NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA VIOLET CHÂU PHI (Saintpaulia) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Lê Đức Thảo 1 , Nguyễn Thị Kim Lý 1 Summary A study on rapid propagation protocol of Violet Châu Phi (Saintpaulia) by tissue culture Study on rapid propagation protocol of Violet Chau Phi (Saintpaulia) by tissue culture showed that initial material is tender leaves. The steriliration by HgCl 2 0,1% in 6 minutes is the highest effect. MS medium + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l charcoal with supplementation of 1,0 mg/l BAP is suitable to form callus from Violet Châu Phi leaves (94,45%). The optimal culture medium for regeneration and shoot multiplication from callus is MS medium + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l charcoal supplemented with 0,3 mg/l BAP. The best medium for root induction from invitro shoots was MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l charcoal with addition of 0,3 mg/l , 100% shoots inducted roots from this medium with 37,8 roots/shoot and average length was 0,65 cm. In nursery, the best suitable substrate for plantlets was coconut fiber with surviving ratio 100%, the high plant 3,53 cm and number leaves/plant 9,4 after one week observed Keywords: Saintpaulia, rapid propagation, nursery, coconut fiber, plantlets, substrates. I. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Ngày nay, bên cạnh các loại hoa cắt, các loại hoa trồng chậu trang trí ngày càng được ưa chuộng và phổ biến, đặc biệt ở các nước phát triển. Khi cuộc sống đang ngày càng được đô thị hoá, các loại hoa trồng chậu đã góp phần đáng kể trong việc cải tạo môi trường sống, đáp ứng nhu cầu trang trí, thay đổi không gian sống và làm cho cuộc sống con người gần gũi với thiên nhiên hơn. Có rất nhiều loại hoa trồng chậu phổ biến và được người tiêu dùng ưa chuộng như Begonia, Cineraria, Geranium, Saintpaulia, Trong đó, cây Saintpaulia hay còn gọi là Violet Châu Phi là loại cây đẹp, đa dạng về màu sắc và đã được Viện Di truyền Nông nghiệp nhập nội, thử 1 Viện Di truyền Nông nghiệp. nghiệm. Kết quả cho thấy chúng sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện sinh thái Việt Nam. Để đáp ứng việc cung cấp giống cho sản xuất với số lượng lớn, cây con khỏe và sạch bệnh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng qui trình nhân nhanh giống Violet Châu Phi (Saintpaulia) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu và mẫu ban đầu là nhng mNu lá non, lá bánh t ca cây Violet Châu Phi kích thưc mu 1 cm 2 . 2. Phương pháp nghiên cứu Ct t cây Violet Châu Phi các lá non, bánh t ra sch bng xà phòng, sau ó ct lá thành các mNu nh cho vào các bình tam giác ri cho vào bu cy và tin hành thao tác kh trùng. Trưc tiên, ra mu bng nưc ct (ã kh trùng) 2 - 3 ln, kh trùng sơ b bng cn 70 0 C trong 30 giây. Sau ó loi b ht nưc và kh trùng bng HgCl 2 và H 2 O 2 theo các công thc thí nghim. Ly mu ra khi dung dch kh trùng, tráng 3 - 5 ln bng nưc ct (ã kh trùng) ri cy vào môi trưng MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza. Các mu lá sau 2 tun theo dõi ưc cy chuyn vào môi trưng to callus, môi trưng cơ bn: MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l than. Tip tc nghiên cu môi trưng to chi và ra r, to cây hoàn chnh. Cây con sau khi ưa ra khi bình nuôi cy ưc ra sch môi trưng bám dính  r bng nưc sch, sau ó giâm vào khay bng xp vi các giá th khác nhau. - iu kin nuôi cy: N hit  nuôi cy 25 - 28 0 C, ánh sáng 1500 - 2000 Lux, thi gian 8 gi/ngày. - Thí nghim ưc b trí ngu nhiên, 3 ln nhc li. S liu ưc x lý thng kê trên chương trình IRRISTAT. III. KT QU VÀ THO LUN 1. ghiên cứu phương pháp khử trùng hoa Violet Châu Phi  tài ã s dng ngun mu ban u t lá cây Violet Châu Phi  to vt liu vô trùng trong ng nghim. Mu ưc kh trùng bng hp cht HgCl 2 và H 2 O 2 . Sau 2 tun nuôi cy ta thu ưc kt qu th hin trong (bng 1). Bảng 1. Hiệu quả của các phương pháp khử trùng Công thức Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sạch (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) CT1 73,33 23,3 3,3 CT2 23,33 60,0 16,7 CT3 16,7 36,7 46,7 CT4 86,7 13,3 0 CT5 63,3 26,7 10 CT6 53,3 33,3 13,3 Ghi chú: CT1: HgCl 2 0,1% trong 3 phút; CT2:HgCl 2 0,1% trong 5 phút; CT3: HgCl 2 0,1% trong 7 phút; CT4: H 2 O 2 15% trong 10 phút; CT5: H 2 O 2 20% trong 10 phút; CT6: H 2 O 2 25% trong 10 phút. Qua bng 1 cho thy: Hiu qu kh trùng mu gia các công thc có s bin ng như sau: - i vi cht kh trùng H 2 O 2 : Khi kh trùng  các nng  khác nhau vi cùng thi gian kh trùng là 10 phút thì t l mu sng khác nhau, t l mu cht tăng t l thun vi nng  kh trùng và t l nhim li t l nghch vi nng  kh trùng. T l mu sng, sch cao nht khi kh trùng  nng  25% t 33,3%. - i vi cht kh trùng HgCl 2 : Khi kh trùng  các thi gian khác nhau vi cùng nng  là 0,1% có t l sng ca các mu khác nhau. T l mu sng, sch cao nht khi kh trùng trong 5 phút t 60%. Như vậy, phương thức khử trùng tốt nhất là sử dụng HgCl 2 0,1% trong thời gian khử trùng là 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất. 2. ghiên cứu môi trường tạo callus hoa Violet Châu Phi Chúng tôi nghiên cu nh hưng ca mt s cht iu tit sinh trưng n kh năng to callus t các mu lá sau khi kh trùng. Sau 3 tun nuôi cy, kt qu ưc th hin  bng 2. Bảng 2. Ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon) đến quá trình hình thành callus Công thức Tỷ lệ mẫu tạo callus (%) Hình thái callus CT1 59,09 Callus màu trắng yếu, kích thước nhỏ, xốp. CT2 86,36 Callus màu xanh, có kích thước nhỏ, rắn. CT3 60 Callus màu xanh vàng, kích thước nhỏ, rắn CT4 94,45 Callus màu xanh, kích thước lớn, rắn CT5 59,09 Callus màu xanh, kích thước nhỏ, rắn CT6 81,8 Callus màu xanh, kích thước nhỏ, rắn. CT7 22,73 Callus màu vàng nâu, kích thước nhỏ, xốp. Ghi chú: CT1: 0 BAP (mg/l) + 0 α − ΝΑΑ (mg/l); CT2: 0,5 BAP (mg/l) + 0 α − ΝΑΑ (mg/l); CT3: 0,5 BAP (mg/l) + 0,5 α − ΝΑΑ (mg/l); CT4: 1,0 BAP (mg/l) + 0 α − ΝΑΑ (mg/l); CT5: 1,0 BAP (mg/l) + 0,5 α − ΝΑΑ (mg/l); CT6: 1,5 BAP (mg/l) + 0 α − ΝΑΑ (mg/l); CT7: 1,5 BAP (mg/l) + 0,5 α − ΝΑΑ (mg/l). Qua kt qu  bng 2 cho thy: Các phytohormon có nh hưng rt tích cc n quá trình hình thành callus. Khi cy các mu ã kh trùng vào môi trưng MS không b sung cht iu tit sinh trưng thì t l mu to callus thp t 59,09%, mt khác hình thái callus không tt. Khi cy mu vào môi trưng có b sung 0,5 mg/l BAP thì t l mu to callus tăng cao, chim 86,36%, hình thái callus tt nhưng kích thưc vn nh. Khi b sung c 0,5 mg/l α−ΝΑΑ thì t l mu to callus gim i còn 60%, hình thái callus không ưc tt, callus màu xanh vàng, kích thưc li nh. Khi tăng nng  BAP lên 1,0 mg/l thì t l mu to callus t 94,45%, hình thái callus tt, callus có màu xanh, kích thưc li ln và rắn. Nhưng khi bổ sung 0,5 mg/l α−ΝΑΑ thì tỷ lệ mẫu tạo callus thấp, hình thái callus không được tốt có màu xanh, kích thước nhỏ, rắn. Khi tăng nồng độ BAP lên 1,5 mg/l thì cả 2 công thức (có bổ sung α − ΝΑΑ và không bổ sung α - NAA) có tỷ lệ mẫu tạo callus giảm xuống. Ở công thức CT6 là 81,8% và công thức CT7 có bổ sung 0,5 mg/l α − ΝΑΑ có 22,73%, hình thái kém hơn, callus thường có màu vàng nâu và nhanh chóng chuyển sang màu nâu đen. Trong 7 công thức thí nghiệm thì CT4 (1,0 mg/l BAP, không bổ sung NAA) là thích hợp nhất để tạo callus từ lá bánh tẻ cây hoa Violet Châu Phi. 3. ghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi từ callus Các callus tạo thành được chuyển sang các môi trường có nồng độ BAP khác nhau để nghiên cứu khả năng tái sinh chồi. Sau 4 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả thể hiện bảng 3. Bảng 3. Ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi từ callus Công thức Tỷ lệ tái sinh (%) Số chồi tái sinh trung bình (chồi/mẫu) CT1 73,33 7,73 CT2 93,33 10,5 CT3 66,67 7,1 CT4 46,67 4,43 CV(%) 1.6 LSD 0,05 0.2 Ghi chú: CT1: B sung 0,1 mg/l BAP; CT2: B sung 0,3 mg/l BAP; CT3: B sung 0,5 mg/l BAP; CT4: B sung 0,7 mg/l BAP. Qua bng 3 cho thy:  CT1 có nng  0,1 mg/l BAP cho t l callus tái sinh chi 73,33%, s chi tái sinh trung bình t 7,73 chi/mu, hình thái chi tt. Trong công thc CT2 có nng  0,3 mg/l BAP cho t l callus tái sinh t cao nht là 93,33%, s chi tái sinh trung bình cũng t cao nht là 10,5 chi/mu, hình thái chi tt. 3 công thc CT3, CT4 tip tc tăng dn nng  BAP thì t l tái sinh gim dn tương ng 66,67% và 46,67%. Nồng độ BAP càng tăng thì càng nhiều callus sùi to và rắn chắc và không phát triển thành chồi rõ ràng, nếu để lâu một số callus chuyển sang màu nâu đen, số lượng chồi/mẫu cũng giảm xuống tương ứng 7,1 và 4,43 chồi/mẫu. Như vậy, trong 4 công thức thí nghiệm tái sinh chồi từ callus thì công thức CT2 (bổ sung 0,3 mg/l BAP) có tỷ lệ callus tái sinh chồi là cao nhất (93,33%) và tỷ lệ chồi tái sinh đạt trung bình 10,5 chồi/mẫu cấy. Hình thái chồi xanh, tốt. 4. ghiên cứu môi trường ra rễ Violet Châu Phi Trong thí nghim ra r này chúng tôi s dng α− NAA để nghiên cứu sự ra rễ của chồi in vitro. Sau 4 tuần nuôi cấy, chúng tôi được kết quả ở bảng 4. Bảng 4. Ảnh hưởng của α− AA đến khả năng ra rễ của chồi Violet Công thức Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/cây (cái) Chiều dài trung bình của rễ (cm) Hình thái cây CT1 100 10,2 0,41 Cây cao, thân còi, lá hơi nhỏ, xanh nhạt, rễ yếu, nhỏ, màu trắng CT2 100 23,7 0,53 Cây thấp, thân hơi còi, lá to, xanh đậm, rễ không đều, nhỏ, màu trắng nâu CT3 100 27,2 0,63 Cây cao, thân mập, lá to màu xanh đậm, rễ đồng đều, to, màu nâu CT4 100 37,8 0,65 Cây cao, thân mập, lá to, xanh đậm, rễ đồng đều, to, màu trắng nâu CT5 100 19,25 0,45 Cây thấp, thân còi, lá nhỏ, xanh đậm, rễ không đồng đều, nhỏ yếu, màu trắng CV(%) LSD 0,05 2,5 1,3 1,7 0,07 Ghi chú: CT1: Bổ sung 0 mg/l NAA CT2: Bổ sung 0,1 mg/l NAA; CT3: Bổ sung 0,2 mg/l NAA; CT4: Bổ sung 0,3 mg/l NAA; CT5: Bổ sung 0,5 mg/l NAA. Qua bảng 4 cho thấy: 100% các chồi Violet Châu Phi đều ra rễ dù được cấy trong môi trường có bổ sung hay không bổ sung α−NAA, điều đó chứng tỏ trong các chồi, auxin nội sinh cũng đủ để kích thích quá trình tạo rễ của chồi. Tuy nhiên khi bổ sung α−NAA với các mức nồng độ thay đổi chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 0,3 mg/l thì số lượng rễ trung bình được tạo ra lớn nhất đạt 37,8 rễ/cây, so với đối chứng là 10,2 rễ/cây. Về độ dài và chất lượng rễ thì từ công thức đối chứng, khi không bổ sung α − ΝΑΑ đến khi bổ sung α − ΝΑΑ 0,1 mg/l - 0,3mg/l thì độ dài và chất lượng rễ tăng lên rõ rệt. Nhưng khi tăng nồng độ α − ΝΑΑ lên 0,5 mg/l thì độ dài và chất lượng rễ giảm. Tuy nhiên theo quan sát thí nghiệm chúng tôi nhận thấy ở các công thức có bổ sung α − ΝΑΑ thì các rễ đều có sức sống cao hơn so với các rễ ở công thức đối chứng. Như vậy, môi trường bổ sung 0,3 mg/l α − ΝΑΑ là thích hợp nhất cho việc ra rễ của chồi Violet Châu Phi. 5. ghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển, tỷ lệ sống của cây hoa Violet Châu Phi Đây là giai đoạn đưa cây con trong nuôi cấy từ môi trường nhân tạo ra ngoài môi trường tự nhiên, chính là chuyển cây sống từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái sống tự dưỡng và chịu nhiều tác động của các yếu tố môi trường tự nhiên biến động (thời tiết, đất đai ). Ở giai đoạn vườn ươm, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể khác nhau đến tỷ lệ sống của cây con. Các cây con được đưa ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar bám ở rễ và được ươm vào 4 loại giá thể. Sau 3 tuần theo dõi, kết quả theo dõi được trình bày ở bảng 5. Bảng 5. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây ngoài vườn ươm (sau 4 tuần) Công thức Tỷ lệ sống (%) Chiều cao cây TB (cm) Số lá/cây CT1 76,7 6,08 9,05 CT2 90 6,12 10,3 CT3 100 6,42 10,13 CT4 100 6,53 10,4 CT1: Cát; CT2: Dn; CT3: Tru hun; CT4: Xơ da. Qua bng 5 cho thy: Qua 4 tun u theo dõi có s bin ng v t l sng ca cây  các giá th,  giá th cát t t l thp nht 76,7%, trên giá th dn t l sng t 90%. Còn 2 loi giá th tru hun và xơ da t 100%. V ch tiêu chiu cao cây và s lá không có s sai khác áng k gia các CT. Cây trng trên giá th xơ da t chiu cao trung bình cao nht 6,53 cm. Sơ  qui trình nhân ging hoa Violet châu Phi T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 7 IV. KẾT LUẬN VÀ §Ò NGHN 1. Kết luận - Vật liệu ban đầu là nhng mNu lá bánh t cây hoa Violet Châu Phi (Saintpaulia), s dng loi hóa cht kh trùng là HgCl 2 0,1% vi thi gian kh trùng là 5 phút cho hiu qu kh trùng cao nht. - Môi trưng có thành phn dinh dưng khoáng cơ bn MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l than có b sung 1,0 mg/l BAP là thích hp nht  to callus t lá cây Violet Châu Phi (Saintpaulia) (T l mu to callus trên môi trưng này t 94,45%). - Môi trưng ti ưu cho tái sinh và nhân nhanh chi t callus là môi trưng cơ bn MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l than có b sung 0,3 mg/l BAP. - Các chi in vitro ra r thun li nht trên môi trưng MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l than có b sung 0,3 mg/l α − ΝΑΑ, trong môi trưng này 100% chi ra r, s r trung bình là 37,8 (r/chi) và chiu dài r trung bình 0,65 cm. - Giá th thích hp nht  thích nghi cây in vitro trong giai on vưn ươm là giá th xơ da vi t l sng 100%, chiu cao cây trung bình 3,53 cm và s lá/cây là 9,4 cái sau 1 tun u theo dõi. 2. Đề nghị Áp dng quy trình  sn xut cây con ging phc v sn xut TÀI LIU THAM KHO 1 Trần Văn Minh, 1996. Công nghệ sinh học thực vật. NXB. Nông nghiệp 2 guyễn Quang Thạch, guyễn Thị Lý Anh và cộng sự, 2007. Giáo trình sinh học nông nghiệp. NXB. Nông nghiệp. 3 Bhojwani S.S and Razdan M.K, 1983. Plant tissue culture, Theory and practice, Elsevirer science publishers, Amterdam 4 Pierik R.L.M., 1987. In vitro culture of higher plant. Martinus nijhoff publishers, Dordrech. The Netherlands. gười phản biện: Trần Duy Quý . NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA VIOLET CHÂU PHI (Saintpaulia) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Lê Đức Thảo 1 ,. Violet Châu Phi (Saintpaulia) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu và mẫu ban đầu