động vật có xương sống. Trong các nghiên cứu về sự biệt hoá, các tế bào MSC biệt hoá thành xương, sụn và mỡ được sử dụng nhiều nhất như là bằng chứng cụ thể về tiềm năng biệt hoá của tế bào gốc. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thu nhận tuỷ xương chuột Chuột (Mus musculus var. Albino) bị giết bằng cách kéo gi ãn đốt sống cổ, sau đó thu nhận hai xương đùi và xương cẳng chân. Các khúc xương được rửa bằng dung dịch PBSA hai lần. Dùng kéo và kẹp tách bỏ mô cơ bám trên các đoạn xương. Cuối cùng, tuỷ xương được thu nhận bằng cách: dùng ống kim với mũi kim 26 G có chứa sẵn môi trường nuôi cấy, chọc xuyên vào tuỷ xương và dội rửa hai lần. Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT 333 Nuôi cấy chọn lọc tế bào gốc trung mô Hỗn hợp tế bào có trong tuỷ xương bao gồm tế bào gốc tạo máu, tế bào máu trưởng thành và tế bào gốc trung mô. Tuy nhiên, chỉ có tế bào gốc trung mô mới có khả năng bám dính vào bề mặt nhựa của bình Roux. Sau vài lần thay môi trường, ta có thể loại bỏ được tất cả các tế bào tạp nhiễm, chỉ còn lại duy nhất tế bào gốc trung mô. Tiến hành như sau: huyền phù tế bào tuỷ xương sau khi thu nhận được nuôi trong bình Roux với mật độ 1.104 tế bào/cm 2 ở điều kiện 37 0 C, 5% CO 2 . Sau 24 giờ, các tế bào gốc trung mô bắt đầu bám trên bề mặt bình Roux, thay môi trường để loại bỏ các tế bào không bám, tiếp tục nuôi đến khi tế bào đạt mật độ 70-80% bình Roux với chế độ thay môi trường là 3 ngày/lần. Cấy chuyền tăng sinh Khi mật độ tế bào MSC trong bình nuôi đạt khoảng 70-80%, tiến hành cấy chuyền tăng sinh nhằm cung cấp không gian v à chất dinh dưỡng cho tế bào MSC tăng sinh và phát triển đạt hiệu quả cao. Tiến hành như sau: đổ bỏ môi trường cũ và rửa tế bào với 4-5ml PBS-gentamycin (10 IU/ml) hai lần. Sau đó, đổ bỏ dịch rửa và bổ sung 4-5ml trypsin/EDTA 0,25%. Sau 15 giây, ti ến hành đổ bỏ dung dịch enzyme nhưng vẫn chừa lại khoảng 1ml và tiếp tục ủ trong tủ ấm 37 0 C trong 2-3 phút. Sau đó, lắc nhẹ bình Roux để tách tế bào ra khỏi bề mặt đáy. Sau khi tế bào tròn lên và tách ra khỏi bề mặt nuôi, trung hoà trypsin thừa bằng 10-11ml môi trường DMEM 10% FBS. Huyền phù tế bào đó được chia đều cho 3 bình Roux mới. Biệt hoá tế bào gốc trung mô Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tạo mỡ bằng môi trường nuôi DMEM/F12 10% FBS bổ sung hỗn hợp 1 μM dexamethasone, 200 μM indomethacin, 1,7 μM insuline, 500 μM isobutyl-methylxanthine (tất cả đều của Sigma). Sự biệt hóa được ghi nhận khi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X20, X40 thấy có sự xuất hiện các giọt mỡ nhỏ. Ngoài ra, các tế bào mỡ còn được xác định dựa vào phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Sudan black (Merck) l à thuốc nhuộm lipid, nó chỉ hòa tan trong lipid và tạo màu đen. Biệt hoá thành tế bào xương: Các tế bào MSC được nuôi trong môi trường DMEM/F12 10% FBS với 100 nM dexamethasone, 50 μg/ml L-ascorbic acid 2- phosphat (AsAP) và 100 mM β-glycerolphosphate (tất cả đều của Sigma). Sau 7-14 ngày, đánh giá sự biệt hoá thông qua khả năng tích tụ của calcium trong chất nền với phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Alizarin Red (Sigma). Biệt hoá thành tế bào giống tế bào thần kinh: Môi trường biệt hoá tế bào gốc trung mô thành tế bào thần kinh là môi trường DMEM/F12 10% FBS, bổ sung 10% dịch chiết não chuột. Xác định tế bào thần kinh sau khi được biệt hoá bằng hình dạng đặc trưng của chúng. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 334 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Nuôi cấy chọn lọc tế bào MSC Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào MSC có hiện tượng bám trên bề mặt bình Roux, trong khi các tế bào tạo máu vẫn trôi lơ lửng trong dịch huyền phù tế bào. Hình 1. Kết quả nuôi cấy chọn lọc MSC. (a) Tế bào MSC vừa mới thu nhận; (b) Tế bào MSC sau 24 giờ nuôi cấy, các tế bào MSC bắt đầu bám dính vào bề mặt bình nuôi; (c) Tế bào MSC sau 72 giờ nuôi cấy, các tế bào MSC bắt đầu trải dài hình dạng và tăng sinh; (d) Hình ảnh các tế bào MSC sau 240 giờ nuôi cấy, hầu hết các tế bào MSC lúc này đã có dạng hình thoi đặc trưng và tăng sinh mạnh. (Độ phóng đại X20) Sau 48 giờ, loại bỏ môi trường cũ và thay môi trường mới nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho sự phát triển của tế bào MSC. Khi thay môi trường, đồng thời loại bỏ được những tế bào chết cũng như các tế bào tạo máu còn lơ lửng trong môi trường cũ. Với lần thay môi trường đầu tiên, không tiến hành rửa tế bào vì khả năng bám dính của tế bào MSC vào bề mặt bình Roux vẫn còn yếu. Sau 72 giờ, tế bào MSC bắt đầu trải ra trên bề mặt bình Roux, khi đó tế bào MSC đã có hình dạng đặc trưng, thường là hình thoi. Sau 120 giờ nuôi cấy, tế bào MSC tiếp tục trải rộng ra và phân chia gia tăng số lượng trên bề mặt bình Roux. Sau 240 giờ, tế bào MSC hợp dòng, bám đều và trải rộng trên bề mặt bình Roux. Khi mật độ tế bào MSC đạt 70% - 80% diện tích bình Roux, tiến hành cấy chuyền nhằm cung cấp không gian sống và chất dinh dưỡng cho tế bào MSC. 2. Cấy chuyền tăng sinh tế bào MSC Khi vừa được cấy chuyền, tế bào MSC chưa có hình dạng đặc trưng và trôi lơ lửng trong môi trường giống như khi vừa được thu nhận từ tuỷ xương. (a) (b)) (c) (d) Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT 335 Sau 24 giờ, tế bào MSC bắt đầu bám dính và trải rộng. Sau 48 giờ, tế bào MSC trải rộng, có dạng hình thoi đặc trưng và bắt đầu tăng sinh. Tuy nhiên, khả năng tăng sinh của tế bào MSC lúc này vẫn còn rất chậm. Sau 152 giờ, tế bào MSC hợp dòng và trải đều trên bề mặt bình Roux. Biệt hoá tế bào MSC Hình 2. Kết quả biệt hoá tế bào MSC. (a) Các tế bào tạo mỡ: sau 7-14 ngày trong môi trường biệt hoá tạo mỡ, các tế bào bắt đầu tích tụ các giọt mỡ ( ); (b) Các giọt mỡ bắt m àu đen khi nhuộm với thuốc nhuộm Sudan Black; (c) Các tế bào tạo xương: sau 7-14 ngày trong môi trường biệt hoá tạo xương, các tế bào bắt đầu tròn lại và tích tụ calci trong chất nền. Sự tích tụ calci được xác định bằng cách nhuộm với Alizarin Red; (d) Tế bào giống tế bào thần kinh: các tế bào MSC sau khi nuôi trong môi trường biệt hoá thần kinh, MSC thay đổi hình dạng thành tế bào giống tế bào thần kinh với exon dài ( ), thân tế bào thần kinh ( ). Biệt hoá hành tế bào mỡ Sau 48 giờ, các tế bào bắt đầu tích tụ các giọt mỡ trong tế bào chất. Các giọt mỡ nhỏ góp lại dần thành các giọt lớn. Chúng chuyển từ dạng dài, trải rộng chuyển sang dạng tròn. Các giọt mỡ có thể quan sát dễ dàng dưới kính hiển vi đảo ngược có độ phóng đại X20. Biệt hoá hành tế bào xương Sau khi nuôi trong môi trường biệt hóa, các tế bào từ dạng dài chuyển sang dạng tròn và hình hạt đậu. Về mặt hình thái học, có thể đánh giá sơ bộ là các tế bào này đã biệt hóa thành công. Dạng thuôn dài, trải rộng là hình dạng của tế bào gốc trung mô và dạng tròn hay hình hạt đậu là hình dạng của tế bào tạo xương (osteoblast). Khi nhuộm với Alizarin red, các tế bào tròn hay hình hạt đậu sẽ nhuộm màu đỏ cam. Điều này chứng tỏ các tế bào có nguồn gốc từ tế bào MSC này đã có sự lắng tụ muối calci trong chất nền ngoại bào. Như vậy, các tế bào MSC đã biệt hóa thành các tế bào tạo xương. (a) (b) (c) (d) X20 X20 X20 X40 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 336 Biệt hoá thành tế bào giống tế bào thần kinh Sau 10-14 ngày biệt hoá, một số tế bào bắt đầu thay đổi hình dạng với sợi trục kéo dài và một đầu phình to giống thân tế bào thần kinh cũng như các nhánh nhỏ xuất phát từ thân giống như các sợi nhánh. KẾT LUẬN Thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột Mus Muscular var. Albino. Tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột Mus Muscular var. Albino có khả năng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, xương và tế bào thần kinh khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung một số nhân tố cảm ứng biệt hoá thích hợp. TÀI LIỆU THAM KHÀO 1. Daniel R. Marshak, Richard L. Gardner & David Gottlieb (2001). Stem cell Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2. Freshney R. I. (2000). Culture of animal cells - A Manual of basic Technique, 4th Ed. Newyork: Willey Liss. 3. Moustapha Kassen và Cs (2004). Mesenchymal Stem Cells: Cell Biology and Potenntial Use in Therapy. Basic & Clinical Pharmacology & Texicology, 95, 209-214. 4. Robert I.(2004). Mesenchymal stem cell. Vox Sanguinis. 38-41. SUMMARY Collecting and differentiating mesenchymal stem cells from mouse bone marrow Truong Dinh, Truong Hai Nhung, Pham Van Phuc, Phan Kim Ngoc University of Sciences HCMCity Bone marrow is a rich source of mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs have been collected and cultured with DMEM/F12 medium plus 10% FBS (fetal bovine serum). At about 10th day, MSCs strongly expand and cover with 70 -80% Roux’s surface. At that time, MSCs are subcultured by trypsin/EDTA 0,25% to provide nutrients and surface for development. MSCs are pluripotential stem cells. They can differentiate to many different cell types, such as: osteoblasts, adipocytes, neuron -like cells MSCs could be differentiated to osteoblasts in DMEM/F12, 10% FBS medium plus dexamethasone, glycerol phosphate, ascorbate, EGF (epidermal growth factor); to adipocytes in DMEM/F12, 10% FBS plus isobutyl-methylxanthine, dexamethasone, insulin, indomethacin; to neuron-like cells in DMEM/F12, 10% FBS plus mouse brain crude extract. . lọc tế bào gốc trung mô Hỗn hợp tế bào có trong tuỷ xương bao gồm tế bào gốc tạo máu, tế bào máu trưởng thành và tế bào gốc trung mô. Tuy nhiên, chỉ có tế. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 332 THU NHẬN VÀ BIỆT HOÁ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TUỶ XƯƠNG CHUỘT (Mus musculus var. Albino) Trương Định, Trương